基因工程原理-第二章 DNA重组
基因重组知识点总结
基因重组知识点总结一、基因重组的原理基因重组的原理是在DNA分子水平上，通过切割和重组DNA的不同片段，形成新的DNA 序列。
基因重组可以实现DNA片段的互换、合并、删除或插入操作，从而改变DNA的序列，并且产生新的基因组合。
基因重组的原理主要涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
1. DNA的结构DNA是由四种碱基（腺嘌呤A、胞嘧啶T、鸟嘌呤G、胞嘧啶C）组成的双链分子，它的结构在空间上呈现出双螺旋的形态。
每一条DNA链都由磷酸和脱氧核糖组成，而这些单元组成了DNA的主干。
而碱基对（A-T、G-C）则连接了两条DNA链，形成了DNA的双链结构。
2. 酶的作用在基因重组的过程中，酶起着至关重要的作用。
例如，核酸酶能够切割DNA分子，使得DNA的特定区域被切割成不同的碱基序列；而连接酶则能够将不同的DNA片段连接起来，形成新的DNA序列。
此外，一些重组酶还可以通过其催化作用来促进DNA分子的重组。
这些酶的作用在基因重组的过程中起着关键的作用。
3. DNA片段的互补配对在DNA重组的过程中，DNA分子的互补配对起着非常重要的作用。
DNA的双链结构使得其具有互补配对的性质，即A会与T形成氢键，而G则会与C形成氢键。
这种互补配对性质使得DNA片段能够通过互补配对的方式进行连接或重组。
综上所述，基因重组的原理涉及到DNA的结构、酶的作用和DNA片段的互补配对等方面。
通过这些原理，我们可以实现DNA分子中某一段DNA片段的与同一DNA分子或不同DNA分子中的另一段DNA片段重新组合成新的DNA序列。
二、基因重组的方法基因重组的方法主要包括DNA重组、基因克隆、基因组编辑和CRISPR-Cas9等。
这些方法可以分别用于不同的应用领域，并且在现代生物技术中有着重要的价值。
1. DNA重组DNA重组是指通过DNA片段的切割和重组来形成新的DNA序列。
这一方法主要依赖于核酸酶的切割作用和连接酶的连接作用。
dna重组技术的原理
DNA重组技术的原理DNA重组技术是一种可以在实验室中修改DNA序列的方法，它已经在生物学和基因工程领域发挥了重要作用。
本文将详细讨论该技术的原理、应用以及可能的发展方向。
1. DNA重组技术的基本概念DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA片段合并到一个新的DNA分子中，从而创造出具有新的特性的DNA分子的过程。
这一技术可以在DNA分子水平上改变遗传信息，开辟了研究和利用基因的全新途径。
2. 受限酶与DNA重组技术2.1 受限酶的作用原理受限酶是一种能够识别特定DNA序列并切割DNA的酶。
它们在大多数生物体中都有存在，并且具有高度的特异性。
受限酶通过与目标DNA序列配对，形成酶-底物复合物，然后切割DNA，最终产生两个断片。
2.2 受限酶在DNA重组中的应用在DNA重组过程中，受限酶是关键的工具之一。
它们可以切割DNA并产生特定的粘性或平滑末端，使得不同DNA片段可以互相连接。
通过选择合适的受限酶进行切割，可以实现DNA片段的精确拼接和重新组合。
3. DNA连接酶与DNA重组技术3.1 DNA连接酶的作用原理DNA连接酶是一种能够将两个DNA分子连接起来的酶。
它们通过催化连接反应，在DNA分子的末端形成磷酸二酯键，从而将两个DNA分子牢固地连接在一起。
3.2 DNA连接酶在DNA重组中的应用DNA连接酶在DNA重组中起到了至关重要的作用。
通过使用合适的DNA连接酶，可以将经过切割的DNA片段精确地连接在一起。
这种连接可以是同源连接，也可以是异源连接，为进一步的实验提供了更多灵活性。
4. 限制性修饰酶与DNA重组技术4.1 限制性修饰酶的作用原理限制性修饰酶是一类能够识别特定DNA序列并改变其结构或功能的酶。
它们通过在目标DNA序列中引入特定的修饰，如甲基化或磷酸化，来改变DNA的可切割性或亲和性。
4.2 限制性修饰酶在DNA重组中的应用限制性修饰酶可以通过改变DNA的切割特性，进一步调控DNA重组的过程。
DNA重组技术的原理及步骤
DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术是一种分子生物学技术，它通过重新组合DNA分子的特定部分，可以改变生物体的基因组成，从而实现对基因的操作和操控。
DNA重组技术的原理可以概括为：通过酶类作用在DNA链上剪切出特定的片段，再利用DNA连接酶将不同源的DNA片段连接在一起，形成新的DNA分子。
第一步：DNA提取DNA提取是DNA重组技术的前提和基础。
首先需要选择适当的生物样本，如细菌、植物、动物细胞等，利用细胞裂解方法将细胞溶解，释放出DNA。
然后经过蛋白质酶的消化，去除蛋白质、RNA等杂质，最终得到纯净的DNA溶液。
第二步：DNA切割DNA切割是指将DNA分子切割成特定的片段。
