核酸提取 氯仿 异丙醇的作用
DNA提取和PCR扩增文档
ctab法dna提取液各种成分的作用是什么?1、裂解液要预热,以抑制DNase(脱氧核糖核酸酶),加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、酚一定要碱平衡。
苯酚具有高度腐蚀性,飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤,因此应注意防护。
氯仿易燃、易爆、易挥发,具有神经毒作用,操作时应注意防护。
3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。
4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
提取DNA配方CTAB为十六烷基三甲基溴化铵,CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。
CTAB 4gNaCl 16.364 g1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇(400ul)氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml 氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
实验目的从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA,为southern杂交或DNA文库的构建做好准备。
我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度,去除Dnase、机械剪切(对于如此之大的基因组,防止机械剪切是很重要的)、物理、化学因素的影响。
实验原理及过程12345678。
原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是:它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
酚氯仿异丙醇抽提核酸的一些问题
酚:氯仿:异丙醇抽提核酸的一些问题2014-01-4 23:191.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别:异丙醇和酒精都是有机溶剂,一般来讲,提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀,因为异丙醇沉淀的效果要好一些,但最后大多用酒精沉淀,因为酒精容易挥发,对下游的实验影响小。
异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子。
有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在溶液中,从而可达到去多糖的作用。
但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA;但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置。
缺点:易使盐类(如NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂,对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处,不影响以后的实验。
在适当的盐浓度下,2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀DNA,对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。
需在-20放置很长时间,30分钟-1小时。
同样需要70%乙醇洗涤。
2.一般用的是酚:氯仿:异丙醇为25:24:1(v/v),其中酚是强烈的蛋白质变性剂,能有效使蛋白质变性而除去,氯仿有强烈的脂溶性,去除脂类杂质,3.本身酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的主要作用是抽提蛋白质步骤:质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次,重复此步骤,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀,零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min,沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于20~40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。
核酸沉淀常用的有机溶剂
核酸沉淀常用的有机溶剂
核酸沉淀常用的有机溶剂包括以下几种:
1. 乙醇:乙醇是最常用的核酸沉淀有机溶剂。
一般使用70%-100%浓度的乙醇进行沉淀。
乙醇可以沉淀核酸并去除杂质。
2. 异丙醇:异丙醇也是一种常用的核酸沉淀有机溶剂。
使用异丙醇进行核酸沉淀可以降低RNA的降解和DNA的纤维化。
3. 酚/氯仿:酚/氯仿混合溶液可以用于提取核酸,其中酚用于
分离DNA/RNA,氯仿用于除去蛋白质和其他杂质。
酚/氯仿
提取法适用于小样本量和很少的核酸空间。
4. 甲酰胺:甲酰胺是一种无毒的有机溶剂,可以用于沉淀核酸。
甲酰胺沉淀法适用于提取RNA,可以保持RNA的完整性和稳定性。
以上是一些常用的核酸沉淀有机溶剂,选择何种有机溶剂取决于具体的实验需求和条件。
核酸提取常见试剂的作用原理
核酸提取常见试剂的作⽤原理异硫氰酸胍强⽤⼒的蛋⽩质变性剂,能迅速溶解蛋⽩质,导致细胞结构破碎,核蛋⽩由于其⼆级结构的破坏消失⽽迅速与核酸分离。
胍盐是破坏蛋⽩质三维结构的离液剂,在通常使⽤的蛋⽩质变性剂中作⽤最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋⽩质转换成⼀随机的卷曲状态。
含有强⼒的阴离⼦和阳离⼦基团,它们可以形成较强的氢键。
