λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

第３８卷第２期２０１６年３月湖北大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｖｏｌ．３８㊀Ｎｏ．２㊀Ｍａｒ．，２０１６㊀收稿日期：２０１５１０２１基金项目：国家高技术研究发展计划（０１４ＡＡ０２１３０３⁃０４）资助作者简介：陈晚苹（１９８７⁃），女，助理实验师；马立新，通信作者，教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｍａｌｉｘｉｎｇ＠ｈｕｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ文章编号：１０００２３７５（２０１６）０２０１１６０４λ噬菌体切除酶基因Ｘｉｓ在大肠杆菌中的可溶性融合表达陈晚苹，周玉玲，马立新（工业生物技术湖北省重点实验室（湖北大学），湖北武汉４３００６２）摘要：λ噬菌体切除酶Ｘｉｓ（ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质．通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Ｘｉｓ在体外合成，然后克隆到带有类泛素蛋白ＳＵＭＯ标签的定向原核表达载体ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ上，测序正确后，然后转化至Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）细胞可溶性表达．经ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白．该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Ｘｉｓ不仅解除了Ｘｉｓ对Ｅ．ｃｏｌｉ宿主细胞的毒害作用，而且实现在Ｅ．ｃｏｌｉ中的高水平可溶性表达．因此，Ｘｉｓ的大量制备，将会促进Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术的广泛应用．关键词：λ噬菌体切除酶Ｘｉｓ；大肠杆菌；融合表达；鉴定中图分类号：Ｑ７８６㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００⁃２３７５．２０１６．０２．００６Ｓｏｌｕｂｌｅ⁃ｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆλｐｈａｇｅｅｘｃｉｓｉｏｎｅｎｚｙｍｅＸｉｓｇｅｎｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＣＨＥＮＷａｎｐｉｎｇ，ＺＨＯＵＹｕｌｉｎｇ，ＭＡＬｉｘｉｎ（ＨｕｂｅｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｘｃｉｓｉｏｎｅｎｚｙｍｅＸｉｓｆｒｏｍλｐｈａｇｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆＬｙｓｏｇｅｎｉｃｃｒａｃｋｉｎｇｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．ＴｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｃｏｄｉｎｇｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅＸｉｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｏｆＥ．ｃｏｌｉｃｏｄｏｎｕｓａｇｅａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｎｏｖｅｌｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧａｎｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｄｉｎｇＳＵＭＯｔａｇｗａｓｆｕｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅＯＲＦｏｆＸｉｓｇｅｎｅ．ＴｈｅｃｏｒｒｅｃｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．ＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＳＤＳ⁃ＰＡＧＥａｎｄＭａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＸｉｓｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．ＴｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｎｏｔｏｎｌｙｒｅｌｉｅｖｅｄｔｈｅｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｆｒｏｍＸｉｓｔｏＥ．ｃｏｌｉｈｏｓｔｃｅｌｌｓ，ｂｕｔａｌｓｏａｃｈｉｅｖｅｄｔｈｅｈｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆｓｏｌｕｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＸｉｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｓｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｍａｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｅｘｔｅｎｓｉｖｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＧａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｕｔｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅＸｉｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；ｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ０㊀引言Ｇａｔｅｗａｙ基因克隆是由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司在２０世纪９０年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项技术，它的原理是建立在λ噬菌体ＤＮＡ定点整合到细菌宿主基因组上［１］，在噬菌体和细菌的整合因子（ＩＨＦ（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｈｏｓｔｆａｃｔｏｒ）㊁Ｉｎｔ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ））的作用下，λ的ａｔｔＰ位点和大肠杆菌基因组的ａｔｔＢ位点可以发生定点重组［２］，λ噬菌体ＤＮＡ整合到大肠杆菌的基因组ＤＮＡ中．这是一个可逆的过程，在λ噬菌第２期陈晚苹，等：λ噬菌体切除酶基因Ｘｉｓ在大肠杆菌中的可溶性融合表达１１７㊀体编码蛋白Ｘｉｓ和ＩＨＦ㊁Ｉｎｔ的共同介导下这两个位点再次发生重组，从而导致噬菌体从细菌基因组上裂解下来．目前Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术是亚克隆ＤＮＡ序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达，一旦进入这个多功能的操作系统，ＤＮＡ片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移．Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术在研究植物转基因［３］㊁植物功能基因组学和蛋白质组学［４］，在高通量克隆技术㊁定点突变㊁基因插入和缺失［５］等方面有广泛的应用．Ｇａｔｅｗａｙ克隆除受控于重组位点外，还受控于ＧａｔｅｗａｙＣｌｏｎａｓｅ酶［６］，如Ｘｉｓ和ＩＨＦ㊁Ｉｎｔ．由于ＧａｔｅｗａｙＣｌｏｎａｓｅ酶具有介导ＤＮＡ重组的作用，对目的宿主有潜在的毒性和伤害．因此，这些蛋白都是通过λ噬菌体中提取分离得到，由于提取纯化步骤复杂且含量低，成本很高［７］，这就限制了Ｇａｔｅｗａｙ技术的大规模应用．λ噬菌体基因组基因Ｘｉｓ编码的切除酶是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中一种重要的蛋白质［８］．由于切除酶Ｘｉｓ蛋白存在潜在的细胞毒性，从而限制了其在宿主中的高水平表达．因此，目前国内外少有文献报道有关该蛋白的原核表达以及纯化．本研究通过基因优化和两步法基因合成，然后将该基因克隆到带有ＳＵＭＯ标签［９］的原核表达载体上，一方面实现了Ｘｉｓ在大肠杆菌中高水平的可溶性表达，解决Ｘｉｓ对宿主细胞的毒害作用；另一方面利用融合蛋白所携带的６ˑＨｉｓ组氨酸标签，成功纯化目的蛋白．Ｘｉｓ的大量制备，解除了Ｇａｔｅｗａｙ的限制因素，将会促进Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术的广泛应用．１㊀实验部分１．１㊀实验材料㊀表达载体ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ㊁用于表达的大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）㊁用于克隆的大肠杆菌ＤＨ１０β为本实验室保存．１．２㊀主要试剂㊀ＤＮＡＭａｒｋｅｒｓ㊁ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ连接试剂盒㊁ＬＡＴａｑ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＳＵＭＯ蛋白酶购置上海索莱宝生物科技有限公司；蛋白质分子量标准和限制性内切酶ＢｆｕⅠ购于Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；质粒抽提试剂盒㊁琼脂糖凝胶回收试剂盒购至Ａｘｙｇｅｎｅ公司，Ｎｉ⁃ＮＴＡ试剂盒购置于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司．引物均在上海桑尼生物科技有限公司合成．所有的分子克隆操作都按照Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［９］提供的方法进行．１．３㊀主要仪器㊀干式恒温器㊁梯度ＰＣＲ仪来自ＴａＫａＲａ公司；蓝盾６２１型蓝光仪购置于Ｂｉｏ⁃Ｖ（百唯信公司生物公司）；２４孔高速离心机购自Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；冷冻离心机，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ成像系统购自ＵＶＰ公司；层析柜购置于北极光博士德医学实验中心．１．４㊀实验方法１．４．１㊀ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ载体的构建㊀在ＧｅｎＢａｎｋ中找到λ噬菌体切除酶Ｘｉｓ基因的编号为：ＫＴ２３２０７６．１，根据基因序列翻译成氨基酸序列，利用ＤＮＡＷｏｒｋｓ３．２［１０］根据Ｅ．ｃｏｌｉ密码子偏爱性进行优化设计需要的引物（未列出），采用两步法合成全基因［１１］合成上述基因，利用实验室的高效Ｔ载体，在下游引物５ 端额外添加７ｂｐ部分ＬａｃＯ序列（５⁃ＣＡＣＡＡＴＴ⁃３）［１２］．质粒载体ｓｕｍｏ⁃ｐＥＴＧ用ＢｆｕⅠ进行双切，分别回收载体和目的基因的ＰＣＲ产物，用ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ连接试剂盒连接回收的片段和载体，连接反应参见试剂盒说明，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ１０β感受态细胞，涂布含有５０μｇ／ｍＬ氨苄西林钠和２５μｇ／ｍＬＸ⁃ｇａｌ的ＬＢ平板．在３７ħ培养箱中避光培养１０ｈ后，挑取蓝色转化子，抽提质粒进行ＰＣＲ检测，初步鉴定为重组子的质粒由上海桑尼生物工程公司测序并进行序列分析．１．４．