这一步骤可以利用限制性内切酶来实现。
限制性内切酶是一种酶类，能够识别DNA链上的特定序列，并在该序列的特定位点上切割DNA链。
通过选择不同的限制性内切酶，可以将DNA切割成不同长度的片段。
第三步：DNA纯化与回收切割后的DNA片段需要通过凝胶电泳分离和纯化。
凝胶电泳是利用DNA片段在电场中的移动速度差异，使不同长度的DNA片段在凝胶中分离的方法。
分离完成后，可以通过抽取单个的DNA片段进行纯化，获得所需的DNA溶液。
第四步：目标片段回收将目标片段从凝胶中回收需要先进行DNA片段的可视化。
一般可以采用亮蓝G染色剂着色和紫外线照射的方式进行可视化，然后使用刮片等方法将目标片段回收。
第五步：DNA连接DNA连接是将目标片段与载体DNA连接在一起，形成重组DNA。
载体DNA一般选择能够稳定复制的质粒或噬菌体基因组。
连接需要使用DNA连接酶，该酶能够识别DNA链的断裂末端，并将目标片段与载体DNA连接在一起。
第六步：转化连接完成后，可以将重组的DNA转移到宿主细胞内。
转移可以通过化学法转化细胞、电穿孔法或者基因枪等方法实现。
转化后的细胞会自主复制并表达被插入的重组DNA。
第七步：筛选与鉴定对转化后的细胞进行筛选与鉴定，以确定是否成功插入重组DNA。
基因工程原理和技术韦宇拓知识点总结
一、基因工程原理1. 基因工程是一种通过改变生物体基因组中的DNA序列，使其具有特定性状的技术。
基因工程可以通过DNA重组、基因敲除、基因编辑等方法来实现。
2. DNA重组是基因工程中常用的手段，其原理是将不同来源的DNA 片段重新组合，形成具有特定性状的基因组。
3. 基因敲除是指通过特定的技术手段，使目标基因在生物体基因组中失去功能。
这种方法通常用于研究基因的功能和作用。
4. 基因编辑是最新的基因工程技术，它利用特定的核酸酶和引导RNA 来精确编辑基因组中的DNA序列，从而实现定点修改基因。
5. 基因工程原理的核心是对DNA序列的精准操作和控制，以实现对生物体性状的调控。
二、基因工程技术1. PCR技术是基因工程中常用的核酸扩增技术，它通过酶的作用使目标DNA片段在体外快速进行多次复制，以获得足够的DNA量进行后续实验。
2. 质粒载体是基因工程中常用的DNA工程载体，它可以在细胞中独立复制，并携带外源基因进行表达或传递。
3. 转基因技术是基因工程的应用之一，它通过导入外源基因到目标生物体中，使其表达特定蛋白或产生特定性状。
4. 基因编辑技术是基因工程的新兴领域，目前主要包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN等技术，它们可以实现基因组的精准编辑和修饰。
5. 基因工程技术的不断发展，为人类生物科学和医学研究提供了强大的工具，也为农业生产和生物制药产业带来了革命性的进展。
三、基因工程在生物科学和医学上的应用1. 基因工程技术在生物科学领域的应用包括基因功能研究、基因组学研究、遗传学研究等，为科学家们提供了解生命的新途径和手段。
2. 基因工程技术在医学领域的应用包括基因治疗、疾病诊断和预防、药物研发等，为人类健康带来了新的希望和可能。
3. 基因工程技术的应用使得人类能够更深入地理解生命的本质和机理，并为未来的生物医学研究和临床应用提供了无限可能。
四、基因工程的伦理和社会问题1. 基因工程技术的发展和应用引发了许多伦理和社会问题，包括基因编辑的道德问题、转基因生物的安全性问题、基因信息的隐私问题等。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程考试 质粒的分子生物学与质粒载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题质粒的分子生物学与质粒载体（练习题）一、填空题1. 基因工程中有3 种主要类型的载体：、、。
2. 由于不同构型的DNA 插入EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA 的泳动速度，OC DNA 泳动速度，L DNA 居中，通过凝胶电泳和EB 染色的方法可将不同构型的DNA 分别开来。
3. 质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点开始的。
然而，质粒的复制可以是向的、或是向的。
在杂种质粒中，每个复制子斑点都可以有效地加以使用。
但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。
并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下的复制起点可能被关闭。
4. 就克隆一个基因(DNA 片段) 来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：、、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。