在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,⽽去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏⽔作⽤。
盐酸胍、尿素盐酸胍是⼀个核酸酶的强抑制剂,它并不是⼀种⾜够强的变性剂,可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。
4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:1变性蛋⽩和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋⽩-变性剂复合物,当复合物被除去,从⽽引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋⽩不断转变为复合物,最终导致蛋⽩质完全变性;2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作⽤,能形成氢键,当浓度⾼时,能破坏⽔的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为⾮极性残基的较好溶剂,使蛋⽩质内部的疏⽔残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。
⾼浓度尿素使蛋⽩质变性并抑制Rnase活性⼗⼆烷基肌氨酸钠使蛋⽩质解体变性巯基试剂1防⽌蛋⽩质或酶等(如辅酶A)分⼦中SH基团氧化成⼆硫键,2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。
DTT,DDTE、巯基⼄醇应⽤最⼴,⾕胱⽢肽也常应⽤,由于他是⽣物体内的还原剂,同时氧化后能被⾕胱⽢肽还原酶原位释放。
DNA提取中,常使⽤巯基⼄醇,维持缓冲液的还原环境,防⽌多酚类氧化,由于具有⼀定的毒性,浓度不应⾼于2%。
巯基⼄醇β-巯基⼄醇的主要作⽤是破坏RNase蛋⽩质中的⼆硫键(肽和蛋⽩质分⼦中的半胱氨酸残基中的键)。
1 还原蛋⽩质⼆硫键,使Rna酶变性2 抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰⿊⾊,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸⼆酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋⽩质的巯基蛋⽩质提取中需要巯基⼄醇还原⼆硫键,使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏⽔键、盐键、氢键、范德华⼒使蛋⽩质变性但不影响肽键和⼆硫键,不能使蛋⽩质彻底变性加上还原剂巯基⼄醇或DTT,能还原⼆硫键,使RNA彻底变性DTT⼆硫苏糖醇刺激性⽓味要⼩很多,毒性也⽐巯基⼄醇低很多。
核酸提取常见试剂地作用原理
核酸提取常见试剂地作用原理核酸提取是分子生物学研究中的基础步骤之一,常用于从细胞或组织中提取和纯化核酸。
核酸提取试剂包括细胞裂解缓冲液、蛋白酶、盐溶液、有机溶剂等。
核酸提取试剂的作用原理主要涉及以下几个方面:1.细胞裂解缓冲液:细胞裂解缓冲液是为了打破细胞膜和核膜,使细胞内的核酸暴露出来。
细胞裂解缓冲液一般含有一些离子和试剂,如EDTA、SDS等。
EDTA可以螯合离子,使核酸不被酶降解。
SDS则可以破坏细胞膜和核膜的完整性,使核酸释放出来。
2. 蛋白酶:蛋白酶的作用是降解核酸分子上的蛋白质,使核酸与蛋白质分离。
在核酸提取的过程中,蛋白酶可以去除核酸表面的蛋白质,从而提高核酸的纯度。
常用的蛋白酶有蛋白酶K和蛋白酶ase。
3.盐溶液:盐溶液的作用是使DNA在溶液中凝集并沉淀。
盐的高浓度可以中和DNA的负电荷,使DNA之间的静电斥力减弱,从而导致DNA分子的凝集和沉淀。
4.有机溶剂:有机溶剂在核酸提取中起到萃取作用,使DNA从细胞裂解液中分离出来。
有机溶剂常用的有酚类、氯仿和异丙醇。
酚类溶剂可以破坏细胞和核膜的完整性,同时与DNA形成无水醇相互作用,促使DNA分离出来。
氯仿可以和DNA结合,并与水进行分配,从而加速DNA的沉淀。
异丙醇则可改变溶液的表面张力,使DNA分子凝胶化和沉淀。
5.离心:离心是核酸提取中的一个重要步骤。
通过离心,可以将细胞碎片、蛋白质、碎屑等杂质与纯净的核酸分离开来。
离心的原理是通过旋转离心机,利用离心力将混合液中的成分分离开来,使沉淀物和上清液分离。
总的来说,核酸提取试剂是通过改变细胞的环境和物理化学性质来实现核酸的分离纯化。
通过使用细胞裂解缓冲液打破细胞膜和核膜,加入蛋白酶降解蛋白质,使用盐溶液凝集和沉淀DNA,加入有机溶剂进行DNA的萃取,最后通过离心分离杂质和DNA。
这些步骤综合起来,能够从复杂的样品中纯化出相对纯净的核酸。
核酸提取氯仿异丙醇的作用
核酸提取氯仿异丙醇的作
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用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?
使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
使用酚的优点:1. 有效变性蛋白质;2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点:1. 能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。
2. 不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用?
氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。
(酚易溶于氯仿中)
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?
异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。
另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?