２㊀ＳＵＭＯ⁃Ｘｉｓ融合蛋白的表达和ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测㊀将测序正确的ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，蛋白质表达和ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测方法参见分子克隆手册［９］．１．４．３㊀融合蛋白的镍柱纯化以及ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测㊀经诱导表达后的菌体收集后，破菌离心后收集上清，根据融合蛋白带的组氨酸标签进行纯化，纯化方法见镍柱纯化试剂盒说明．１．４．４㊀目的蛋白质质谱鉴定㊀将融合的目的蛋白质用ＳＵＭＯ蛋白酶处理后，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测，将目的条带从ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ胶上割下，按文献［１３］进行胶内消化与质谱鉴定分析．１１８㊀湖北大学学报（自然科学版）第３８卷２㊀结果部分２．１㊀ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ载体的构建图谱及鉴定㊀根据上述构建方法，得到ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ重组质粒载体，其载体图谱和ＰＣＲ鉴定结果如图１⁃２．用实验室构建的ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ，利用ＬａｃＯ重构的原理，筛选不发光的蓝色菌落抽提质粒做ＰＣＲ初步鉴定重组子［１２］，Ｘｉｓ基因片段大小为２１９ｂｐ，与理论预测的一致（如图２）．图１㊀载体ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ的构建过程㊀㊀㊀㊀图２㊀ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ重组质粒ＰＣＲ结果Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７：为不同的重组质粒模板；正对照：加λ噬菌体ＤＮＡ模板；负对照：不加模板．㊀２．２㊀ＳＵＭＯ⁃Ｘｉｓ融合蛋白的表达㊀将测序正确的ＳＵＭＯ⁃ｐＥＴＧ⁃Ｘｉｓ重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导蛋白质表达，破菌，上清ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析如图３所示．ＳＵＭＯ⁃Ｘｉｓ融合蛋白的理论分子量为１８．８ｋＤａ，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ结果显示目标蛋白在１８．４ｋＤａ和２５ｋＤａ之间，和预期大小一致，且在破菌上清中，证明目的蛋白成功可溶性表达．２．３㊀ＳＵＭＯ⁃Ｘｉｓ融合蛋白的纯化及ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测㊀根据融合蛋白Ｎ端所带的６ˑＨＩＳ标签，用镍柱纯化试剂盒纯化，该蛋白在咪唑浓度为１００ｍｍｏｌ／Ｌ或１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时洗脱下来．ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测，如图４所示．纯化后只有一条目蛋白，且该蛋白大小与目的蛋白大小一致，证明此蛋白就是需要的目标蛋白．图３㊀融合蛋白ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测图Ｍ为蛋白质ｍａｒｋｅｒ，Ｃ为转入的空载体诱导后的破菌上清做对照，１㊁２㊁３为随机挑取的３个转化子诱导后的样品．㊀㊀㊀图４㊀融合蛋白纯化后ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ检测图图中Ｍ为蛋白质ｍａｒｋｅｒ，１㊁２分别为目的蛋白在咪唑浓度为１００㊁１５０ｍｍｏｌ／Ｌ洗脱的样品，３为１５０ｍｍｏｌ／Ｌ第二次洗脱的样品．㊀２．４㊀Ｘｉｓ蛋白的质谱鉴定㊀纯化后的重组蛋白质通过ＳＵＭＯ蛋白酶处理后，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ条带割胶处理后，经串联飞行质谱鉴定，在质谱数据（ＭＡＴＲＩＸＳＣＩＥＮＣＥ）分析网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）上分析质谱数据，如图５所示，根据网站在数据库里分析的数据得出重组蛋白为λ噬菌体切除酶．第２期陈晚苹，等：λ噬菌体切除酶基因Ｘｉｓ在大肠杆菌中的可溶性融合表达１１９㊀图５㊀重组蛋白质谱鉴定结果３㊀讨论λ噬菌体基因组编码的切除酶Ｘｉｓ是调控λ噬菌体溶源裂解途径中的一种重要的蛋白质，也是Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术中起催化作用的酶的关键组成成分之一．目前Ｘｉｓ主要是通过提取λ噬菌体分离得到，提取分离成本高．目前Ｘｉｓ的重组表达在国内外报道很少，导致Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术的大规模应用受到限制．本研究利用促溶标签ｓｕｍｏ，在大肠杆菌中成功表达噬菌体内切酶Ｘｉｓ，且成功纯化并鉴定．该重组蛋白的高效表达解决了Ｘｉｓ毒性蛋白在原核表达时出现的不可溶或可溶性表达量偏低的问题，也进一步证实了ｓｕｍｏ蛋白的促溶特性，为今后表达不可溶蛋白提供了一种思路．由于Ｘｉｓ只是ＧａｔｅｗａｙＬＲＣｌｏｎａｓｅ酶中其中一种组成成分，我们需要进一步验证该蛋白的活性，将ＧａｔｅｗａｙＬＲＣｌｏｎａｓｅ的成本降低，从而方便科学研究者能够更加广泛地运用Ｇａｔｅｗａｙ克隆技术．４㊀参考文献［１］ＰａｐａｇｉａｎｎｉｓＣＶ，ＳａｍＭＤ，ＡｂｂａｎｉＭＡ，ｅｔａｌ．ＦｉｓｔａｒｇｅｔｓａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅＸｉｓｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｆｉｌａｍｅｎｔｔｏｐｒｏｍｏｔｅｅｘｃｉｓｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｙｐｈａｇｅｌａｍｂｄａ［Ｊ］．