SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳准备

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
ß
把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
ß
在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
ß
显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定方案

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定方案步骤：（1)先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干，两边用夹子夹住，装好。

（2)琼脂的加入将1.5%的琼脂融化，趁热用吸管吸取热的1.5%琼脂沿电泳槽的两边条内测加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，待琼脂凝固。

（3)分离胶的灌注将加入TEMED后制成的分离胶立即混合均匀，然后用滴管吸取分离胶，浇灌到电泳槽的量玻璃板之间，留出梳齿的齿高加上1—1.5cm的距离，高度大约达电泳槽高度的2/3左右，再用滴管小心地在其上面覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静止于室温下约30—60min,待分离胶聚合完全后，用滤纸尽可能的吸去上面的水，尽可能的干净。

（4)浓缩胶的灌注将加入TEMED后制成的浓缩胶在试管中立即混合均匀，灌注在分离胶上，小心的插入梳尺，避免气泡，带浓缩胶凝聚完全后，将梳齿小心拔出，用电泳缓冲液立即冲洗孔格数次，待孔格凝固完全。

（5)用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样,上面加20%甘油1滴，溴酚蓝指示剂1滴，再用滴管小心加入少量电极缓冲液，使充满梳孔。

（6)电泳将电极缓冲液分别接入上下电泳槽，接上电泳仪，上电极接负级，下电极接正极。

打开电泳仪开关，调节电压至300V，电流至20—30mA，并保持电流强度恒定。

待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时，停止电泳。

（7）染色和脱色小心将胶取出，置于一大培养皿中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志。

加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰。

（8）相对分子质量的计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离，按下式计算相对迁移率：样品迁移率距离（cm）相对迁移率=----------------------染色迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。

根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。

并记录实验数据。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。

加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。

2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。

等待凝胶聚合。

3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。

4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。

5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。

6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。

7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。

8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。

9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。

10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。

以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。

需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。

30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。

同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。

丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。

N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告引言：sds聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用下，将样品中的蛋白质按照分子量大小进行分离，从而得到蛋白质的电泳图谱。

本实验旨在通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对一组未知蛋白质样品进行分析，并探讨其分子量及可能的功能。

实验方法：1. 准备样品：将待测蛋白质样品加入含有sds和还原剂的样品缓冲液中，使其完全溶解，并在100℃水浴中加热5分钟，使蛋白质完全变性。

2. 制备凝胶：按照实验要求，配制聚丙烯酰胺凝胶的缓冲液和凝胶溶液，并将其倒入凝胶模具中，形成凝胶。

3. 装载样品：将待测样品加入凝胶槽中，并连接电源，设定适当的电压和时间。

4. 电泳：开启电源，进行电泳，直至样品跑到凝胶末端。

5. 染色：取出凝胶，进行染色处理，以便观察蛋白质带的形成。

实验结果：通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们成功地将待测蛋白质样品分离出不同的带，得到了一张清晰的电泳图谱。

根据电泳图谱，我们可以看到不同蛋白质在凝胶上形成了不同的带，这些带的位置和强度可以反映蛋白质的分子量和相对含量。

讨论：通过对电泳图谱的分析，我们可以初步判断待测样品中蛋白质的分子量范围及可能的功能。

一般来说，蛋白质的分子量与其迁移距离成反比，即分子量越大，迁移距离越短。

因此，我们可以根据电泳图谱上带的位置，推测蛋白质的分子量。

此外，通过比较待测样品和已知分子量标记物的电泳图谱，我们还可以进一步确定待测样品中蛋白质的分子量。

分子量标记物是一组已知分子量的蛋白质，通过与其进行对比，我们可以更加准确地确定待测样品中蛋白质的分子量范围。

除了分子量，蛋白质的带的强度也可以提供一些信息。

带的强度反映了蛋白质在样品中的相对含量，即带越强，蛋白质的相对含量越高。

通过比较不同带的强度，我们可以初步了解待测样品中不同蛋白质的相对含量。

结论：通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们成功地分离和分析了一组未知蛋白质样品。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋
白质分离和分析方法。

