生物化学蛋白质1

+H N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO3 +H N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO3
Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽
L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu
短杆菌肽S(环十肽)
由于肽键的存在,肽可 以进行双缩脲反应。
（三）天然存在的活性肽 主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素。
OH CH3 CH CH2OH CH O HN C H HO CH N C O CH2 NH O C S CH O CH2 CH O N H NH O C CH2 NH OH C NH CH CH2 O C NH CH2 C
第4章蛋白质(protein) 的共价结构
—、蛋白质通论
(一)蛋白质的化学组成和分类

蛋白质的元素组成：C、H、O、 N、S,其中含N平均为16%，这一数 据可用于蛋白质的含量测定。
1.简单蛋白 完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。 根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7类：清 蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋 白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的 乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉 淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬 蛋白（只能溶于强酸）。 2.结合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。 根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类： 核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、 黄素蛋白和金属蛋白。
3.按蛋白质的生物学功能分类
（1）催化功能 生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内
的各种化学反应就无法正常进行。 （2）结构功能 蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋 白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4；细胞膜、线 粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的； 动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。 （3）运输功能 脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输 氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转 运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与 甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。
可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨
基酸序列测定 。 （4）氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，
它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。
根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸
种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动
力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。
2.C-末端的测定
（1）还原法。C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的
（1）二硝基氟苯(DNFB )法 (Sanger法):2,4-二硝基
氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成
二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色 DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基 酸可以用色谱法进行鉴定。
R O2N F NO2 DNFB H
+ + H2N
R H2N O HN R n -1O CH C HN Rn O OH CH C CH C
N- 端 氨 基 酸 H HN NH2NH2 2
+
C -端 氨 基 酸 O Rn O OH
R
CH C NHNH2 +H2N 氨基酸酰肼
CH C
C -端 氨 基 酸
（3）羧肽酶法:将蛋白质在pH 8.0, 30℃与 羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层 析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时 间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自 胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A 能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸 残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 通常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨 基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可 以用来测定氨基酸的排列顺序。
下列试剂和酶常用于蛋白质化学的研究中：CNBr、异硫氰酸 苯酯、丹黄酰氯、脲、6mol/L HCl、β-巯基乙醇、水合 茚三酮、过甲酸、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。其中哪一个 最适合完成以下各项任务？
（1）测定小肽的氨基酸序列。 （2）鉴定肽的氨基末端残基。 （3）不含二硫键的蛋白质的可逆变性；如有二硫键存在时 还需加什么试剂？ （4）在芳香族氨基酸残基羧基侧水解肽键。 （5）在蛋氨酸残基羧基侧水解肽键。
（7）调节功能 某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。 （8）感觉功能 生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如， 感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。 视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。 （9）遗传调控功能 遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在在染色体中 是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白， 与特定基因的表达有关。β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种 阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作 用才能表达。 （10）其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒 素可抑制真核生物的蛋白质合成。
(二)蛋白质的形状和大小
按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为： 纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。
蛋白质的相对分子质量差别很大。
（肌联蛋白）
(三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次
蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次： 1.一级结构：多肽链的氨基酸序列。
2.二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的
(七)肽段在多 肽链中次序的 决定肽段
(八)二硫桥位置的确定
用对角线电泳法

(九)蛋白质 测序举例 （胰岛素的 序列测定）
（十）蛋白质序列数据库
1.欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研 究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；
2.美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30
环状肽
共价主链
肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的 性质，相关的6个原子处于共平面，称作肽 平面，肽平面内两个Cα多处于反式构型。
（二） 肽的物理和化
学性质 肽的等电点计算 需先分别判断各解离 基团的带电荷情况， 再统计净电荷的量 （P166表4-6）。 肽的化学反应与
氨基酸类似，同时，
与肌红蛋白
2. 丝氨酸蛋白酶类:显示明显的序列同源性。
3. 一些功能差异很大的蛋白质:如溶菌酶 和α-乳清蛋白功能差异很大,但有序列 同源性。蛋白质家族的形成可能有趋同 进化和趋异进化两种机制。
基本要求
1.掌握蛋白质的分类和功能多样性； 2.掌握肽的结构特点和基本性质； 3.熟悉蛋白质一级结构的测定方法； 4.掌握蛋白质一级结构与生物学功能的 关系，熟悉有关的典型例子。
2.测定多肽链的数目。
3.拆分多肽链。 4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。
5.鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。
6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 7.测定各肽段的氨基酸序列。 8.拼接各肽段成完整的多肽链。 9.确定二硫键的位置。
(二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定
1.N-末端的测定
α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 （2）肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所
有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰
肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变 成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。
万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有 些未经严格检验。 3.美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有 大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质
序列的不少信息。
四、蛋白质的氨基酸 序列与生物功能
（一） 同源蛋白质的物种差异与生物进化
细 胞 色 素 C 的 物 种 差 异
（二）同源 蛋白质具有 共同的进化 起源 1.血红素蛋白
2.降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端
的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可 能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。
3.根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录
测定cDNA的核苷酸序列, 再用遗传密码推定氨基酸序 列。
4.质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经 电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎 片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽 的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸 和异亮氨酸。
可以用酶水解 法或化学水解 法将蛋白质水 解成肽段
肽段的分离纯化 可用层析法或电泳法
溴化氰断裂法
羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可 以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键.
(六)肽段氨基 酸序列的测定
1.Edman化学降解法: 用此原理已制成蛋白质序列分析 仪。若每次循环的准确度为99%， 经60次循环，准确度为： 0.9960=0.54
由细菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常 见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn）。
?1
Glutathione
谷胱甘肽
它的分子中有一个特殊的γ肽 键，是由谷氨酸的γ羧基与半 胱氨酸的α氨基缩合而成。
三、蛋白质一级 结构的测定
(一)蛋白质测序的策略
1.确定蛋白质的纯度在97%以上。
O O2N HN NO2 DNP 衍生物 O OH + 氨基酸
R
O
CH C
CH C
N- 端氨基酸 R HN NLeabharlann 2 DNP- 氨基酸H2O
O2N
CH C
（2）丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基