用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或 NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。
氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。
DNA提取方法和试剂作用详解
1试剂的作用氯仿的作用?氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。
(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。
另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。
2 DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁,首先要破碎经胞。
方法有三种;①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法:用SDS处理细胞;③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞壁破碎。
利用研磨或者超声破碎细胞,并通过加入去污剂以除掉膜脂。
加入蛋白酶,醋酸盐沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA 结合的组蛋白。
将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,因为DNA在醇中不可溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。
另外,目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。
DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
核酸提取常见试剂的作用原理
核酸提取常见试剂的作用原理1. 高盐法高盐法是一种常用的核酸提取方法,其作用原理主要是利用高盐浓度使细胞破裂,并通过沉淀去除蛋白质。
在高盐浓度环境下,细胞膜失去正常结构,细胞破裂释放出胞内的核酸。
此时,核酸与蛋白质结合的盐桥被破坏,蛋白质被沉淀,而核酸则在上清液中。
通过离心去除细胞碎片和沉淀蛋白质后,可以得到相对纯净的核酸。
2. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种经典的核酸提取方法,其作用原理是利用酚和氯仿的不同相溶性分离核酸和蛋白质。
在酚/氯仿混合液中,酚与核酸结合形成酚酸盐,而蛋白质则溶于氯仿相中。
通过离心分离上清液和有机相后,可以得到纯净的核酸。
3. 硅胶柱法硅胶柱法是一种基于硅胶柱的核酸提取方法,其作用原理是利用硅胶柱的吸附作用纯化核酸。
在硅胶柱中,核酸可以与硅胶表面发生静电吸附,而蛋白质和其他杂质则被洗脱。
通过洗脱步骤,可以得到高纯度的核酸。
4. 磁珠法磁珠法是一种利用磁性珠子进行核酸提取的方法,其作用原理是通过磁性珠子的磁性吸附作用纯化核酸。
磁性珠子表面常涂有特定的化学物质,使其具有亲核酸的性质。
在特定条件下,核酸与磁性珠子表面的化学物质结合,而其他杂质则被洗脱。
通过磁力分离,可以得到高纯度的核酸。
以上介绍了几种常见的核酸提取试剂及其作用原理。
这些方法各有优缺点,适用于不同的实验需求。
在选择核酸提取试剂时,需要考虑样品特性、纯度要求、操作简便性等因素。
同时,为了确保提取到高质量的核酸样品,操作过程中需要严格控制各个步骤的条件,避免污染和损失。
通过合理选择和正确操作核酸提取试剂,可以获得高质量的核酸样品,为后续的分子生物学实验提供可靠的基础。
trizol裂解液成分
trizol裂解液成分
Trizol裂解液是一种广泛应用于生物实验的试剂,主要用于提取total RNA 和DNA。
它的使用方法简单,提取效果显著,被广大科研工作者所青睐。
那么,Trizol裂解液的成分是什么?它又是如何发挥作用的?下面我们将详细介绍Trizol裂解液的成分及其在实验中的应用。
Trizol裂解液的主要成分包括:异丙醇、氯仿、柠檬酸钠、糖类、酚类等。
这些成分在裂解液中各自发挥着特定的作用。
异丙醇和氯仿主要用于破碎细胞膜和细胞器,释放细胞内的核酸;柠檬酸钠和糖类则可以稳定核酸,防止其降解;酚类化合物具有抗氧化作用,可以保护实验过程中核酸的完整性。
Trizol裂解液在生物实验中的应用非常广泛。
无论是对植物组织、动物组织,还是微生物组织,都可以取得良好的提取效果。
在使用Trizol裂解液时,要注意以下几点:
1.实验操作过程中,要严格遵守试剂说明书,确保实验结果的准确性。
2.由于Trizol裂解液具有较强的裂解能力,操作时要尽量避免接触到眼睛和皮肤,以免对人体造成伤害。
3.在提取RNA时,最后一个步骤是加入70%的乙醇进行洗涤,以去除残留的DNA。
这一步非常重要,否则可能会影响RNA的纯度。
4.实验废弃物要妥善处理,遵守实验室废弃物处理规定,以防对环境造成污染。
总之,Trizol裂解液作为一种优秀的生物实验试剂,凭借其高效的提取能力和简单的操作方法,赢得了科研工作者的信赖。
了解其成分和应用注意事
项,能够帮助我们更好地利用Trizol裂解液,提高实验效率和成果。
RNA提取过程中试剂的作用
提取RNA中所用各种试剂的作用:
1、氯仿:
氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。
DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA进入水相。
但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离,否则DNA会释放到水相。
不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得DNA 的亲水基团,与水相接触。
所以不要剧烈震荡。
氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性;二是RNA提取试剂中通常含有苯酚(Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚),苯酚微溶于水,抽提完之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉;三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质(比如油脂、脂溶性色素等),起到一定除杂作用
通常氯仿里面会加少量异戊醇(1/25),减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作。
2、
异丙醇:异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受
到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾
异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样。
只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍体积。
在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。
不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来的时候。
3、酸酚:沉淀蛋白的同时,酸性也有助于去除
DNA。
rna提取方法
rna提取方法RNA提取方法。
RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤,它能够从细胞或组织中提取出RNA,为后续的实验分析和研究奠定基础。
本文将介绍几种常用的RNA提取方法,希望能够为实验工作者提供一些参考和帮助。
1. Trizol法。
Trizol法是一种常用的RNA提取方法,它利用Trizol试剂将细胞或组织中的RNA溶解,然后通过酚-氯仿提取的方式分离RNA。
该方法操作简单,提取效果好,适用于各种类型的样品。
但需要注意的是,在操作过程中要避免RNA的降解,尽量减少搅拌和离心的时间,以保证提取的RNA质量。
2. 氯仿-异丙醇法。
氯仿-异丙醇法是另一种常用的RNA提取方法,它通过氯仿和异丙醇的相分离作用,将RNA从其他细胞成分中提取出来。
该方法提取的RNA纯度高,适用于大规模的样品处理。
但需要注意的是,在操作过程中要避免氯仿的挥发和异丙醇的残留,以免对后续实验造成影响。
3. 磁珠法。
磁珠法是近年来发展起来的一种RNA提取方法,它利用表面修饰的磁珠与RNA特异性结合,通过磁场的作用将RNA分离出来。
该方法操作简便,提取效果稳定,适用于高通量的样品处理。
但需要注意的是,在操作过程中要避免磁珠的污染和RNA的降解,以保证提取的RNA质量。
4. 硅胶柱法。
硅胶柱法是一种经典的RNA提取方法,它利用硅胶柱的吸附作用将RNA从细胞或组织中提取出来。
该方法提取的RNA质量好,适用于对RNA纯度要求较高的实验。
但需要注意的是,在操作过程中要避免硅胶柱的交叉污染和RNA的降解,以保证提取的RNA质量。
总结。
以上介绍了几种常用的RNA提取方法,每种方法都有其特点和适用范围。
在选择合适的RNA提取方法时,需要根据样品的特性和实验的要求进行综合考虑。
同时,在操作过程中要严格控制各项操作条件,以保证提取的RNA质量。
希望本文能够对实验工作者有所帮助,谢谢阅读!。
核酸提取常见试剂的作用原理
核酸提取常见试剂的作用原理异硫氰酸胍强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。
含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键。
在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如SDS存在的情况下,可以破坏疏水作用。
盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。
4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。
高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性1防止蛋白质或酶等(如辅酶A)分子中SH基团氧化成二硫键,2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。