工作原理：SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，可以让蛋白质以线性二级结构展开。

在电泳过程中，SDS与蛋白质结合，给蛋白质赋予等电点电荷，使得蛋白
质以质量为依据进行分离。

聚丙烯酰胺是一种用于凝胶电
泳的材料，通过聚合后形成凝胶，可以限制蛋白质的运动，使其按照大小分子量在凝胶中迁移。

步骤：
1. 准备凝胶：将聚丙烯酰胺溶液制备成凝胶，通常是在平
板上铺设。

2. 样品预处理：将需要分离的蛋白质样品与SDS等混合，再加入还原剂，使其煮沸变性化。

这样可以让所有蛋白质
在电泳过程中以线性形式展开。

3. 输运样品：将蛋白质样品加入凝胶孔隙中。

4. 电泳：通电使蛋白质样品在凝胶中迁移，较大分子量的
蛋白质迁移速度较慢，较小分子量的蛋白质迁移速度较快。

5. 可视化：通过染色方法（如Coomassie蓝染色）将蛋白质可视化，并观察分析结果。

SDS-PAGE广泛应用于蛋白质分离、分析和纯化等领域，
例如鉴定蛋白质大小、检测蛋白质含量、分离复杂样品中
的蛋白质等。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。

4℃避光储存。

即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。

Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。

Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。

凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。

临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。

其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。

4℃储存。

临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。

样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。

室温储存。

临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】1、取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）：+0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。

Tris-HCL(88,，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。

），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】分离胶separating gel (5mL) ( 1个板1板2板Prescription12%10%%mL mLDel H2O mL mL3mL1.5M Tris-HCL mL mL mL mL mL30%Acry/bis 2 mL mL mL mL单体胶（29.2g+0.8g/100mL）10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uLTEMED2uL2uL(5 uL)2uL 7uL(夏)~8uL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Prescription Volume(2 mL)(2 mL)Del H2O0.5M Tris-HCL 250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。

(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。

本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。

2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。

通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。

由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。

本实验是用化学聚合。

化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。

在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。

叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。

通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。

实验二十五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

12．脱色液：取冰醋酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水875 ml。
（二）、器材
1．垂直板型电泳槽
2．直流稳压电源(电压300～600V，电流50～100mA)
3．50或100μl的微量注射器
四、操作步骤
（一）安装垂直板型电泳装置
此种夹心式垂直板电泳装置(如图2，3)的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由3部分组成；一个“U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板(俗称“梳子”)。电极槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃片)、下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃片)和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2～3mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用4条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1％琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。（二）凝胶的制备
8．凝胶贮液：Acr30.0g，Bis0.8g，加蒸馏水到100ml
9．电极缓冲溶液：SDS l g，Tris6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，pH=8.3。
10．固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。
11．染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454 ml 50％甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

实验八
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、操作步骤
固定玻板
制备分离胶制备浓缩胶加样电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶（10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶（5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧

插入梳子
加缓冲液
加样
电泳
剥胶
五、实验结果

SDS-PAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂配制SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，可以将蛋白质按照其分子量大小分离出来。

在这个过程中，需要使用一系列试剂来形成凝胶、还原并变性蛋白质样品、以及进行电泳。

下面我们将介绍SDS-PAGE电泳试剂的配制方法。

聚丙烯酰胺凝胶电泳胶液配制1. 蒸馏水将蒸馏水取2L，通过0.22μm的滤膜过滤3遍来除杂质，备用。

2. 均聚化溶液将40%（w/v）丙烯酰胺10mL，在干燥器中烘干2小时，然后加入蒸馏水固定容积至50mL。

将10%（w/v）N, N’-二甲基亚硫脲5mL加入均聚化溶液中，搅拌30分钟至完全溶解。

3. 凝胶制备将均聚化溶液加入10%（w/v）的三甲基丙烯酰氨基甲基纤维素，搅拌5分钟后加入0.1%TEMED等待至少1小时凝胶化。

4. 等电聚焦凝胶制备将均聚化溶液加入3.33%（w/v）等电聚焦剂，根据需要调节pH值，搅拌5分钟后加入氨基甲酸1mL，搅拌2分钟至完全溶解。

加入TEMED及APS，混合倒入制好的除尘洞中，并插入梳子。

至少1小时后移除梳子，使凝胶完全凝固。

蛋白样品处理试剂配制1. SDS缓冲液将10%SDS 1.25mL加入pH6.8的磷酸盐缓冲液（1M），加入蒸馏水固定容积至100mL，搅拌10分钟至SDS完全溶解，备用。