5. 如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于群，这是因为它们的所致。
6. 质粒拷贝数是指细胞中。
7. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。
8. 酵母的2μm 质粒有，可以配对形成哑铃结构。
9. 一个带有质粒的细菌在有EB 的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫。
10. pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。
11. 粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过恢复该基因的性状。
12. ColEl 质粒复制的起始需要三种酶，即、和。
13. YAC 的最大容载能力是，BAC 载体的最大容载能力是。
14. pSCl01 是一种复制的质粒。
15. 把那些没有可检测表型的质粒称为。
16. 转座子主要由下列部分组成：(1) (2) (3) 。
17. pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC 系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
基因工程与重组DNA技术
基因工程与重组DNA技术随着科学技术的不断发展，基因工程与重组DNA技术在生物学领域中起到了至关重要的作用。
本文将就基因工程与重组DNA技术的基本概念、原理与应用进行探讨，并着重介绍其在医学、农业和环境领域的具体应用。
一、基因工程与重组DNA技术的基本概念及原理基因工程是指通过对生物体的基因进行重新组合、修饰和转移，改变其遗传性状的技术手段。
而重组DNA技术则是基因工程中最主要的技术手段，其主要原理是将不同生物种类中的DNA分子进行切割、拼接与复制，形成具有新功能的DNA分子。
重组DNA技术主要包括以下几个步骤：首先，利用限制性内切酶切割源DNA和载体DNA，得到切端具有互补碱基序列的DNA片段；然后，通过DNA连接酶将源DNA片段与载体DNA片段连接成重组DNA；最后，将重组DNA转入宿主细胞，使其进行表达。
二、基因工程与重组DNA技术在医学领域的应用1. 基因诊断与基因治疗基因工程与重组DNA技术为医学诊断提供了新的手段。
通过基因诊断技术，可以对遗传性疾病进行准确的检测，帮助医生确定疾病的遗传风险。
而基因治疗则利用重组DNA技术将正常的基因导入患者体内，修复或替代受损基因，从而治疗一些难以根治的遗传性疾病。
2. 药物研发与生产基因工程与重组DNA技术在药物研发与生产中发挥着重要作用。
通过重组DNA技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，如胰岛素、生长激素等，用于药物的制备。
此外，基因工程还为新药的研发提供了新的途径，可以通过改变药物的基因结构，使其更加高效、安全。
三、基因工程与重组DNA技术在农业领域的应用1. 转基因植物的培育通过基因工程与重组DNA技术，可以向植物中导入具有特定功能的基因，使其具备抗虫、抗病、耐旱等性状，提高作物的产量和品质。
例如，转基因水稻具有抗虫性，可以减少农药的使用，降低环境污染。
2. 新品种的选育基因工程与重组DNA技术为农业科学家提供了选育新品种的利器。
通过转基因技术，可以将植物或动物中具有抗病、耐逆等性状的基因导入到目标物种中，从而提高其产量和品质，满足人们不断增长的食品需求。
基因工程生物知识点
第一章基因工程基因工程是狭义的遗传工程，遗传工程的核心是构建重组DNA分子。
基因工程也称为“重组DNA技术”。
第一节工具酶的发现和基因工程的诞生基因工程的理论基础：DNA是遗传物质，DNA的双螺旋结构，以及遗传信息的传递方式。
基因工程的技术保障：限制性核酸内切酶，DNA连接酶和质粒载体发现与应用。
一、限制性核酸内切酶：能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。
（平末端和黏性末端）限制性核酸内切酶可作为切割DNA分子的手术刀，它的发现和应用，使DNA重组成为可能。
二、DNA连接酶：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成的DNA分子称为重组DNA分子。
DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用。
三、质粒：能够自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于大型DNA分子之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质。