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，２００７，３６７（２）：３２８⁃３４３．［２］ＬｉｕＱＨ，ＬｉＭＺ，ＬｅｉｂｈａｍＤ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｕｎｉｖｅｃｔｏｒｐｌａｓｍｉｄ⁃ｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｗｉｔｈｏｕｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，１９９８，８（２４）：１３００⁃１３０９．［３］ＣｕｒｔｉｓＭＤ，ＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓＵ．Ａｇａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｅｔｆｏｒｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｓｉｎｐｌａｎｔａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００３，１３３（２）：４６２⁃４６９．［４］ＤｕｂｉｎＭＪ，ＢｏｗｌｅｒＣ，ＢｅｎｖｅｎｕｔｏＧ．Ａｍｏｄｉｆｉｅｄｇａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔａｇｇｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ，２００８，４：（１）：１⁃１１．［５］ＡｔａｎａｓｓｏｖＩＩ，ＡｔａｎａｓｓｏｖＩＩ，ＥｔｃｈｅｌｌｓＪＰ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｍｐｌｅ，ｆｌｅｘｉｂｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔＰＣＲ⁃ｆｕｓｉｏｎ／Ｇａｔｅｗａｙｃｌｏｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎ，ｓｉｔｅ⁃ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｓｈｏｒｔｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｏｍａｉｎｄｅｌｅｔｉｏｎｓａｎｄｓｗａｐｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ，２００９，５（１４）：１７４６⁃１７４８．［６］Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｇａｔｅｗａｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ［ＥＢ／ＯＬ］．［ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｇａｔｅｗａｙｍａｎｐｄｆ］．［７］ＪｏｈｎｓｏｎＥＳ．Ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｓｕｍｏ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，２００４，７３：３５５⁃８２．［８］ＣｈｏＥＨ，ＧｕｍｐｏｒｔＲＩ，ＧａｒｄｎｅｒＪＦ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｓｅａｎｄｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅｉｎｔｈｅｐｈａｇｅｌａｍｂｄａｅｘｃｉｓｉｖｅｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００２，１８４：５２００⁃５２０３．［９］ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＲｕｓｓｅｌｌＤＷ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ［Ｍ］．３ｒｄｅｄ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２００２．［１０］ＨｏｏｖｅｒＤＭ，ＬｕｂｋｏｗｓｋｉＪ．ＤＮＡＷｏｒｋｓ：ａｎａｕｔｏｍａｔｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｓｉｇｎｉｎｇｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＰＣＲ⁃ｂａｓｅｄｇｅｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００２，３０（１０）：ｅ４３．［１１］ＹｏｕｎｇＬ，ＤｏｎｇＱ．Ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐｔｏｔａｌｇｅｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００４，３２（７）：ｅ５９．［１２］ＺｈｏｎｇＸ，ＺｈａｉＣ，ＣｈｅｎＬ，ｅｔａｌ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴｖｅｃｔｏｒｆｏｒｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，２９（４）：５１０⁃５１９．［１３］ＣｈｅｎＸＭ，ＺｈａｉＣ，ＫａｎｇＬＸ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ⁃ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｈｉｇｈｌｙｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅｆｒｏｍＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔ，２０１２，３４（４）：６８９⁃６９４．（责任编辑㊀游俊）。