桑粒肩天牛肠道纤维素分解细菌的分离和鉴定

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纤维素分解细菌的分离和鉴定

纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。

3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。

4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。

二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。

应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。

由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。

将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。

用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。

三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。

：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。

无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。

把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。

NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。

纤维素菌分离和鉴定的方法

纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。

特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。

对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。

纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。

纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。

多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。

纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。

实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。

可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。

（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。

先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。

（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。

稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。

（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。

此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。

菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。

常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。

（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。

纤维素分解细菌的分离和鉴定1`

[10 ]
进行多序列比对并构建系统发育树。
革兰氏染色菌体形状 Gram’ s Bacterial
staining shape
荚膜
+ + +
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
芽孢运动性
+ + +
菌体大小
Bacteria μ size ∥ m 1. 0～1. 5 × 1. 8～2. 8 1. 2～1. 5 × 2. 0～2. 5 1. 0～1. 5 × 2. 5～3. 2
图1 菌株 WH 12 对滤纸的降解
Fig. 1 The degradation of filter paper with strain WH 12
将获得的 PCR 产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1. 7. 3 序列比对与系统发育树的构建。将测得的 16S rDNA
表1 3 株纤维素降解菌的个体形态观察结果
对3株菌在复筛培养基上15进行形态观察结果见表2菌株wh12对滤纸的降解fifilterpaper株纤维素降解菌的个体形态观察结果tablndividualmorphologicalobservatihreestrainscellulosedegradingbacteri菌种strai革兰氏染色grastaining菌体形状bacterialshape荚膜capsula芽孢gemma运动性motility菌体大小bacteri株纤维素降解菌的菌落形态观察tablcolonialmorphologicalobservatihreestrainscellulosedegradingbacteri菌种strai大小sizemm颜色color干湿状况drywetconditions形状shape高度height透明度transparency边缘edgewh1扁平半透明整齐wh3扁平半透明整齐wh12不规则圆凹下近透明整齐可见3株菌具有不同的菌落形态

生物选修笔记-分解纤维素的微生物的分离汇总

生物笔记分解纤维素的微生物的分离一、纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，至少3种组分，即G酶，Ｃx酶和葡萄糖苷酶，在三种酶的共同作用下，纤维素最终被分解成葡萄糖。

二．纤维素分解的筛选在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

湿地被誉为地球的“肾脏”受精的标志：在卵黄膜与透明带之间有2个极体的出现受精完成的标志：雌雄原核的融合DNA是遗传物质的载体。

染色体是基因的主要载体。

细胞膜的流动镶嵌模型由桑格和尼克森提出。

糖被（糖蛋白）作用：消化道和呼吸道上皮细胞表面的糖蛋白有保护和润滑作用，与细胞表面的识别有密切关系。

酶本质的探索法国巴斯德提出酿酒中的发酵是由于酵母细胞的存在。

德国李比希认为引起发酵的是酵母细胞中的某些物质，但这些物质只有在酵母细胞死亡并裂解后才能发挥作用。

德国毕希纳将酵母细胞中引起发酵的物质成为酿酶。

美国萨姆纳证明脲酶是蛋白质。

唾液pH为⒍2～⒎4 胃液的pH为0.9～1.5 小肠液pH为7.6动物体内的酶pH为6.5～8.0 植物pH为4.5～6.5植物组织培养的应用：1.快速繁殖花卉和蔬菜等作物。