最常用的是大肠杆菌的质粒，其含有抗生素抗性基因。
标志基因工程诞生的试验：通过重组，使大肠杆菌同时具有四环素和卡那霉素的抗性。
四、基因工程的载体载体是运载外源DNA进入宿主细胞的车子，即运载工具。
除质粒外，基因工程载体还有入噬菌体、植物病毒和动物病毒。
入噬菌体：将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞。
植物病毒：将外源基因带入植物细胞。
动物病毒：将外源基因带入动物细胞。
第二节基因工程的原理和技术基因工程的基本原理是让人们感趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达。
基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体和宿主细胞。
基因工程的基本操作步骤：A目的基因的获得；B重组DNA的形成；C重组DNA导入受体细胞（宿主细胞）；D筛选含有目的基因的受体细胞；E目的基因的表达。
一、获得目的基因目的基因序列已知：化学合成方法合成目的基因，PCR扩增目的基因。
目的基因序列未知：构建基因文库。
二、形成重组DNA分子用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体，两者形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。
重组DNA技术与基因工程
第一代基因工程：蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程
切
接
转
增 检
第二代基因工程：突变蛋白和融合蛋白定制 蛋白质工程
gain of function
loss of function
根据同源基因序列整理生物进化树 GGTATCGTCATCTACTACGTGGCAAT
规模化生产生物活性物质
采集/培养
天然细胞
组织工程
基因工程
基因工程 蛋白质工程 途径工程
天然细胞
干细胞
工程干细胞
分离工程
组织工程ห้องสมุดไป่ตู้
分离工程 酶
酶工程
工程细胞
第四代基因工程：基因组工程 全基因组定点编辑
基因组工程的另一项最新进展是利用CRISPR-Cas9系统在哺乳动物活细胞内对 基因组上的各基因进行定向敲除，并由此建立起基因与表型之间的因果关联。在该系 统中，细菌来源的核酸内切酶Cas9能在短小单链RNA（sgRNA）的指导下，序列特 异性地定位并作用于复杂基因组上，从而实现对哺乳动物大型基因组各区域的功能查 询。T. Wang et al. Science 343, 80, 2014；O. Shalem et al. Science 343, 84, 2014
实验生物学
重组DNA技术与基因工程
重组DNA技术与基因工程
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念 2 重组DNA技术所需的基本条件 3 重组DNA6 外源基因在酵母中的表达
《基因工程》
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A
A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起
始密码
B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
基因的针线──DNA连接酶
作用：将互补配对的两个黏性末端缝隙 连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
作用实质
是否需模板
连接 DNA链
DNA连接酶
DNA聚合酶
都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键
不需要
需要
双链
单链
作用过程
在两个DNA片段之间形 成磷酸二酯键
（1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的
蛋白质含量。如“向日葵豆”植株。 （2）抗逆性品种
将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐 碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物 体内，将从根本上改变作物的特性。如转基 因抗虫棉。
二、动物基因工程前景广阔
——动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等
哪些转基因作物已进入大规模商业化 应用阶段? 转基因大豆、玉米、棉花和油菜
(一)抗虫转基因植物
1.虫害给农作物带来了哪些影响? 传统农业如何防治害虫? 有哪些不足?
