双向电泳技术流程

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(完整版)双向电泳原理与流程

(完整版)双向电泳原理与流程
Amersham Biosciences ——提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案
GE Healthcare Life Sciences ——实现从发现到功能研究,从体外到体内的突破
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
2002
Amersham Biosciences launched Ettan™ DIGE
1991
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
1973
1978
1982
LKB introduced Immobiline™
1979
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte™
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
4/ GE Title or job number /
2/3/2020
Why 2DE?
Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample preparation, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches.
2/3/2020

蛋白双向(2-D)电泳实验服务

蛋白双向(2-D)电泳实验服务
实验设备
双向电泳是目前为止最有效、使用最多的蛋白分离方法。差异蛋白质组学是在双向电泳后用考麻斯亮蓝、银离子或荧光染料等将蛋白斑点染色,然后比较差异。本公司在各类微生物、培养细胞、动植物组织(如动物软硬组织、体液、植物种子、叶子等)、亚细胞组分的双向电泳分离及后续质谱鉴定中均有丰富的经验。
一、蛋白质组学双向电泳技术服务项目:
1.根据客户需求定制蛋白质组学实验方案
2.各种规格胶条长度的双向电泳
3.考麻斯亮蓝染色、银离子染色;
4.DIGE系统双向电泳。
5.图像分析
6.切胶质谱分析
二、说明
1.蛋白质组学实验的总体实验流程;
双向电泳结果提交
A:实验的试剂耗材、仪器设备、操作过程一份;
B:实验结果凝胶扫描图片;
C:电泳凝胶(可收费干胶);
D:剩余样本。
说明:
1.样品制备指可用通常程序处理的原样,如样品较特殊(需要去除核酸、盐等杂质或需要浓缩),价格将视进一步处理的难度和耗材用量另行商定;
2.建议客户提供的原样(组织、细胞、菌体等)湿重不少于100mg,如直接提供蛋白提取物,则浓度不少于4ug/ul,总量不少于5mg;
3.样品的还原和烷基化过程一般在制备时进行;
蛋白双向(2-D)电泳实验服务
实验技术简介:双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。[晶莱生物]
测序实验流程:
4.图象处理与切胶主要是手工操作成本。
实验介绍:
双向电泳将等电聚焦电泳和SDS-PAGE相结合,即先进行等电聚焦电泳,然后再进行SDS-PAGE,经染色得到二维分布的蛋白质图谱。

《双向电泳技术》课件

《双向电泳技术》课件

高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质,提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性,实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ,需要耗费较多的时间和人力

对样品要求高
该技术需要大量的起始样品, 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻,需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段,有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中,双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响,从而发现药物作用的靶点 。此外,通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱,可以发现潜在的药物靶点,为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质,为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点,加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术,优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系,提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本,进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ,从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法,确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质

双向电泳详细操作过程

双向电泳详细操作过程

蛋白质的双向电泳一、实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤:1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥,放在-80度冰箱里备用,取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul,加丙酮酸(加DTT)1.6ml,放置-20度冰箱2h,离心,吸除丙酮酸,用超纯水中(加DTT),清洗两次,离心,加水化液溶解。

水化液配置:用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素(60.06)7M/L 42.0g 8.4g硫脲(76.12)2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g(注:DTT现用现加)3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液,在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。

另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,各管中分别加入4ml的Bradfor,摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

例如:标准曲线方程式:Y= aX+b.其中Y为OD值,X为蛋白含量。

a、b通过作图输入数据可知G250的配置:称取G250 固体0.1g加水定容至1L。

使用前滤纸过滤。

比色皿用70%的乙醇保存,待用时用双蒸水冲洗,再用无水乙醇冲洗,双蒸水冲洗,再加入待测样品溶液润洗,然后,加入样品,测定OD值。

双向凝胶电泳技术.

双向凝胶电泳技术.