2.拯救珍惜濒危物种。

3.结合基因工程培养作物新类型。

由碱基转录翻译成氨基酸，一般不考虑终止密码子。

克里克是第一个用实验证明遗传密码中3个碱基编码1个氨基酸的科学家。

基因突变在光学显微镜下是无法直接观察到的，而染色体变异却可以。

达尔文的自然选择学说揭示了生命现象的统一性是由于所有生物都有共同的祖先，生物的多样性是进化的结果。

河流：物理沉降、化学分解和微生物的分解。

人工建造“生态屏障”、“三北防护林”有效地防风阻沙。

恢复生态学主要利用的是生物群落演替理论。

植物激素：“激素杠杆”受精过程：精子穿越放射冠和透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。

纤维素分解菌的筛选与鉴定

纤维素分解菌的筛选与鉴定作者：张海艳王文磊韩锰来源：《安徽农业科学》2020年第15期摘要[目的]高效利用纤维素资源，保护生态环境。

[方法]利用刚果红染色法从土壤中筛选出高效纤维素降解菌且对其进行形态学和分子学鉴定。

[结果]菌株Ⅰ的纤维素酶活力0.005 3 U/mL，与Bacillus pumilus strain 35的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus WL-1，为革兰氏阳性菌。

菌株Ⅱ的纤维素酶活力0.0059 U/mL，与Bacillus pumilus strain BAB-1322的亲缘关系为99%，命名为Bacillus pumilus;WL-2，为革兰氏阳性菌。

[结论]筛选的纤维素分解菌具有较强的纤维降解能力，可有效提高纤维素资源的开发利用。

关键词土壤;纤维素分解菌;筛选鉴定;纤维素酶活力中图分类号X172文献标识码A文章编号0517-6611（2020）15-0001-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Screening and Identification of Cellulose Decomposing BacteriaZHANG Haiyan， WANG Wenlei， HAN Meng（Department of Life Science， Luoyang Normal University， Luoyang， Henan 471934）Abstract[Objective]To make efficient use of cellulose resources and protect the ecological environment. [Method]Congo red staining was used to screen highefficient cellulosedegrading bacteria from soil and identify them morphologically and molecular. [Result]The results showed that the cellulase activity of strain I was 0.005 3 U/mL and its relationship with Bacillus pumilus;strain 35 was 99%. The strain I was named Bacillus pumilus;WL1， which was grampositive. The cellulase activity of strain II was 0.005 9 U/mL and 99% of its relatives with Bacillus pumilus;strain BAB1322. The strain II was named Bacillus pumilus;WL2 and was grampositive. [Conclusion]The cellulosedecomposing bacteria screened in this study have strong cellulosedegrading ability and can effectively improve the development and utilization of cellulose resources.Key wordsSoil;Cellulose decomposing bacteria;Screening and identification;Cellulase activity基金项目河南省高等学校重点科研项目（19A180023）。

Bt杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究

·6· germ a ri (Hope)幼虫
何伟等 : B t杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究
1. 1. 2菌株和质粒 :见表 1。
菌株或质粒 Escherich ia coli JM109 Escherich ia coli TG1 - 7911 Escherich ia coli TG1 - 305a p lasm id pMD - 18T p lasm id pHT305a p lasm id pHT7911 S taphylococcus haem olyticus Ag06 S taphylococcus hom is Ag08 S taphylococcus haem olyticus Agv06 S taphylococcus hom is Agv08
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
氨基酸和生物资源
·7·
宿主菌生长特性影响的测试参考李林 [ 18 ]方法对转入宿主菌中的外源质粒
us) Ag06菌株和人葡萄球菌 (S taphy lococcus hom is) Ag08菌株。从中筛选菌株 S. haem oly ticus Ag06进行质粒消除后作为出发菌
株 ,利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力 B t杀虫基因 cry3A 的 Escherichia coli - B acillus thu ringiensis穿梭表达
收稿日期 : 2008 - 03 - 31 作者简介 :何伟 ,男 (1983 - )硕士研究生 ,从事微生物利用研究。
E - mail: hewei2005cq@163. com 3 通讯作者 E - mail: ypy128@ sina. com 基金项目 :重庆市自然科学基金 (渝科发计字 2002, 17号 ) ;