2.现在已有哪些抗虫植物问世?
3. 抗虫基因
Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、
淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 请阅读P18生物资料技术卡,了解一些抗虫 基因的抗虫机理。
重组DNA技术
载体DNA分子，需要具备：
– 具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制
– 具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每 一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。 这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基 因内
基因工程重要特征：
• 可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以 任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状
• 某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可 能
基因工程技术路线
• DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） • DNA片段和载体的连接——重组体DNA • 外源离
重组DNA技术（基因工程）
• 基因工程 • 基因工程的风险和伦理学问题
基因工程
• 基因工程概述 • 基因工程的相关技术 • 基因工程的工具酶 • 载体 • 基因工程genetic engineering
• 基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因 工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平， 如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。 狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。
细菌质粒载体
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能 自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子 ☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制 后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个 ◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它 们仅能用于克隆分子量小于10kb( 1000bp =1kb)的外源DNA 片段 ☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检 测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒 是否携带外源DNA片段
基因工程实验原理
基因工程实验原理
基因工程实验的原理是基于对生物体基因组的修改和重组，旨在增加或改变生物体的特性。
下面将介绍几种常见的基因工程实验原理：
1. 基因克隆：该实验原理是将所需基因从一个生物体中剪切并插入到另一个生物体的染色体上，使目标基因能够在新宿主中表达。
2. 限制性内切酶消化：该实验原理是利用限制性内切酶切割目标DNA，创建具有粘性末端的DNA片段。
然后，可以通过连接这些片段来构建重组DNA。
3. 反转录和cDNA合成：这个实验原理是利用逆转录酶将RNA转录成DNA，即cDNA（互补DNA），然后将其克隆到表达载体中。
4. 基因敲入和敲除：该实验原理是通过CRISPR/Cas9系统或其他方法，有针对性地切割或改写目标基因，从而敲除或敲入特定的DNA片段。
5. 转基因技术：这是将外源基因导入到目标生物体中，使其表达或增强特定的功能。
转基因技术的原理可以是通过基因枪、农杆菌介导的转化等手段。
这些实验原理是基因工程研究中常用的方法，可以用于改良农
作物、生产药物、开发生物燃料等领域。
在实验过程中，研究人员需要仔细设计实验方案，并根据具体需求选择适当的方法。
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题噬菌体载体(练习题)一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。
2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。
它有一个复制起点，进行向复制。
λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为个，取代型为个。
8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)(2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为kb，后者为kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。
DNA重组
6.2 位点特异性重组
位点特异性重组是指发生在DNA特异性位点上的重组。参与 重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合。尽管在许多情 况下，它也需要在重组位点具有同源的碱基序列，但同源的碱基 序列较短。