制备原则:
由于双向电泳所分析样品的多样性,没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
(1)尽可能溶解全部蛋白质,打断蛋白质之间的非共价键结合, 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
(2)避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 (3)避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 (4)蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是:
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外,最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上, 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大(>200kD)或极小(<10kD=蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测,这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术,因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高,自第一次应用该技术以来,其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此,双 向电泳被广泛应用与农业,医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质,而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质,因此2DE的分离能力非常强大,它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开,2DE 在分离蛋白混合样品, 比较差异方面有不可替代的作用,结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分,与其他生物技术如分子生物 学,分子遗传工程,免疫学,微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合,可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后,胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持,便于随时进行第二向的平衡,也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。

双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时。

其中每隔10,15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰,3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清。

在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清。

3.2 点样,上胶分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。

双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基,置于28℃培养箱培养18h。

参照Coelho 等(Coelho et al. 2004)的方法,略有改动。

用Wash buffer(10mmol/L TrisCl pH8.0,5mmol/L 醋酸镁)清洗细胞3次。

离心,细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素,2mol/L硫尿,1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7,4% CHAPS,1% DTT,1%蛋白酶抑制剂,1%核酶抑制剂)中悬浮,使其浓度范围在5~10mg/mL。

置于冰上裂解2h。

13000r/min离心1h取上清,-80℃保存。

用2-D clean-up Kit 纯化蛋白,再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。

3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法(全程小心)蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理,所有步骤均在冰上进行。

1)将体积100μL的蛋白质样本(含1~100μg蛋白质)置于1.5mL微型离心管中。

加入300μL沉淀剂。

振荡或倒置搅匀。

冰浴中(4~5℃)培育15min。

2)加入300μL共沉淀剂,简单振荡混合一下,12000r/min离心5min。

3)将上清液尽量多地倾析或吸出,不要搅散沉淀。

保持沉淀不变,在其上面加入一层40μL共沉淀剂,冰上培育5min。

后离心5min,去上清。

4)往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。

将管振荡5~10s,这时沉淀应散开,但并未溶解于水中。

在管中加入1mL洗涤缓冲液(在-20℃下至少预冷1h)和5μL洗涤添加剂,振荡直至沉淀完全散开。

-20℃下培育至少30min,每10min振荡20~30s。

5)将离心管以最大速度(至少12000r/min)离心5min。

小心地将上清液移走弃去。

此时应可见白色沉淀,将沉淀简单风干一下(不要超过5min)。

6)用裂解液溶解沉淀,以备第一向IEF电泳。

振荡管子至少30s,在室温下孵育,振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。

双向电泳的概念和原理

双向电泳的概念和原理

双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术,用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。

首先,将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。

凝胶是一种聚合物网状结构,可以限制分子的运动,将其分离。

常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。

第一步是水平电泳。

在水平电泳阶段,一个方向的电场施加在凝胶中,使得带电分子向着相应的电极方向移动。

这个方向通常被称为水平方向,因为它从一个电极移动到另一个电极。

在水平电泳过程中,由于分子的大小和电荷不同,它们将以不同的速度在凝胶中运动。

大分子移动缓慢,小分子移动快速。

这样,分子根据大小按照一定的顺序移动,导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。

这个方向通常被称为水平电泳通道。

第二步是垂直电泳。

在水平电泳结束后,垂直电场被施加在凝胶中,使分子以另一个方向移动。

这个方向通常被称为垂直电泳通道。

在垂直电泳过程中,分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上(正电流)或向下(负电流)。

正电流将使分子向上移动,而负电流将使分子向下移动。

这样,分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。

最终,两个方向的电泳都完成后,在凝胶上会形成一个类似网格的结构,其中分子被分离成不同的带状。

这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来,从而确定分离出的分子的位置。

总结起来,双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。

通过水平电泳和垂直电泳,分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状,从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。

双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。

下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤:双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。

它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质,并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。

以下是一般的双向电泳操作步骤:1.确保准备充足的电泳装置,包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。

2.准备样品:将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理,包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。

将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。

3.将样品加载到电泳槽中:在准备好的电泳缓冲液中加入样品,然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。

