siRNA说明书
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
锐博siRNA产品说明书
siRNA使用说明（2009-08）名称：常规化学合成siRNA。
产品简介：常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。
产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。
保存和使用：保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上；冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。
开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。
例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。
注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。
（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。
使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理；特别提示：荧光标记siRNA要求避光。
使用方法：1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。
（siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。
2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）：(1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明一、简介siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。
本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。
二、实验准备1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。
2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。
3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。
三、细胞培养1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。
2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。
3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。
四、siRNA转染1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。
2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。
3、转染操作步骤：a：将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。
b：将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。
c：将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。
d：收集转染后的上清液，进行进一步的实验。
五、转染效果验证1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。
2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。
3、免疫荧光染色：利用免疫荧光染色技术观察目标蛋白在细胞中的表达情况。
jetPRIME 转染siRNA说明书
JetPRIME 转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染，
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
●在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200μL的JetPRIME 缓冲液，然后加入20μM(1.1μL)
的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●加入4μL的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●室温孵育10min;
●将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
●必要时，转染后4h更换细胞培养基；
●孵育24-48h，检测转染效率。
不同规格培养皿的使用量
注：
siRNA enhancer的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA enhancer,其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。
荧光siRNA产品使用说明
荧光siRNA产品使用说明RN：R11077.1 产品简介荧光标记的siRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法。
荧光标记的siRNA转染细胞后，可以直接使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。
荧光标记的siRNA还可用作追踪siRNA在胞内的定位及分布的情况。
运输保存产品以冻干粉的形式储存于棕色管中，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装避光保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考注：所有过程请注意避光！使用方法使用前须知1）我们提供三种荧光基团标记的siRNA，进行实验前请先了解检测仪器的配置和参数，选择合适的荧光标记。
表2 锐博生物荧光标记siRNA可选荧光2）请先熟悉转染操作，以快速准确的完成荧光标记siRNA的转染。
3）储存、使用过程中及检测过程中请注意避光。
4）检测前请先熟悉检测仪器的操作，若使用荧光显微镜或激光共聚焦检测，检测时不宜同一位置曝光时间过长，应对好焦后马上拍照，防止曝光时间过长而荧光淬灭。
1，转染具体操作请参考使用的转染试剂说明，最好设置合适的转染试剂浓度及荧光标记siRNA浓度梯度，综合考虑转染率及转染试剂副作用，以选择合适的浓度进行RNAi实验。
以下为以riboFectTM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例：a. 稀释siRNA：用50μl 1X riboFectTM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵育5min。
b. 混合液制备：加入5μl riboFectTM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。
c. 将riboFectTM CP混合液加入到443.75μl细胞培养基（v4）中，轻轻混匀。
SiRNA 使用说明
因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)，请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液(试剂的用量和体积，请参照“转染 siRNA 用量参考”)： a. 稀释转染试剂 lipo2000：使用前，将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I
E-mail: support@
1
Tel: 020-32290221
实验指导
96-well 24-well 12-well 6-well
表 1 使用 lipofectamine2000(invitrogen)转染 siRNA 用量参考(siRNA 转染浓度为 10-100nM) V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000 混合液总体积
siRNA 使用说明
产品简介：
常规化学合成 siRNA 为 21-25nt 的双链小分子 RNA。即用型的 siRNA，已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的 ddH2O 或 RNase-free water 溶解并配制成 20µM 液体即可直接转染细胞。 产品剂型为冻干粉，产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
使用： 产品使用时，siRNA 最好冰上放置，使用完毕后，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无 RNA 酶环
siRNA产品使用说明