位点特异性重组既可发生在2个DNA分子间，也可以发生在 1个DNA分子内部。前一种情况通常会导致2个DNA分子间发生 整合或基因发生重复，而后一种情况则可能导致缺失或倒位。
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图6-15 第一类转座子的结构
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图6-16 第一类转座子的转座机制
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6.3.1.2 第二类转座子
称为复杂转座子(complex transposon)，含有转座酶基因、 解离酶(resolvase)基因以及抗生素抗性基因，两端为反向重复， 无插入序列。
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同源重组的条件 (1) 在进行重组的交换区域含有完全相同或几乎完全相同 的核苷酸序列； (2) 两个双链DNA分子之间需要相互靠近，并发生互补配 对； (3) 需要特定的重组酶(recombinase)催化，但重组酶对 碱基序列无特异性； (4) 形成异源双链(heteroduplex)； (5) 发生联会(synapsis)。
两翼往往是两个相同 或高度相似的IS序列
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• 复合型转座子很可能是通过一个插入序列的拷贝插在 附近区域而形成的。
• 两个插入序列中间夹着一段序列即可构成一个转座单 位。
• 每个插入序列两端为反向重复，因此，无论两插入序 列处于正向还是反向位置，作为转座单位其两端均有 可被转座酶识别的反向重复序列。
噬菌体的重组位点为attP(POP')，其中也有与大肠杆菌相同 的保守区O。
基因工程原理 2
1.重组DNA技术:又称遗传工程，用人工手段在体外改造，重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。
这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。
2.遗传作图（genetic mapping）：是指应用遗传学技术构建能显示基因以及其他序列待征在基因组上位置的图。
3.克隆：一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因结构相同的细胞或个体。
对于基因克隆，则指一个基因反复扩增后产生的多个拷贝。
4.穿梭载体：在不同类型受体细胞(如酵母与细菌、细菌与动物细胞等)中都能够进行复制的克隆载体。
5.表观遗传（epigenetics）：是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。
这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。
途径是通过修饰基因、控制基因、蛋白质的功能和特性等；更能通过细胞周期及增值周期去影响基因变化的现象。
6.中心法则(genetic central dogma)：克里克于1958年提出的阐明遗传信息传递方向的法则，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。
也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。
这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。
在某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。
7.等位基因:在一对同源染色体的同一基因座上的两个不同形式的基因。
等位基因控制相对性状的显隐性关系及遗传效应。
8.焦磷酸测序：是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法。
依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放，而非双脱氧核苷三磷酸参与的链终止反应。
DNA重组技术与基因工程
DNA重组技术与基因工程DNA重组技术和基因工程是现代生物学中的两个重要领域，它们的发展和应用对于人类的生活和健康有着重要的影响。
DNA重组技术是指通过人为干预改变DNA分子的组合和结构，以实现对基因的精确操控和改造。
而基因工程则是利用DNA重组技术对生物体的基因进行改造和调控，以实现特定的目的。
DNA重组技术的出现和发展，标志着人类对生命的探索和理解进入了一个新的阶段。
通过DNA重组技术，科学家们可以将来自不同物种的基因进行组合，创造出具有新功能和特性的生物体。
这种技术的应用范围非常广泛，从农业领域的作物改良，到医学领域的药物研发，都离不开DNA重组技术的支持和推动。
在农业领域，DNA重组技术和基因工程为作物的育种和改良提供了全新的手段。
通过将具有抗虫、抗病等特性的基因导入作物中，科学家们可以提高作物的产量和抗逆性，减少对农药的依赖，从而实现可持续农业的发展。
例如，转基因玉米、大豆等作物的广泛种植，大大提高了农作物的产量和品质，为解决全球粮食安全问题做出了重要贡献。
在医学领域，DNA重组技术和基因工程的应用也带来了革命性的变化。
通过将具有治疗性基因的载体导入人体细胞中，科学家们可以研发出基因治疗药物，用于治疗一些难以根治的遗传性疾病。
例如，基因工程药物“重组人胰岛素”可以有效治疗糖尿病，提高患者的生活质量。
此外，基因工程技术还被应用于疫苗的研发和生产，为人类防控传染病提供了新的手段。