注意,为了保持电泳稳定性,在样品孔加载样品后,要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。

4.进行等电点电泳:将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中,并在两侧分别连接正负极。

设置合适的电流和电压,开始进行等电点电泳。

在等电点电泳过程中,蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。

5.停止等电点电泳:根据需要进行电泳时间的设定,一般情况下为2-3小时。

等电点电泳时间结束后,关闭电源,并小心地取出电泳舱。

6.水平电泳:停止等电点电泳后,将样品塘从上清洗掉,并用水平电泳缓冲液进行冲洗。

然后,在两侧连接正负极,设置合适的电流和电压,开始水平电泳。

在水平电泳过程中,蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。

7.停止水平电泳:根据需要进行电泳时间的设定,一般情况下为4-5小时。

水平电泳时间结束后,关闭电源,并小心地取出电泳舱。

8.染色和图像采集:将分离完毕的样品进行染色,常用的染色方法包括银染和荧光染色。

然后,使用图像采集系统获取电泳图像,可根据需要调整采集参数。

9.数据分析和解释:通过对电泳图像的分析,包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等,将分离出来的蛋白质鉴定和定位。

10. 验证和验证:对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。

双向电泳实验操作流程

双向电泳实验操作流程

双向电泳实验操作流程机器型号:GE第一向:等电聚焦(IEF)1.对样品的要求:IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度,一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液,加等渗蔗糖。

根据染色方法和胶条的长度决定上样量,一般是20μg/mL -1mg/mL。

考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。

2.IEF准备注意事项:DTT和IPG现用现配,由于DTT是还原剂,长时间放置易氧化,所以可以选择干物质使用。

DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构,CHAPS为碱性去垢剂,和SDS作用相似,溶解尿素时温度不可超过37℃,因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化,尽量在生产日期一年内使用。

清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂,原液清洗或2%浓度浸泡清洗。

3.上样:胶条使用前20min从冰箱(4℃)中取出。

上样可以采用水化上样或者使用上样杯(先水化,后上样),上样杯上样适用于极性等电点蛋白质,水化12h后,在电泳槽上样。

以水化上样为例:先将250μL样品和水化液(需要当天配制)混合物加到胶条槽里,然后从尖端(阳性端)撕掉保护膜(带IO号),将胶条支持膜向上,胶面向下,用配用镊子夹住平端放入胶条槽中,注意不要产生气泡,用覆盖油覆盖,盖上盖子。

说明:放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出,说明胶条放的对,如果读不出来,说明放反了。

在电脑软件中设置操作参数:水化上样分为被动上样(就是这种浸泡状态维持约16h)和主动上样(加电压30V,大约需要10h)。

上样后即可进行IEF电泳。

注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。

一般是30V电压水化12h,然后200V、500V、1000V各1h,最后用8000V电压电泳至结束。

4.胶条的平衡:平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中,SDS溶解后冷却至20℃左右,在加入尿素充分溶解,然后加甘油混匀成水溶液。

将该水溶液分成两份,每份15mL,分装到两个平衡管中,其中一个管中加DTT,另一个管中加IAA,DTT可以打开蛋白的二硫键,防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾,尿素、甘油可以降低电离效应,使胶条可以很好的转入第二向,IAA可以将去除DTT。

双向电泳操作流程

双向电泳操作流程

双向电泳完整操作流程仪器:Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机(Beckman Coulter)、IPGhor 等电聚焦仪(GE Healthcare)、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪(GE Healthcare)、ImageScanner扫描仪(GE Healthcare)、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件(GE Healthcare)、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置:三氯乙酸-丙酮沉淀液:10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液:0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液:9mol/L尿素、4%CHAPS、1%IPG buffer(GE Healthcare)、1%DTT样品水化液:9mol/L尿素、4%CHAPS、1%IPG buffer(GE Healthcare)、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液:0.01%(w/v)G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液:1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1:6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS,1%DTT,痕量溴酚兰平衡缓冲液2:6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS,4%碘乙酰胺,痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液:12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL(pH=8.8)、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液:25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液:25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液:12%(W/V)三氯醋酸考染染色液:0.12%G-250、10%(NH4)2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。