2. β-巯基乙醇将β-巯基乙醇400μL加入1mL磷酸盐缓冲液（1M），备用。

3. 样品缓冲液将10%SDS 100μL，β-巯基乙醇50μL加入磷酸盐缓冲液1mL中，加入蒸馏水固定容积至10mL，轻轻搅拌即可。

4. 热变性载入缓冲液将4倍浓度的样品缓冲液加入β-巯基乙醇，于100℃水浴中加热5分钟。

冷却至室温，即可使用。

电泳相关试剂配制1. 电泳缓冲液将磷酸盐缓冲液1L加入SDS 10g进行混合后，加入蒸馏水将其固定至2L，备用。

2. Anode buffer将磷酸盐缓冲液1L加入SDS 5g进行混合后，加入蒸馏水将其固定至2L，备用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)

4℃避光储存。

即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。

Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。

Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。

凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。

临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。

其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。

4℃储存。

临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。

样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。

室温储存。

临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

ＳDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度实验原理:在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

当蛋白质的分子量在15KD到2０0KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。

基本过程:制胶、电泳、检测试剂：(储液由专业人员配置)30％丙烯酰胺单体储液、1０%过硫酸铵、TEMED、1.5mｏl／L Tris－ＨＣl, pH8.8、1.0ｍol/ＬＴris-HCl, pＨ6.8、10%SDS、１0XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloaｄｉｎｇbuｆｆｅr、水饱和正丁醇器材:灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪实验操作程序：1．安装灌胶模具,依照说明书进行2．按照配方配置一定量（7ｃm模具配置1mm厚的胶配置5ｍl)的分离胶溶液和浓缩胶溶液(2ml）,过硫酸铵和TEMＥD在用前加入。

3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具,上方留约1.５-２cm用于加浓缩胶,小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇(或水饱和的异丙醇、水），封住胶面,以促使聚合并保持胶面平整。

4．室温放置40分钟到1小时后,可以看到一个界面,去掉上层覆盖液,用浓缩胶缓冲液淋洗胶面,然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。

5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。

6．制备好的蛋白质样品用2Xｌoａdｉnｇbufｆer 1：1混合，与分子量ｍarkｅr一起10０℃煮3－5mｉn, 120０0rｐm离心5-10ｍin,（7ｃm模具、１mｍ厚度、10孔、考染上样量３0ug）7．加入下槽液,把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。

8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10－15mＡ／胶,9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳,取出凝胶,做好标记，准备染色。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】1取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）: +0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。

Tris-HCL（88” TEMED SDS Acry-bis,按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

&配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙, 装去离子水，不能漏（1h）,等待。

），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V,电流20mV;16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】分离胶separating gel (5mL) ( 1 个板1板2板Prescriptio n12%10%%mL mL Del H2O mL mL3mL1.5M Tris-HCL mL mL mL mL mL30%Acry/bis 2 mL mL mL mL单体胶(29.2g+0.8g/100mQ10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uL7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uLuL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Preseriptio n Volume(2 mL)(2 mL)Del H200.5M Tris-HCL250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL 夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T, %C）配制50mL:丙烯酰胺Aery: 14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；（100mL: Aery 29.2g, bis 0.8g）超纯水定容至50mL，uM 膜过滤，4C保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（mN）,可选择的范围为3%~30% %C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m）,也指交联度。

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳流程

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SOP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SOP1.目的为规范SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的操作，特制定本SOP。

2.范围本SOP适用于蛋白分子量及纯度以及定性鉴别和杂质控制测定的操作。

3.定义无4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。

4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。

4.3.质量总监负责批准本规程。

4.4.QA负责本规程执行的监督。

5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部。

6.材料6.1.仪器设备：BIO-RAD恒压或恒流电源、BIO-RAD垂直板电泳槽、BIO-RAD制胶模具，GelDoc凝胶成像系统，电子天平。

6.2.试剂与配制：1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)－盐酸(HCl)缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加注射用水50ml溶解，用盐酸调pH值至8.8，加注射用水稀释至100ml。

1.0 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)－盐酸(HCl)缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.11g，加注射用水50ml溶解，用盐酸调pH值至6.8，加注射用水稀释至100ml。

30%丙烯酰胺混合液（避光保存）：取丙烯酰胺7.5g，甲叉双丙烯酰胺0.2g，加注射用水至25ml。

10%SDS溶液：取SDS10.0g，加注射用水至100ml，室温保存。

5×样品结合液：取10%SDS2.0ml，1.0mol/L Tris-HCl缓冲液（pH=6.8）0.6ml，50%甘油5.0ml，1%溴酚蓝1.0ml，注射用水0.9ml，β-巯基乙醇0.5ml（临用现加）5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：取Tris15.1g，甘氨酸94.0g加注射用水溶解，加入10%SDS 50ml，加注射用水至1000ml，用时取缓冲液做5倍稀释。