然而，尽管DNA重组技术和基因工程在农业和医学领域的应用带来了巨大的好处，但也引发了一些争议和担忧。
一方面，人们担心基因工程可能对生态环境和人类健康造成潜在风险。
例如，转基因作物可能对生态系统产生不可预测的影响，而基因治疗药物可能导致不良反应和副作用。
另一方面，人们对基因工程的伦理和道德问题也有所担忧。
例如，基因编辑技术的出现引发了对人类基因改造的争议，人们担心这种技术可能导致人类基因的滥用和不可预测的后果。
面对这些争议和担忧，科学家和决策者需要进行深入的研究和评估，以确保基因工程的安全性和可持续性。
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缓冲液系统
标准缓冲液的组成： MgCl2（或醋酸镁） NaCl（或KCl） Tris-HCl ß-巯基乙醇（或二硫苏糖醇DTT）
反应温度：大多数是37℃，少数或高或低
3.1.5 限制性核酸内切酶的Star活性
Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件 下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。
5’-AGGAGG-3’
SD序列
Pribnow box
SD序列：
在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤 的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻
译。
1974年，由J.Shine和L.Dalgarno发现
Shine-Dalgarno sequence; SD sequence
复制子
从复制起始点开始复制出的一个DNA分子或一个DNA片 段的核苷酸序列。
复制子的数量
原核生物的染色体DNA：单个 真核生物染色体DNA：多个 质粒DNA：单个、多个
1.4 DNA转录启动子和转录区的结构
启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始 复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结 合位点。
• 种类：500多种
• 作用：把外源DNA切割成片段。
第一型（Type I）：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解 第二型（Type II）：只催化非甲基化的DNA的水解 第三型（Type III）同时具有修饰及认知切割的作用
限制性内切酶的命名和书写：
Haemophilus influenzae d
• 限制性核酸内切酶 • DNA连接酶和激酶
• DNA聚合酶和RNA聚合酶
• DNA和RNA修饰酶。
一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶 (Restriction endonuclease, RE）
——指能够识别双链DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每条链的 一个磷酸二酯键断开的核酸内切酶。 • 来源：原核生物
2. DNA聚合酶I催化的反应
(1)聚合反应:5’→3’方向
• DNA聚合酶I催化的聚合反应是在引物链3’-OH与dNTP
分子的-P-基团间.
• dNTP接上后,又提供了1个3’-OH末端,继续连接dNTP分 子. • 合成方向是5’ →3’
PPi
引物
模板 DNA聚合酶I的聚合反应机理
(2) 5’ →3’核酸外切酶活性:
5’-AGGAGG-3’
SD序列
Pribnow box
1.5 DNA转录终止子（transcription terminator）
终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵组末端的DNA片段，可中断 转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括： •本体转录终止子（Intrinsic transcription terminators）：
依次加入： 13 mL蒸馏水
2 mL 10x缓冲液 4 mL 底物DNA 1 mL RE
混匀离心 37℃，1-3小时
升温，使酶失活 （65℃10-15min）
除去酶蛋白
底物DNA：
• • • • • DNA纯度 DNA分子构型 识别位点侧面序列 位点偏爱 DNA甲基化
酶的用量
酶的活性 底物DNA：位点数量
BamH I：5' G^GATCC 3‘ Bcl I： 5' T^GATCA 3‘ Bgl II ： 5' A^GATCT 3'
3.1.3 限制性核酸内切酶切割DNA的位点
• 多数在识别序列内部。
• 环形DNA切割后的片段数：N
线形DNA切割后的片段数：N+1
• DNA片段末端种类： 粘性末端：磷酸二酯键断裂位置是交错的
原核生物DNA的复制
解旋酶
单链结合蛋白
DNA拓扑异构酶 引物酶 DNA聚合酶 DNA连接酶
/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20877
真核生物DNA的复制
/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20876
• 1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分离出来。 • 由大肠杆菌基因polA编码， • 单链多肽蛋白质。 • 分子量：109 kD • 球形，Φ65埃
1. DNA聚合酶I反应需要的条件:
• 全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg++.
dATP
dCTP dTTP dGTP • 带有3’-OH游离基团的引物链.