双向电泳步骤

双向电泳步骤

以下是双向电泳的步骤:
1.从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品充分混匀。

2.从冰箱中取-20°c冷冻保存的ipg预制胶条(17cm ph4-7),室温
中放置10分钟。

3.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品,在槽两
端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。

注意:不要产生气泡,否则影响到胶条中蛋白质的分布。

4.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子
轻轻的去除预制ipg胶条上的保护层。

5.分清胶条的正负极,轻轻地将ipg胶条胶面朝下置于聚焦盘或水
化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极,确保胶条与电极紧密接触。

6.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸
发。

7.对好正、负极,盖上盖子。

设置等电聚焦程序,聚焦结束的胶条
应立即进行平衡、第二向sds-page电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20°c冰箱保存。

双向电泳法

双向电泳法

双向电泳法双向电泳法(Bidimensional Electrophoresis,2-DE)是一种常用的蛋白质分离技术,可以同时分析样品中上千种蛋白质。

本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。

原理双向电泳法结合了等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE两种技术,通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。

在第一维度中,根据蛋白质的等电点(pI)进行分离;在第二维度中,根据蛋白质的分子量进行分离。

通过将这两个维度的分离结果叠加,可以获得高分辨率的蛋白质图谱。

双向电泳法的关键步骤如下:1.等电聚焦(IEF):在第一维度中,使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。

等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子(OH-)或氢离子(H+)方向移动的分离方法。

在等电聚焦过程中,蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移,直到净电荷为零。

通过控制pH梯度和应用的电压,可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。

2.SDS-PAGE分离:在第二维度中,将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。

在SDS-PAGE凝胶中,蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。

由于SDS(十二烷基硫酸钠)的存在,蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。

因此,蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。

3.染色和分析:经过双向电泳分离后,凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点,每个斑点代表一个蛋白质。