siRNA产品使用说明RN：R10043.5 产品简介常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O，配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考0.25 0.5 1 2 5 20溶解体积(μl) 12.5 25 50 100 250 1000 注：如需进行高通量筛选试验，可选择siRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以ribo FECT™ CP Reagent 转染 siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表2。
1）接种细胞a.贴壁细胞：以Hela细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到30~50%。
b.悬浮细胞：以THP1细胞为例，接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基（v1）的24孔板培养孔中。
jetPRIME转染siRNA说明书
JetPRIME转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染,
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200 ^L勺JetPRIME缓冲液，然后加入20卩M（1.1卩L）的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
加入4^L的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）;
室温孵育10mi n;
将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
必要时，转染后4h更换细胞培养基；
孵育24-48h，检测转染效率。
注：siRNA enhancer 的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA
en ha ncer其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明1.介绍siRNA（小干扰RNA）是一种能够特异性沉默靶基因表达的双链RNA分子。
本文档旨在提供关于siRNA的详细使用说明，包括实验前准备、实验步骤和数据分析等内容。
2.实验前准备2.1 选择siRNA：选择适合的siRNA靶向靶基因。
可以通过文献研究或生物信息学预测来确定siRNA的序列。
2.2 siRNA合成与纯化：合成和纯化siRNA应该由可靠的供应商进行。
确保合成的siRNA纯度高且无附加污染物。
2.3 细胞培养：选用适当的细胞系，并且按照常规细胞培养方法将其培养在适宜的培养基中。
3.实验步骤3.1 载体转染：将siRNA与特定的转染试剂混合，并按照转染试剂的说明书将其转染入细胞中。
注意控制组设置。
3.2 RNA干扰效率检测：根据靶基因的表达情况选择适当的方法检测siRNA的干扰效果，如定量PCR或Western blot等。
3.3 功能检测：根据实验需要，选择适当的功能检测方法，如细胞增殖、凋亡、迁移或侵袭等。
4.数据分析4.1 干扰效果分析：对实验结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并计算干扰效果的百分比。
4.2 功能检测结果分析：对功能检测结果进行统计学分析，比较siRNA处理组和对照组之间的差异，并进一步解释其生物学意义。
5.附件本文档涉及的附件包括实验记录表、数据分析表和相应的图表。
请在需要时参考附加的文件。
6.法律名词及注释6.1 siRNA：小干扰RNA，一种双链RNA分子，用于特异性沉默靶基因表达。
6.2 RNA干扰：通过siRNA分子的特异性结合和降解，抑制靶基因的转录和翻译过程。
6.3 转染：将外源DNA或RNA导入靶细胞以实现外源基因的表达或干扰基因的沉默。
6.4 培养基：一种用于细胞培养的含有营养物质和生长因子的液体或固体培养基质。
7.结束语感谢您阅读本siRNA使用说明，希望本文档能帮助您顺利进行siRNA实验。
siRNA 使用说明
Reduced Serum Medium)稀释，轻轻混和，室温孵育 5min； b. 稀释 siRNA：用 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释 siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后，与上述(b)稀释好的 siRNA 轻轻混和，室温培养 20min 以形成 siRNA-lipo2000
siRNA说明书
使用前须知为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1.转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2.转染步骤：以lipofectamine?2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。
注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2)对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：a.稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1.25μl20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。
注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。
另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。
siRNA转染 Protocol
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
siRNA 使用说明(两篇)
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
sirna转染试剂说明书
3
1
24-well
2
500
2 x 50
6
2
12-well
4
1000
2 x 100
12
4
6-well
10
2500
2 x 250
30
10
转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24 孔培养板，调整 siRNA 与 RFect 试剂的用量。
siRNA 用量在 0.6-30 pmol(final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFect 试剂用量在 1.0 - 3.0μl 之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验，
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
转染实验要点： 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡； 首次实验 siRNA 的用量可稍大（一般 10 nM） ，后续实验根据实验结果修改。
RFect Transfection Reagent Formats for Various Cell Culture Vessels
传真: 0519-83382790
◎转染细胞范围广，绝大多数贴壁细胞株都能获得比较理想的转染结果
储存条件：-20℃
应用 ◎siRNA 转染 ◎antisense RNA 转染 ◎200bp 内的小分子 DNA 转染
产品介绍
RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。RFect 可用来转染 siRNA、antisense RNA、microRNA 等 200bp 以内的小分子 RNA 和 DNA，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞 株、肿瘤细胞株等。目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很 大的细胞毒性，并且转染效果不好。RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。与其它品牌的小核酸 转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在 90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在 95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一 般不超过 70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过 75%。RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到 10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率 一般在 30%以上。血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。有关 RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了 国际专利，并通过 PCT 覆盖国际上多个国家和地区。