平末端：断裂位置在对称轴
• 切割位点表示方法
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
可以表示为： 5’-CTGCA ↓ G-3’
3.1.4限制性核酸内切酶反应系统
例： Bgl Ⅱ对λDNA的消化
反应总体积：20微升
酶的用量
缓冲液的组成与酶的种类有关
反应时间1-3小时。
限制性酶切反应一般流程
• 质粒DNA：用于构建基因克隆载体 • 线粒体DNA：呼吸作用的基因 • 叶绿体DNA：光合作用的基因
1.7 天然DNA的的提取
合适的生物材料——裂解细胞——分离DNA——纯化核检测
（1）大肠杆菌源质粒DNA的提取 （2）λ噬菌体DNA的提取
（3）氯化铯法制备植物基因组DNA
（1）大肠杆菌源质 粒DNA的提取
基因工程原理
Principle of Gene Engineering
第一章 第一节
第二章
基因工程原理
第二章 DNA重组
第一部分 DNA的组成和结构
1.1 DNA的组成
1.2 DNA的空间结构
线形DNA： 环形DNA：
1.3 DNA复制
半保留复制方式
复制起始位点（replication origin site）
富含GC
回文序列：双链DNA中含有的两个结构相同、方向相反的序列称为反向 重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成局部“十”字形结构。这 段序列被称为回文序列。
1.6天然DNA的来源和用途
——存在与生物体内的DNA
• 染色体DNA：分离目的基因的主要材料，1000～106kb
• 病毒DNA：用于构建基因克隆载体,T4、λ…
DNA片段末端修饰后进行连接 •DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 •粘性末端修饰成平末端后连接
•DNA片段5’段磷酸化作用后连接
DNA片段末端同聚物加尾后进行连接
粘性末端修饰成平末端后连接
DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
5
三、DNA聚合酶
——催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为
粘性末端0.1unit
——ATP：10μmol/L—1mmol/L ——buffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSA
3.2.4 DNA片段之间的连接方式
• 具互补粘性末端片段之间的连接 • 具平末端DNA片段之间的连接 • DNA片段末端修饰后进行连接
具互补粘性末端片段之间的连接
具平末端DNA片段之间的连接
DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性 5’ 3’ 切去1个5’核苷酸
3’ 5’
3’ 5’
3’-OH 5’-P DNA聚合酶I 的聚合活性 nick 5’ 3’ 在3’-OH上加上新的核苷酸 3’-OH 5’-P
32P标记的核苷酸
制备高比活的DNA探针
典型的反应体系：
•25µl
DNaseI切断DNA链 切出1个缺口 DNA聚合酶I 5’-3’核酸外切酶活性 在5’端切去1个核苷酸 DNA聚合酶I 的聚合活性 在3’-OH加上1个32P标记的核苷酸
3’ 5’
DNA连接酶
5’ 3’
3’ 5’
3.2.1 DNA连接酶的作用机理
nick
（2）酶-AMP复 合物中的AMP与 DNA链上的5’P结 合，形成DNA-腺 苷酸复合物，P活 跃起来 （1）DNA连接酶与 辅助因子ATP或 NAD+反应,生成酶-腺 苷酸复合物.
（3）3’OH对活跃 的P作亲核攻击， 结果形成磷酸二酯 键。
3.2.2 目前常用的DNA连接酶Biblioteka E.coli DNA 连接酶
√ × √ √（但效率较低）
T4 DNA 连接酶
3.2.3 DNA连接酶作用条件
• 1条DNA链具有3’-OH,另1条DNA链具有5’-P,而 且3’-OH 与5’-P是相邻的. • 3’-OH 与5’-P位于与互补链上的互补碱基配对 的两个脱氧核苷酸的末端.
49000/4096=12次。
实际上，仅出现6次。
• 同裂酶(isoschizomer)---来源不同,但识别同样的核苷酸靶子
序列.
例如:Hpa II和Msp I的识别序列都为
5'...C^C G G...3' 3'...G G C^C...5'
• 同尾酶(isocaudamer)----来源不同,识别的核苷酸靶子序列不 同,但产生相同的粘性末端. 例如:Bam HI, Bcl I, Bgl II是一组同尾酶切割后的末端是GATC.
Hind III
细菌属名 细菌种名 菌株 酶编号
RE的功能:
• 防御外源DNA感染,利于遗传的稳定性
• RE抑制了细菌种属间的交叉繁殖,但甲基化酶的某些误 差,又使得不同菌株间DNA的重组成为可能,利于生物的 进化.
RE的发现：
1968年,从大肠杆菌中分离到了I型RE,
1970年,从大肠杆菌中分离到了II型RE
4
二、DNA连接酶
3.2 DNA连接酶
DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’-OH和5’-P基团末
端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。如果是两个或两个以上不同双