常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。

对于银染法,它在灵敏度和线性范围上具有优势。

染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。

通过对斑点的比较和定量,可以识别不同样品之间的差异和变化。

步骤双向电泳法的步骤如下:1.样品制备:将待分析的生物样品(如细胞提取物)进行蛋白质提取,并使得蛋白质在石蜡中可溶解。

常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。

2.等电聚焦(IEF):将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。

双向电泳实验流程

双向电泳实验流程

双向电泳实验流程样品制备( Sample preparation ) 固相预制胶条的水化( IPG strip rehydration ) 第一向等电聚焦( IEF)胶条的平衡( IPG strip equilibration )第二向SDS-PAG电泳(SDS-PAGE electrophresis )凝胶的染色及检测( Detection/Staining )PDQuest软件分析(Software analysis )质谱鉴定( Protein identification )目录第一章实验材料1.1 IPG 预制胶条及载体两性电解质1.2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1.3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂1.4 化学试剂1.5 蛋白质Marker1.6 染色试剂1.7 注意事项第二章SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE 凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项ATy -_*双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章实验材料1.1 IPG 预制胶条及载体两性电解质Bio-Rad公司),-20 C冰箱保存,每包12根一)IPG 预制胶条(美国项目规格货号原价(元)IPG 预制胶条pH 3-10 ,7 cm 163-2000 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ,7 cm ,nonlinear (NL)163-2002 799 IPG 预制胶条pH 4-7 ,7 cm 163-2001 799 IPG 预制胶条pH 3-6 ,7 cm 163-2003 799 IPG 预制胶条pH 5-8 ,7 cm 163-2004 799 IPG 预制胶条pH 7-10 ,7 cm 163-2005 799 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ,7cm 163-2028 799 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ,7cm 163-2029 799 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ,7cm 163-2030 799 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ,7cm 163-2031 799 IPG 预制胶条pH 3-10 ,11cm 163-2014 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ,11cm,nonlinear (NL)163-2016 957 IPG 预制胶条pH 4-7 ,11cm 163-2015 957 IPG 预制胶条pH 3-6 ,11cm 163-2017 957 IPG 预制胶条pH 5-8 ,11cm 163-2018 957 IPG 预制胶条pH 7-10 ,11cm 163-2019 957 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ,11cm 163-2024 957 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ,11cm 163-2025 957 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ,11cm 163-2026 957 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ,11cm 163-2027 957 IPG 预制胶条pH 3-10 ,17cm 163-2007 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ,17 cm ,nonlinear (NL )163-2009 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ,17cm 163-2008 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ,17cm 163-2010 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ,17cm 163-2011 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ,17cm 163-2012 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ,17cm 163-2020 1079IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ,17cm 163-2021 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ,17cm 163-2022 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ,17cm 163-2023 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ,18cm 163-2032 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ,18cm,nonlinear (NL )163-2033 1079 IPG 预制胶条pH 4-7 ,18cm 163-2034 1079 IPG 预制胶条pH 3-6 ,18cm 163-2035 1079 IPG 预制胶条pH 5-8 ,18cm 163-2036 1079 IPG 预制胶条pH 7-10 ,18cm 163-2037 1079 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ,18cm 163-2038 1079 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ,18cm 163-2039 1079 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ,18cm 163-2040 1079 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ,18cm 163-2041 1079 IPG 预制胶条pH 3-10 ,24cm 163-2042 1292 IPG 预制胶条pH 3-10 ,24cm,nonlinear (NL )163-2043 1292 IPG 预制胶条pH 4-7 ,24cm 163-2044 1292 IPG 预制胶条pH 3-6 ,24cm 163-2045 1292 IPG 预制胶条pH 5-8 ,24cm 163-2046 1292 IPG 预制胶条pH 7-10 ,24cm 163-2047 1292 IPG 预制胶条pH 3.9-5.1 ,24cm 163-2048 1292 IPG 预制胶条pH 4.7-5.9 ,24cm 163-2049 1292 IPG 预制胶条pH 5.5-6.7 ,24cm 163-2050 1292 IPG 预制胶条pH 6.3-8.3 ,24cm 163-2051 1292(二)载体两性电解质(美国Bio-Rad公司),4C冰箱保存项目货号原价(元)Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ,40%,10ml 163-1112 1704 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte ,40%,25ml 163-1113 2463 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte ,20%,10ml 163-1132 3275 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ,40%,10ml 163-1142 3713 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte ,40%,25ml 163-1143 9287 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ,40%,10ml 163-1152 2984 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte ,40%,25ml 163-1153 7540 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ,40%,10ml 163-1162 3569 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte ,40%,25ml 163-1163 8187Bio-Lyte 7/9 Ampholyte,40%,10ml 163-1172 3479 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte ,20%,10ml 163-1182 1912Bio-Lyte 5/8Ampholyte,40%,10ml 163-1192 3275Bio-Lyte 5/8Ampholyte,40%,25ml 163-1193 8114(三)等电聚焦上样缓冲液(美国Bio-Rad 公司),4C冰箱保存项目货号原价(元)100x ReadyStrip Buffer , for pH 7-10 IPG