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明 (2)
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明产品介绍与其它转染试剂比较，siRNA-mate 转染效率高、细胞存活率高、毒性小。
可广泛用于瞬时和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。
转染试剂保存在4℃，有效期2 年。
重要提示1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以30 - 50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。
细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。
2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA 也是转染成功的关键。
在转染前需确定siRNA 的含量和纯度，实验过程中需要使用DEPC 处理过的耗材和试剂，注意避免RNase 污染。
3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA 形成复合体过程中不能添加血清，建议用OPTIMEM 或其他无血清培养基（如DMEM、RPMI-1640 等）稀释siRNA 和转染试剂，以达到复合物形成的最佳效果。
但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的转染效果。
4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA 建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate 转染试剂进行优化，以确定最佳的转染效率。
以24 孔板为例，每10pmol siRNA 可使用0.5 μl，1 μl，1.5 μl 和2 μl 转染试剂作为初步实验条件。
操作流程（24 孔板）以24孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度10 nM；若要在显微镜下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA 终浓度50 nM。
遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。
但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化。
A. 细胞铺板贴壁细胞数量：在转染实验之前的18 - 24 个小时，在每个孔的500 μl 生长培养基中加入1.5 - 3.5 × 104 个细胞（确保转染时细胞密度在30- 50%）。
siRNA产品使用说明
siRNA产品使用说明RN：R10043.3产品简介常规化学合成siRNA为21~25nt的双链小分子RNA，即用型。
运输保存产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前瞬时离心，用RNase-free HO或灭菌ddH2O配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（不超过5次）。
2表1 20μM储存液的配置参考注：如需进行高通量筛选试验，可选择siRNA Library。
使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法：为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性，一般建议：1）转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔；2）接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，且细胞均匀分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
锐博生物推荐的siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以ribo FECT TM CP Reagent 转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）接种细胞a. 贴壁细胞：转染前一天，接种1×105细胞至含有500μl完全培养基的24孔板培养孔中，使转染时的细胞密度能够达到50~80%。
注：1）不同细胞生长速度不同，接种细胞的数量需要依据经验而定；2）每孔接种的细胞数量尽量相同，使细胞均匀分布于培养基表面。
b. 悬浮细胞：接种1×105~5×105个细胞至含有500μl完全培养基的24孔板。
2）转染步骤对于每个转染样品，请按以下步骤准备：a. 稀释siRNA：用50μl 1X ribo FECT TM CP Buffer（v1）稀释1.25μl 20μM siRNA储存液（v2），轻轻混匀，室温孵b. 混合液制备：加入5μl ribo FECT TM CP Reagent（v3），轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min。
jetPRIME 转染siRNA说明书
JetPRIME 转染试剂转染siRNA简易说明书
第0天：细胞接种
第一天：转染
在有血清存在的情况下转染，
使用JetPRIME缓冲液
以6孔板为例
●在1.5mL或0.5mL的EP管中加入200μL的JetPRIME 缓冲液，然后加入20μM(1.1μL)
的siRNA，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●加入4μL的JetPRIME试剂，旋涡10s后离心（或者用移液器吹打5次混匀）；
●室温孵育10min;
●将转染复合物加入到要转染的含血清的培养基中；
●必要时，转染后4h更换细胞培养基；
●孵育24-48h，检测转染效率。
不同规格培养皿的使用量
注：
siRNA enhancer的应用：
在转染复合物加入到所需转染的细胞中后，加入培养基体积的1/1000体积的siRNA enhancer,其他步骤与以前一致；
在6h或4h更换培养基时，也需要加入相应体积的siRNA enhancer（培养基体积的1/1000）。
siRNA重悬协议说明书
PROTOCOLsiRNA resuspension protocol Note: This protocol is written for siRNA, but may also be applied to microRNA mimic and hairpin inhibitor resuspension.1.Briefly centrifuge tubes containing siRNA to ensure that the siRNApellet is collected at the bottom of the tube.2. Resuspend in RNase-free 1x siRNA Buffer (See note below) for thedesired final concentration using volumes listed in Table 1.a.For example: for 10 nmol of siRNA and a 20 µM stock concentration,add 500 µL 1x siRNA Buffer.3.Pipette the solution up and down 3-5 times, avoiding the introductionof bubbles and securely seal tubes (or multi-well plates).4. Place the solution on an orbital mixer/shaker for 30 minutes atroom temperature.5. Briefly centrifuge tubes containing siRNA to ensure that the solution iscollected at the bottom of the tube.6. Verify the concentration of siRNA using UV spectrophotometry at260 nm. For siRNA, 1 µM = 13.3 ng/µL. For microRNA mimic, 1 µM=14.1 ng/µL, and microRNA hairpin inhibitor, 1 µM=18.5 ng/µL see FAQs for additional information.7. RNA may be used immediately, or aliquoted into smaller volumes tolimit the number of freeze-thaw cycles. Resuspended siRNA should be stored at -20 °C in a manual defrost or non-cycling freezer. Storage at4 °C is suitable for up to 6 weeks.Notes•Synthetic RNAi reagents should be resuspended in RNase-free solutions.We recommend 1x siRNA Buffer (diluted from 5x siRNA Buffer,Cat #B-002000-UB-100). For short-term storage, RNase-free water(Cat # B-003000-WB-100) is also appropriate for resuspension ofconcentrated stocks.