肠道病原菌的分离与鉴定实验报告

肠道病原菌的分离与鉴定实验报告摘要本实验旨在分离、鉴定肠道病原菌，并深入了解肠道病原菌对人们健康的影响。

本实验采用选择性培养基和生化试剂对样品进行处理和鉴定，最终成功分离出大肠杆菌、沙门菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等肠道病原菌。

引言肠道病原菌是导致肠胃疾病的主要病因之一。

一些细菌和病毒都可引起肠道感染，导致腹泻、呕吐、腹痛等不适症状。

有些肠道病原菌很难通过常规的培养方法进行分离和鉴定，因此对于其鉴定至关重要。

在临床和实验室中，肠道病原菌的鉴定是非常重要的。

在本实验中，我们将通过选择性培养基和生化试剂来分离和鉴定肠道病原菌。

材料与方法实验所需材料：-食品样品（牛肉、猪肉、家禽产品等）-选择性培养基（MacConkey agar, SS agar, XLD agar）-氯霉素（50μg/ml）-β-半乳糖苷酶-生化试剂（甲基红、青田霉素、麦芽糖、尿素、甲酸氢钠、甲酸亚铁、碳酸氢铵、硫代硫酸钠、氧化亚铁、硫酸铜、氯化铵、硝酸钴、聚苯乙烯乳胶、过氧化氢）实验步骤：1. 食品样品的处理：将样品切成小块，加入100 ml的含氯霉素（50μg/ml)的生理盐水中，放在室温下搅动10分钟，再将悬浮液离心10分钟，取沉淀制备10倍连续稀释液备用。

2. 分离培养：取三个不同的选择性培养基MacConkey agar、SS agar和XLD agar，分别接种均匀悬浮液并用无菌环展开，然后使其在37℃恒温箱中孵化24小时。

3. 生化识别：观察菌落的形态、颜色和表面涂膜，并用生化试剂行革兰染色、甲基红反应、青田霉素试验、尿素酶试验、甲酸氢钠氧化试验、甲酸亚铁还原试验、碳酸氢铵水解试验、硫代硫酸钠还原试验、氧化亚铁试验、硫酸铜凝集试验、氯化铵水解试验、硝酸钴试验、聚苯乙烯乳胶凝聚试验和过氧化氢试验，根据结果进行分类鉴定。

结果经过实验分离和鉴定，本实验成功分离出大肠杆菌和沙门菌等常见的肠道病原菌，并且还分离出一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定

清洁的生物质能成为人们关注的热点，中燃料乙醇其
工业在世界范围内得到了广泛的发展，以大量木质而
纤维素生物质材料为基础的燃料乙醇行业更是热点中的焦点。
护作用，增加酶与底物的接触面积，而提高酶解的效从
圈
２０ｏ７ｏ亿亏与耋助Ｚ程０，Ｉ．Ｃ１Ｖ．Ｎ７ｈ２
ｅｓｒ＆Ｂｉｅｇｎｅｉｇｍｉｔｙｏｎｉｅｒｎ
桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定
刘晨娟蔡。皓李。庆喻子牛。（．中农业大学生命科学技术学院农业微生物学国家重点实验室微生物农药国家工程研究中心，１华湖北武汉４０７；．中农业大学理学院，北武汉４０７）３００２华湖３００
００３Ｕ・ｍＬ（８ｈ，．６３Ｉ４）没有检测到过氧化物酶（ｉ）Ｌｐ活力。
关键词：粒肩天牛；桑筛选；维素；质素纤木
中图分类号：３．Ｑ９９１文献标识码：Ａ文章编号：６２５２（０００ —０６ —０１７ — ４５２１）７０６３
近年来，全世界对能源的需求量急剧增加，速了加
对有限的不可再生矿物能源的消耗。因此，再生的、可
高度结晶的特性，需要进行适当的预处理，以降低纤维素的结晶度，加纤维原料的多孔性，增脱除木质素的保