DTT,DDTE、巯基乙醇应用最广,谷胱甘肽也常应用,由于他是生物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。
DNA提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于2%。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键(肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键)。
1 还原蛋白质二硫键,使Rna酶变性2 抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要巯基乙醇还原二硫键,使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键,不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或DTT,能还原二硫键,使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多。
核酸纯化的基本原理
核酸纯化的基本原理导言核酸纯化是分子生物学和生物化学实验中常见的一个步骤。
通过纯化核酸样品,可以去除杂质和其他分子,从而得到高纯度的核酸。
本文将深入探讨核酸纯化的基本原理,包括纯化方法、常用纯化试剂和步骤。
核酸纯化方法核酸纯化方法主要可以分为两大类:固相法和溶液相法。
固相法1. 硅胶柱层析硅胶柱层析法是最常见的核酸纯化方法之一。
其基本原理是利用硅胶对核酸具有选择性吸附的特性,将核酸样品与硅胶柱共同处理,以实现去除杂质、富集核酸的目的。
步骤如下:1.制备硅胶柱:将硅胶填充到柱子中,并经过紫外灭菌处理。
2.样品处理:将待纯化的核酸样品与缓冲液混合,加入硅胶柱中。
3.洗脱:通过加入洗脱缓冲液使核酸从硅胶柱中洗脱出来。
硅胶柱层析法适用于小规模实验室中对核酸的纯化,能够得到较高的纯度,但对核酸的损失较大。
2. 磁珠法磁珠法是一种基于磁珠颗粒表面的亲和性分离纯化核酸的方法。
通过表面修饰磁珠上的配体,可选择性地吸附纯化目标核酸。
步骤如下:1.磁珠上的配体修饰:将磁珠与特异性亲和核酸配体进行偶联。
2.样品处理:将待纯化的核酸样品与磁珠混合,使核酸与磁珠上的配体结合。
3.磁珠分离:利用磁力将磁珠与非特异性成分分离。
4.洗脱:通过改变离子浓度或pH值等方式,使核酸从磁珠上洗脱下来。
磁珠法具有操作简便、灵敏度高、纯度好等优点,适用于大规模的核酸纯化。
溶液相法溶液相法又称沉淀法,通过加入适当的物质使核酸在溶液中沉淀,然后通过离心去除杂质,得到纯化后的核酸。
1. 乙醇沉淀乙醇沉淀是最常见的溶液相法之一。
其原理是通过加入乙醇来沉淀核酸,然后通过离心将核酸精确地分离出来。
步骤如下:1.样品处理:将待纯化的核酸样品与适量的乙醇混合。
2.沉淀:将混合物离心,使核酸沉淀到离心管底部。
3.去除上清:将上清倒掉,保留沉淀。
4.洗涤:加入乙醇洗涤沉淀,去除杂质。
5.干燥:将离心管在恒温下干燥,使核酸得到最终纯化。
乙醇沉淀法简单易行,适用于小规模分子生物学实验室中的核酸纯化。
异丙醇作用
异丙醇作用异丙醇,也叫做异丙酒或异丙醇醇,是一种无色透明的液体,具有醇的特点,广泛应用于化学工业、制药工业和日常生活中。
下面将会介绍异丙醇的作用。
首先,异丙醇在化学试剂中具有很多重要的用途。
它可以用作某些化合物的溶剂,例如用于溶解无机盐、天然香料和氨、甲醛等有机物。
异丙醇还可以用作氯仿和丙酮的合成原料,这两种化合物在制药工业中用作溶剂和中间体。
此外,异丙醇还可用作甲醇和丙酮制取环氧丙烷的原料,用于制造塑料、树脂和涂料等。
其次,异丙醇在医药领域中也起着重要的作用。
它可以作为外用药物的溶剂,如在制造抗真菌剂、抗生素和消毒液中使用。
此外,异丙醇还可用于制造某些药物的中间体,如合成维生素B2、维生素B6和维生素E等。
同时,异丙醇也用于制造某些儿童药品,如镇静剂和缓释药等。
此外,异丙醇还可用作汽车燃料的添加剂。
由于汽油中含有一定的酒精成分,汽油与异丙醇混合使用可以提高汽油的辛烷值和燃烧效果,增加发动机的功率和燃烧效率,同时减少尾气排放,对环境友好。
因此,很多国家在汽油中添加一定比例的异丙醇,以提高汽油的性能。
除了以上的应用,异丙醇还可以用于冰淇淋和其他食品中的香料溶解剂,用于口腔漱口水和牙膏中作为激发剂,用于化妆品中的溶剂,以及作为电子产品和化妆品的清洗剂等。
虽然异丙醇具有许多重要的用途,但它也有一些潜在的危险性。
由于异丙醇对人体有毒,如果误服或吸入过多的异丙醇,可能会导致中毒。
因此,在使用异丙醇时,必须注意使用安全和正确的方法,避免发生意外。
总结起来,异丙醇是一种具有广泛应用的化合物。
它在化学工业、制药工业和日常生活中都起着重要的作用。
然而,在使用异丙醇时也需要注意安全问题,以免对人体造成危害。
RNA提取中各种试剂的作用
氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA 时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离.RNA提取过程,有机相中主要是酚和蛋白连系,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相.之袁州冬雪创作氯仿的作用有多个方面,加入氯仿,虽然有变性蛋白质的作用,但是其主要用处是用来分相,实际上是加速有机相和水相的分层.一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液,提高温度,放置一段时间,自然也会分相.离心后混合物分成三层:下层苯酚氯仿层,中间层,上层无色的水样层.RNA无一破例地存在于水样层当中.水样层的容量大约为400ul.【尺度:1mlTrizol加200ul的氯仿,水样层的容量大约为所加Trizol容量的60% 】上层水相,PH 5.1左右,当溶液pH在酸性的时候,RNA 分子就会沉淀在酚与溶液的界面,只有RNA分子留在水相.而当pH接近中性时,RNA就会溶解在水相,(导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例分歧错误,应该尽可以包管提取量的前提下使trizol过量)Trizol法提RNA,加氯仿就是要激烈震荡才行,这样才干完全地两相混匀.异丙醇的作用是通过OH的疏水作用使得RNA链中的亲水基团受到呵护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不抵触.通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA, RNA沉淀在离心前通常不成见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底.异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样.只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀.不过感觉效果不如乙醇,偶然会有沉淀不出来东西的时候.【400ul的水相对应500ul的的异丙醇.】醇沉淀是很经常常使用的方法,因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇,所以可以用来沉淀.乙醇沉淀的主要目标是沉淀+除盐.TRIzol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,呵护RNA的完整性 .加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层.RNA存在于水样层中.收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原.无论是人、动物、植物还是细菌组织,TRIzol法对少量的组织(50100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果.TRIZOL试剂操纵上的简单性允许同时处理多个的样品.所有的操纵可以在一小时内完成.TRIZOL抽提的总RNA可以防止DNA和蛋白的污染.故而可以作RNA 印迹分析、黑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶呵护分析和分子克隆.提取时需要注意一些问题:提取时要做到超净台内操纵、操纵带一次性手套、EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1%DEPC浸泡过夜后,高压蒸气灭菌)、小心、细致、晃动及每次移液要轻.这样做的唯一目标就是两个,一是小心RNAse的污染降解RNA;二是动作过度暴力破坏RNA的完整性.别的你提的RNA做电泳的问题,一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳,但是一般的琼脂糖电泳也可以,需要上样量稍微大些,而且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解),跑完电泳立即观察,这样也可以,但是如果样品中的RNA量很低或者说不是很高的话是检测不到的.因为这些试剂都会影响后续实验,所以用酒精洗一到两遍.一是酒精可以溶解一些沉淀中可以的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性在这里的到运用,最后的乙醇主要是洗涤异丙醇,也可以溶解一部分蛋白,痕量的乙醇很容易挥发掉.。
核酸提取 氯仿 异丙醇的作用
精心整理
用酚抽提细胞DNA 时,有什么作用?
使蛋白质变性,同时抑制了DNase 的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相,而DNA 溶于水相。
使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2.抑制了DNase 的降解作用。
缺点:1.能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly (A )RNA 。
2.不能完全抑制RNase 的活性。
氯仿的作用?
氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。
(酚易溶于氯仿中)
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?
异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。
另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA 时,为什么加入单价的阳离子?