•Salts present in buffer are known to affect the absorbance reading of RNA. For the most precise readings, dissolve in 4 volumes of sterile RNase-free water for spectrophotometric analysis. Then adjustwith addition of 5x siRNA Buffer appropriately to desired finalconcentration of siRNA adjusting to 1x siRNA Buffer. Please see the FAQ section on page 2.•To dilute the 5x siRNA Buffer to 1x siRNA Buffer, mix four volumes of sterile RNase-free water with one volume of 5x siRNA Buffer. The composition of the 1x siRNA Buffer is 60 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7.5, and 0.2 mM MgCl2.•5x siRNA Buffer is not intended for in vivo applications, as it has not been optimized for physiological conditions. Instead, an appropriately buffered RNase-free solution should be used.Technical considerations•For efficient siGENOME™ siRNA, ON-TARGETplus™ siRNA, or miRIDIAN™microRNA Mimic and Hairpin Inhibitor delivery, we stronglyrecommend following the instructions provided by the manufacturer for the delivery method of choice (such as transfection reagent,or electroporation) and taking measures to test and optimize theconditions best suited for the cell line or culture selected. Reviewprotocols using DharmaFECT™ transfection reagents or Accell™ siRNA delivery.Table 1. Recommended siRNA resuspension volumes and concentrationssiRNA Amount(nmol)1x siRNA Buffer to be added (µL) fordesired final concentration100 µM Stock20 µM Stock1.010502.0201005.0502501010050020200100050500Exceeds tube volume 1001000This protocol is written for siRNA, but may also be applied to microRNA mimic and hairpin inhibitor resuspension.For detailed recommendations for resuspension of siRNA/ microRNA in plates, please see our siRNA Library Guidelines.If you have any questions, contactt +44 (0) 1223 976 000 (UK) or +1 800 235 9880 (USA); +1 303 604 9499 (USA)f + 44 (0)1223 655 581w /contact-us or /service-and-support Horizon Discovery, 8100 Cambridge Research Park, Waterbeach, Cambridge, CB25 9TL, United KingdomAll trademarks are the property of Horizon Discovery Company unless otherwise specified. ©2018 Horizon Discovery Group Company—All rights reserved. First published June 2014. UK Registered Head Office: Building 8100, Cambridge Research Park, Cambridge, CB25 9TL, United Kingdom.V 7 -0 4 1 8•Assays for mRNA level, protein level, or phenotypic change may be performed to assess silencing effects. Because RNAi is an mRNA-specific event, we highly recommend assaying for reduction at the mRNA level using reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Typical time points for detecting target knockdown with lipid-mediated siRNA or microRNA mimic delivery are 24-48 hours for mRNA and 48-96 hours for protein. Accell siRNA delivery is typically assessed at 72 hours or longer. Time course studies are recommended to identify optimal time points for assessing knockdown.Frequently asked questions (FAQs)How do I quantitate the resuspended siRNA?RNA is most accurately quantified by measuring its absorbance at 260 nm (A260) with a dual beam spectro-photometer.How do I calculate the concentration of the siRNA sample?Use Beer’s Law, A260 = (ε)(C)(L) where ε is the extinction coefficient (from the Product Transfer Form),C is the siRNA concentration, and L is the path length of the cuvette. Calculate the final concentration of the resuspended siRNA by solving for C and multiplying by the dilution factor.Why does the calculated amount of RNA in solution diff er from that on the Product Transfer Form?Salts present in 1x siRNA Buffer (or other resuspension solution) are known to cause a decrease in the absorbance reading of RNA.Differences in instrumentation for quantifying RNA may lead to differences