Strips , 1ml 163-2093 744Bio-Lyte 3/10 Ampholyte , 100x, 1ml 163-2094 396100x ReadyStrip Buffer ,for pH 6.8-8.3 IPG Strips ,1ml 163-2095566 100x ReadyStrip Buffer ,for pH 5.5-6.7 IPG Strips ,1ml 163-2096 774100x ReadyStrip Buffer ,for pH 4.7-5.9 IPG Strips ,1ml 163-2097 545100x ReadyStrip Buffer ,for pH 3.5-5.1 IPG Strips ,1ml 163-20985921.2 蛋白质定量试剂盒及其试剂项目货号报价(元)Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0001 919Protein Assay Kit II ,BSA standard 500-0002 919Protein Standard I, bovine 丫-globulin , 1 bottle 500-0005429 Protein Assay Dye Reagent Concentrate,450ml 500-0006 690Protein Standard II,bovine serum albumin,1 bottle 500-0007 365Quick Start Protein Assay Kit I ,Bradford 法500-0201 934De Protein Assay Kit I , bovine 丫-globulin standard 500-0111 2281 De Protein Assay Kit n, BSA standard 500-0112 2281 RC DC Protein Assay Kit I , 丫-globulin , Lowry 法500-0121 3183 RC DC Protein Assay Kit II , BSA standard , Lowry 法500-0122 31831.3 蛋白样品制备试剂盒及其试剂项目Ready-Prep 2-D Cleanup KitReadyPrep Sequential Extraction Kit Tributylphosphine (TBP ),200mM ,0.6ml ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1货号原价(元)163-2130 2533163-2100 2969163-2101 539 1vial 163-2102 1116ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2 ,1vial 163-2103 909 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3 ,1vial 163-2104 646 ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105 3250 ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106 331 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I ,with DTT 163-2107 508 ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII 163-2108 498E.coli Protein Sample ,lyophilized ,2.7mg 163-2110 446ReadyPrep Overlay Agarose,50ml 163-2111 287 ProteoMiner Protein Enrichment SmallCapacity Kit 163-3006 3699 ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit 163-2007 5618 Aurum Serum Protein Mini Kit 732-6701 1513 Aurum Affi-Gel Blue Mini Columns 732-6708 1873 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Cytoplasmic/Nuclear) 163-2089 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane I) 163-2088 4919 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Membrane II) 163-2084 2986 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Signal) 163-2087 28151.4 化学试剂项目尿素Urea,250g 尿素Urea,1kgAG 501-X8 (D)Mixed Bed ResinCHAPS ,1gTriton X-100 ,500mlDTT (Dithiothreitol ),1gDTT (Dithiothreitol ),5g Tributylphosphine ( TBP ),200mM ,0.6ml 碘乙酰胺Iodoacetamide,30g 溴酚蓝( Bromophenol Blue ),10g 矿物油( Mineral Oil ),500ml SDS,100gSDS,1kg Tris ,500g Tris ,1kg 低熔点琼脂糖,25g 甘氨酸,1kg 货号161-0730161-0731142-6425161-0460161-0407161-0610161-0611163-2101163-2109161-0404163-2129161-0301161-0302161-0716161-0719161-3111161-0718原价(元)22268527713904212917315391429501298368199181311511360713甘氨酸,2kg 161-0724 1671 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 500g 161-0101 919 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 2kg 161-0103 3411 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 1kg 161-0107 1870 丙烯酰胺(Acrylamide ), 99.9% , 5kg 161-0108 8514 甲叉双丙烯酰胺(Bis), 5g 161-0200 294 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 10g 161-0202 1902 PDA (Piperazine Diacrylamide ), 50g 161-0203 17361 过硫酸氨(Ammonium Persulfate ), 10g 161-0700 155 过硫酸氨(Ammonium Persulfate ),100g 161-0754 1153 TEMED,5ml 161-0800 207 TEMED,50ml 161-0801 485 甘油Sigma硫尿Sigma1. 5 蛋白质标准品Marker项目货号原价(元)Unstained SDS-PAGE Standards,high range,200 'l 161-0303 689 Unstained SDS-PAGE Standards,low range,200'l 161-0304 689 Unstained SDS-PAGE Standards,broad range,200'l 161-0317 884 Polypeptide SDS-PAGE Standards,200._l 161-0326 692 Prestained SDS-PAGE Standards, high range,500^1 161-0309 689 Prestained SDS-PAGE Standards, low range,500^1 161-0305 689 Prestained SDS-PAGE Standards, broad range,500^1 161-0318 800 Precision Plus Std Unstained,1ml 161-0363 1168 Precision Plus Std Dual Color,500ul 161-0374 1080 2-D SDS-PAGE Standards,500 J 161-0320 1457 IEF Standards,pl range 4.45-9.6,250^1 161-0310 16211. 6染色试剂项目Coomassie Brilliant Blue R-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue G-250 , 10gCoomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ,货号原价(元)161-0400 413161-0406 670161-0435 1440 1L 161-0436 464Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions ,4 X 1L 161-0437 1856 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ,1L 161-0438 488Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions ,4X 1L 161-0439 1952 Bio-Safe Coomassie Stain ,1L 161-0786 878 Bio-Safe Coomassie Stain ,5L 161-0787 3493 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ,200ml 170-3126 2226 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ,1L 170-3125 5725 SYPRO Ruby Protein Gel Stain ,5L 170-3138 16744Silver Stain Kit 161-0443 3933 Silver Stain Plus Kit (质谱兼容)161-0449 28541.7 注意事项1. 双向电泳中所用的化学试剂纯度要高,至少为分析级,尽量选用进口试剂。