0.3%考马斯亮蓝染色液：取考马斯亮蓝0.6g，加入200ml脱色液溶解。

脱色液：取冰醋酸100ml，95%乙醇450ml，加水450ml。

蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程

蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简易教程一、相关仪器和试剂的准备：（一）仪器：1、垂直电泳仪（本体、干净玻璃板、制胶架、梳子等）。

2、移液器：1000μL、100μL、10μL各一支及枪头若干。

3、一只干净小烧杯和加热大烧杯。

4、可提供500V电压的电源。

5、用于染色和脱色的容器。

6、用于加热的电炉子7、手套一副8、微量进样器（二）试剂：1、二次蒸馏水。

2、30%丙烯酰胺混合溶液。

3、1.5mol/L的Tris（pH=8.8）和0.5mol/L的Tris（pH=6.8）。

4、10%的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液和10%的过硫酸铵溶液。

5、TEMED（四甲基乙二胺）标准品。

6、染色液、脱色液和电极缓冲液7、蛋白Marker系列（Marker、Loading buffer，）二、样品制备各取样品40μL于小离心管，加入10μL样品缓冲溶液，混匀。

沸水中加热5min，待用。

Marker取40μL，一起加热（可以用4次）三、各溶液的配制1、30%丙烯酰胺混合溶液。

29g丙烯酰胺，与1g甲叉双丙烯酰胺混合，定容到100mL，过滤。

2、10% SDS溶液取5g SDS，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。

（SDS为有机溶剂，在配制时易起泡沫，定容时应在泡沫全部退去后再定容，以免不准确）3、10%过硫酸铵溶液取5g过硫酸铵，用水溶解后，注入50mL容量瓶中，定容。

4、分离胶缓冲溶液1.5mol/L pH=8.8的Tris-HCl缓冲溶液：将18.15g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为8.8，定容到100mL5、浓缩胶缓冲溶液0.5mol/L pH=6.8的Tris-HCl缓冲溶液：将6.0g Tris用98mL水溶解后，用浓盐酸调至pH为6.8，定容到100mL6、分离胶（12%）和积层胶（5%）的配制7、电极缓冲液将6g Tris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容到1000mL，pH应为8.3。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法1、试剂（1）丙烯酰胺（Acr）单体贮液：29.1克Acr，0.90克甲叉双丙烯酰胺（Bis），加水溶解并定容到100 ml，过滤后使用，用棕色瓶4℃下可贮藏1~2个月。

（2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取SDS 10g（室温低时可水浴溶解），纯水定容100mL，室温保存。

（3）10%过硫酸铵（AP）溶液：AP 0.1g加纯水1mL，现用现配。

（4）10%四甲基乙二胺（TEMED）溶液：原液，现用现取。

（5）分离胶缓冲液贮液：1.5mol/L pH8.8的Tris(三烃甲基氨基甲烷)—HCl缓冲液。

将9.08克Tris用4 0mL纯水溶解后，用4mol/L的盐酸调至pH8.8，再定容到50mL，4℃下保存。

（6）浓缩胶缓冲液贮液：1mol/L pH6.8的Tris—HCl缓冲液。

将6.06克Tris用40mL纯水溶解后，用4mol/L的盐酸调至pH8.8，再定容到50mL，4℃下保存。

（7）电极缓冲液：将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到1000ml，pH应为8.3。

（8）样品缓冲液：1.0mL浓缩胶缓冲液贮液，4mL 10%SDS，1mL β-巯基乙醇，2mL 甘油，4mL 0. 2%（g/mL）溴酚蓝，纯水稀释到20mL，4℃下保存（9）0.1%溴酚蓝溶液。

（10）已知分子量的标准蛋白（M＜10万KDa）5种：兔磷酸化酶B 97400，牛血清白蛋白66700，兔肌动蛋白43000，牛碳酸酐酶31000，胰蛋白酶抑制剂20300，鸡蛋清溶菌酶14400。

（11）未知分子量的蛋白质样品。

（12）考马斯亮蓝溶液：称取0.25克考马斯亮蓝R-250，甲醇110mL，冰醋酸25mL，加水110mL。

（13）脱色剂：17.5毫升冰乙酸，50毫升甲醇，432.5毫升水。

2、仪器垂直板电泳槽，双稳电泳仪3、实验步骤（1）电泳槽的安装洗净玻璃板，然后用酒精消毒玻璃板及胶架，将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。