用乙醇沉淀DNA 时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或NaAc ,Na +中和DNA 分子上的负电荷,减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。
氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法提取RNA实验步骤及原理实验原理:Trizol法是一种常用的RNA提取方法,其原理是利用三种有机物(TRIzol、氯仿和异丙醇)的混合物,使细胞或组织中的RNA在低温下与TRIzol发生相互作用,形成RNA-TRIzol复合物。
加入氯仿后,RNA-TRIzol复合物会转移到有机相中,而DNA和蛋白质则留在水相中。
通过离心分离有机相和水相,可将RNA从有机相中分离出来。
最后,加入丙醇沉淀RNA,即可得到纯度较高的RNA。
实验步骤:1. 细胞或组织样品的收集:将细胞或组织样品收集到离心管中。
2. 加入Trizol试剂:向离心管中加入适量的Trizol试剂,按比例加入的量为1mL Trizol/100mg组织或1×10^7个细胞。
3. 细胞或组织样品的破碎:使用超声波或均质器等方法将细胞或组织样品破碎。
4. 加入氯仿:向离心管中加入适量的氯仿,按比例加入的量为0.2mL氯仿/1mL Trizol。
5. 混合离心:将离心管中的混合物混合均匀后,离心分离有机相和水相。
6. 收集RNA:将有机相转移到新的离心管中,加入适量的异丙醇,沉淀RNA。
7. 洗涤RNA:用75%乙酸酒精洗涤RNA。
8. 溶解RNA:用RNase-free水或DEPC水溶解RNA。
9. 检测RNA:使用比色法或琼脂糖凝胶电泳等方法检测RNA的纯度和浓度。
注意事项:1. Trizol试剂应保存在4℃下,避免阳光直射和冰冻。
2. 操作过程中要注意RNA的保护,避免RNA的降解。
3. 操作过程中要使用无菌技术,避免污染。
4. 操作过程中要注意个人防护,避免接触到有害物质。
5. 实验前要准备好所有所需试剂和设备,确保实验顺利进行。
6. 实验后要及时清洗和消毒实验器材,避免交叉污染。
酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用
酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用1.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别:异丙醇和酒精都是有机溶剂,一般来讲,提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀,因为异丙醇沉淀的效果要好一些,但最后大多用酒精沉淀,因为酒精容易挥发,对下游的实验影响小。
异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子。
有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。
但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
异丙醇:优点为所需容积小且速度快,适用于浓度低,而体积大DNA样品的沉淀。
0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA 和mRNA;但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置。
缺点:易使盐类(如NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
乙醇:沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂,对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处,不影响以后的实验。
在适当的盐浓度下,2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀DNA,对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。
需在-20放置很长时间,30分钟-1小时。
同样需要70%乙醇洗涤。
2.一般用的是酚:氯仿:异丙醇为25:24:1(v/v),其中酚是强烈的蛋白质变性剂,能有效使蛋白质变性而除去,氯仿有强烈的脂溶性,去除脂类杂质,本身酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的主要作用是抽提蛋白质步骤:质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次,重复此步骤,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀,零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min,沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于20~40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。
酚:氯仿:异丙醇抽提核酸的一些问题
酚:氯仿:异丙醇抽提核酸的一些问题2014-01-4 23:191.异丙醇和乙醇沉淀质粒的区别:异丙醇和酒精都是有机溶剂,一般来讲,提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀,因为异丙醇沉淀的效果要好一些,但最后大多用酒精沉淀,因为酒精容易挥发,对下游的实验影响小。
异丙醇比较疏水,能很更好地沉淀核酸,用乙醇的目的是去盐,它比异丙醇更亲水,所以能去掉一些盐离子。
有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。
在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2倍体积乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在溶液中,从而可达到去多糖的作用。
但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA;但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置。
缺点:易使盐类(如NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
DNA乙醇是首选的有机溶剂,对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处,不影响以后的实验。
在适当的盐浓度下,2倍样品容积的95%乙醇可有效沉淀DNA,对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍缺点是总体积较大。
需在-20放置很长时间,30分钟-1小时。
同样需要70%乙醇洗涤。
2.一般用的是酚:氯仿:异丙醇为25:24:1(v/v),其中酚是强烈的蛋白质变性剂,能有效使蛋白质变性而除去,氯仿有强烈的脂溶性,去除脂类杂质,3.本身酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的主要作用是抽提蛋白质步骤:质粒用等体积的酚/氯仿/异丙醇抽提一次,重复此步骤,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀,零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min,沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于20~40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中。
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用酚抽提细胞DNA时,有什么作用?
使蛋白质变性,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
使用酚的优点:1. 有效变性蛋白质;2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点:1. 能溶解10-15%的水,从而溶解一部分poly(A)RNA。
2. 不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用?
氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。
(酚易溶于氯仿中)
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?
异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生。
另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时,为什么加入单价的阳离子?
用乙醇沉淀DNA时,通常要在溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 或NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,而易于聚集沉淀。
氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。