in apparent values.Dual beam UV-VIS spectrophotometers are recommended.Sample is too concentrated. Absorbance values are most accurate between 0.15 and 0.6 andwithin the linear range of a standard curve.Sample is too diluted. Measurements with dilutions of small volumes (1-1.5 μL) are more susceptible to variation.Sample may not be fully resuspended. Heat samples to 95 ºC for 1-3 minutes and allow to coolfor 30-45 minutes to reanneal complementary strands.The siRNA has been at room temperature for a week. Will the siRNA still be okay?Yes. Samples are shipped as dried pellets and are stable at room temperature for 2-4 weeks. Upon receipt, we recommend that all samples should be stored at -20 °C or -70 °C to -80 °C.What is the average molecular weight of a siRNA, miRIDIAN™ Mimic , or miRIDIAN Hairpin Inhibitor?The average molecular weight (MW) of a siRNA is 13,300 g/mol. The average MW of a miRIDIAN mimic is 14,100 g/mol.The average MW of a miRIDIAN hairpin inhibitor is 18,500 g/molHow do I convert between nmol to µg of siRNA?Multiply the number of moles by the MW on the Product Transfer Form, or the average MW for your oligo. For example, 5 nmol of siRNA would be: (5 nmol)(13,300 g/mol)(mol/109 nmol)(106 µg/g) = 66.5 µgView additional Frequently Asked Questions (FAQs).。
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产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻
融（尽量不超过5次）。
表120 gM储存液的配置参考
使用前须知
为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。
细胞实验方法
为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：
a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；
b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：
siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时
间为24〜72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：
以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染
请参考表2。
1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞
密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。
注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：
a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;
b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;
c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。
注意：稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA
混合。
另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，
甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。
3）将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基（v2）的培养孔中，轻轻混匀；
4）（可选）培养4〜6h后，将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基；
5）（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）；
6）将培养板置于37'C的C02培养箱中培养24〜96h（培养时间与实验目的相关）。
表2使用Iipo2000（invitrogen）转染siRNA 产品用量参考
v1 : Opti-MEMI（无血清、无抗生素，转染专用）；v2 :完全或不完全培养基
96-well
100 卩l（25 卩l+25 卩l+50
卩l）100nM gl gl10~100ng 100 卩l（25 卩l+25 卩l+50
卩l）50nM A1g】10~100ng 100 卩l（25 卩l+25 卩l+50
卩l）30nM g1g】10~100ng 100 卩l（25 卩l+25 卩l+50
卩l）20nM gl gl10~100ng 100 卩l（25 卩l+25 卩l+50
卩l）10nM g1A
1
10~100ng 24-well
500 卩l（50 卩l+50 卩l+400
卩l）
100nM gl 1 gl100~200ng
*500 卩l（50 卩l+50 卩l+400
卩l）
50nM gl 1 gl100~200ng 500 卩l（50 卩l+50 卩l+400
卩l）30nM gl 1 gl100~200ng 500 卩l（50 卩l+50 卩l+400
卩l）20nM gl 1 gl100~200ng 500 卩l（50 卩l+50 卩l+400
卩l）10nM gl 1 gl100~200ng 12-well
1mL （100 卩l+100 卩l+800
卩l）100nM 5 gl 2 gl200~400ng 1mL（100 卩l+100 卩l+800 卩
l）50nM gl 2 gl200~400ng 1mL（100 卩l+100 卩l+800 卩
l）30nM g】 2 gl200~400ng 1mL（100 卩l+100 卩l+800 卩
l）20nM 1 gl 2 gl200~400ng 1mL（100 卩l+100 卩l+800 卩
l）10nM gl 2 gl200~400ng 2mL（250 g l+250 g l+1500 g l）50nM 5 gl 5 gl500~1000ng
2mL（250 g l+250 g l+1500 g l）30nM 3 gl 5 gl500~1000ng
2mL（250 g l+250 g l+1500 g l）20nM 2 gl 5 gl500~1000ng
2mL（250 g l+250 g l+1500 g l）10nM 1 gl 5 gl500~1000ng
2mL（250 卩l+250 卩1+1500
卩l）卩
卩
* :实验参考用量示例；：当实验涉及DNA共转时参考
3.效果检测:
转染完成后24~72小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等
相
关。
1）RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后24~72h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。
注：引物设计质量很重要;
2）蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要指标，其检测手段主要为Western-blot等。
检测时间受
细胞内蛋白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为48~96h，甚至更长时间之后多点采样;
3）功能筛选：应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等检测方法进行siRNA对细胞功能的直接筛选。