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7cm 11cm 17cm
Analytical Load (silver staining)
10~100ug/125ul 50~200ug/185ul 100~300ug/300ul
Preparative Load (Coom staining)
200~500ug/125ul 250~1000ug/185ul
样品制备
• 样品的纯化
蛋白样品的纯化
样品进行纯化的试剂盒 ReadyPrep 2D Clean-up Kit:去除盐分及其他杂质 ReadyPrep Reduction-Alkylation Kit:显著提高碱性蛋白分辨率
ReadyPrep 2-D Kits
样品中DNA的去除
• DNA/RNA等可以同蛋白质形成超大分子量 的复合物,从而影响蛋白质的电泳分离。 • 一般在用40mM Tris溶液裂解细胞时,加入 DNA消化酶,即可有效去除DNA。 • 量:1ml溶解液中加入150~300U的内切核酸 酶,室温反应20min即可。
高不溶性蛋白的分离:主要还是要增加蛋白质 的溶解度,采用顺序抽提法进行。
亚蛋白质组样品的制备
主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质 组分成不同的蛋白质组亚群,再用适当的蛋白溶解 液溶解,以降低样品的复杂性、提高分辨率。常用 方法为: 1、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成 分,再用适当的蛋白质溶解液进行溶解,这不仅大 大减少样品的复杂性,而且展示出的蛋白质可确定 其亚细胞定位。该法需要专业仪器,有时会出现假 阳性。
ddH2O
Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use
IPG pH Range 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) range 3/10 4/6 5/7 3/5 4/6 5/8 7/9 8/10 Bio-Lyte Ampholyte (stock) Conc.(w/v) 40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20% Sample Solution Volume Per 5ml 25ul 12.5ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul 12.5ul 25ul Sample Solution Volume Per 50ml 250ul 125ul 125ul 250ul 125ul 250ul 125ul 250ul
• • •
高纯度单体 对低丰度蛋白提供不同分辨率 的窄或宽pH范围的胶条 五种长度可供选择: – – – – – 7 cm 11 cm 17 cm 18 cm 24 cm
IPG Strip Resolution
用窄pH IEF能得到更多的蛋白点
pH ngth 24 cm 17 cm 11 cm 7 cm
样品制备
第一向 IEF电泳
第二向 SDS-PAGE电泳
染色 蛋白斑点的切取 图像采集和分析
第一部分
• 样品制备 • 蛋白定量
实验样品的制备原则
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 (包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可 重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰(如酶性或化学性降解等)。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而 保证待研究蛋白的可检测性。
2% CHAPS 2%SB3-10 0.2%carrier ampholytes
40mM Tris 0.0002%bromophenol blue ddH2O
100mg 100mg See table
24.2mg 10ul of 0.1% stock To 5ml
IPG胶条的蛋白质大约载样量
IPG Strip length
蛋白样品的处理试剂盒
• • • • • • • • • • • 总蛋白提取 ReadyPrep Protein Extraction Kit (Total Protein) 分步提取蛋白,能得到更多的蛋白 ReadyPrep Sequence Extraction Kit 膜蛋白提取 ReadyPrep Extraction Kit (Membrane I) ReadyPrep Extraction Kit (Membrane II) 信号转导蛋白的提取 ReadyPrep Extraction Kit (Signal) 定位在细胞核或细胞浆中的蛋白 ReadyPrep Extraction Kit(Cytoplasmic/Nuclear)
Effective pH Overlapping Range Length 3–10 3–10 3–10 3–10
pH 7 - 10
56 cm 40 cm 26 cm 16 cm
pH 3 - 6
pH 5 - 8
pH 3-–6
pH 5-–8
pH 7–10
样品制备和一向电泳时应严格防 止角蛋白的污染。 双向电泳样品的其它来源 • Cell disruption: • Immunoprecipitation: • Plant cell sample: • Subcellular organelles: • Microdissection:
2、根据细胞蛋白溶解性的差异,用具有不同溶解 能力的蛋白溶解液进行顺序抽提,从而分离出具有 不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 一般分3个层次: 第一步用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白; 第二步是把未溶解的小片(pellet)用常规IEF样品 液(8M尿素+4%CHAPS+DTT)溶解,这次抽 提剩下的小片主要是富集的膜蛋白,约占整个样品 的11%(W/W); 第三步是用增强的蛋白溶解液5M尿素+2M硫脲+ 2%CHAPS+2%SB3-10+2MTBP作最后的抽提。
ReadyPrep 2-D试剂盒
蛋白的定量
• 采用比较蛋白质组学方法进行研究,有一个重要的前提是要保证各实 验组间的实验条件的一致。因此在实验前应对蛋白进行定量,以保证 蛋白上样量一致。考虑到在定量的同时蛋白的降解也在进行,因此需 要采用一种快速和相对准确的蛋白定量方法。 • 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三种 方法,其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml,但核酸可引起强干扰作用; Lowry 法灵敏度为5-100 μg/ml,虽相对准确,但干扰物质多且反应速 度慢,而且含DTT溶液不宜用此法;Bradford法灵敏度为25-200 μg /ml,由于相对干扰物质较少,且反应时间仅需2分钟,故适合用于大 多数研究的蛋白定量。 • Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定的试剂盒 DC Protein Assay Kit,该方法类似于常规的Lowry方法,但经过改良 后,节省了操作时间。DC蛋白测定只需要15分钟的温育时间,而且 吸收值读数保持2小时的稳定。RC DC Protein Assay Kit蛋白测定是 一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白测定,具有原来DC蛋白测定的 特点,并能与更多的试剂兼容,简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。
双向电泳的 技术流程
生物学问题的 提出 感兴趣蛋白点的切取
实验模型的设 计
实验组和对照组样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
图像扫描和初步分析
蛋白信息的初步获得
质谱结果的生物信息学分析和比对 其它实验的进一步验证
新蛋白质的发现
Proteomics Experimental Workflow
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离:尽管增加上样量和提高 总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量, 但同时增加了高丰度蛋白的负荷,且造成蛋白的叠 加效应而影响分离。现常用预分级+窄 pH 胶的微 制备技术进行分离:即将总蛋白组分成蛋白质组亚 群,再用 pH 梯度小于 2 个 pH 单位的 IPG 胶进行窄 pH范围的分离。
0.0002%bromophenol blue
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
ddH2O
Multiple surfactant solution preparation
Reagent 5M urea 2M Thiourea 2mM TBP Amount 2.9ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H2O 760mg 50ul of 200mM TBP stock
样品液的准备
标准液:
Reagent 8M urea
50mM DTT or 2mM TBP 4% CHAPS 0.2%carrier ampholytes
0.0002%bromophenol blue
Amount 47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O 385mg or 500ul of 200mM TBP stock 2g See next table 100ul of 0.1% stock To 50ml
蛋白定量试剂盒
• Quick Start Bradford Assay Kit可以和 SmartSpec Plus Spectrophotometer进行蛋 白的准确定量。 • 如果您有Bio-Rad的酶标仪, 还有一种简单的测定总蛋 白浓度的比色测定方法, 即可以采用Bio-Rad Protein Assay Kit进行蛋白 定量。
1~3mg/300ul
IEF的基本条件
voltage
Stemp 1 7 Stemp 2 cm Stemp 3 Total Stemp 1 11 Stemp 2 cm Stemp 3 Total Stemp 1 17 Stemp 2 cm Stemp 3 Total 250 10000 10000 250 4000 4000
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