牛粪中纤维素分解性细菌的分离筛选试验

进一步确定。
２形态学观察．２革兰氏染色后镜检，纤维分解细菌从形态特征、染色特征和分解纤维素的功能上看，可能属于纤维单胞菌属，有时见到细菌的革兰氏阳性的梭
菌，革兰氏阳性，偏端芽孢，长约１～．ｍ的短．３ｇ５０
小梭菌，多单在，偶有２３菌体相连，有芽孢。～个注：菌圈直径１．～０ｎｌ者为高度敏感：径１、－５抑５１２ｌｌｒ直０１１每ｍｌ肉汤培养物约含７０－ ×１９Ｆ（ｏｏｇｎｌ者为中度敏感：直径在１ｍｍ以下者为耐药。 ×１８４０ＣＵＣｌｎｌｌｒ０ＦｒｎｉｏｍｉｇＵｎｔ菌落形成单位）。３关于该细菌与反刍动物营养的关系．２２３生化鉴定纤维素分解性细菌在牛粪中的存在与分布很通过分离菌生化试验结果，以得出该细菌符普遍，阳性个体非常多。本实验从１牛粪样品可０份合纤维单胞菌属中的细胞纤维单胞菌的特征。纤维中分离出８份阳性结果，分离率８％。０牛粪内容物化纤维单胞菌已被认为是一些分解纤维素细菌的中纤维分解性细菌的含量多少是和畜体营养膘情同物异名，在文献中都有不同的报道（结果见表１。有直接关系的。经过初步的观察与分析，牛粪样品）表１分离菌生化试验结果中能分离出阳性细菌所代表畜体的营养膘情显然是优良等级的。而分解菌是阴性的所代表畜体的营项目阳性率（％）项目阳性率（％）养膘情显然是瘦弱等级的。而在８份阳性样品中纤葡萄糖１０（０１）松三糖０１／００（／００１）维素分解性细菌数目多的畜体的营养膘情显然要乳糖０（／００１）硫化氢０（／００１）好于含菌少的畜体。这种现象的原因机制是纤维素麦芽糖１０（ｏｌ）０１／靛基质１０（０１）００１／０分解性细菌多的反刍动物瘤胃对秸杆类饲草的营甘露醇６（／０纤维二糖１０（０１）０６１）０１／０养转化率高，从而反刍动物的瘤胃对纤维素的利用蔗糖１０（ｏｌ）０１，０明胶０（／００１）效果好，这样的反刍动物的营养膘情一般是优良等阿拉伯糖４（／）０４１０鼠李糖１０（０００１／）１级。同样道理反刍动物瘤胃中含此菌少，胃营养瘤山梨醇１０（０１）运动力０１／０６（１）０６０／转化率就低，那么就会造成动物营养吸收不良，该 ’ 动物的营养膘情为瘦弱等级。据有关报道：在人工尿素酶３（／００３１）斗乳糖１０（０１）０１／０条件下，果能提高纤维分解菌的生活条件可大大如水扬素７（／０精氨酸脱羧酶１０（０１）０７１）０１／０提高该细菌群体对该秸杆类饲草的转化率，其粗使鸟氨酸脱羧酶４４１）０（／０ＶＰ试验０（／８０１）蛋白由５ｏ％提高到２．２粗脂肪由０６％提高．０４６％，．７２药敏试验．４到１．％。所以加强这方面开发，在提高反刍动２５０贴药敏片的培养基经３￣７Ｃ培养２，其中头４ｈ物的生产性能研究中将是一个突破点，具有很好的孢呱啊、氟哌酸、头孢唑啉、丁胺卡那敏感率高，临床应用前景。而头孢呋新、青霉素等药物的敏感性较低（结果见３关于药敏试验－３表２。）实验结果显示该菌对头孢呱啊、哌酸、氟头孢唑啉、３小结与讨论丁胺卡那敏感率高，而对头孢呋新、青霉素、等药３１关于细菌的筛选．物的敏感性较低。从这一结果可以得到启示，反刍本实验在国内首次使用了无机盐纤维素琼脂动物服用抗生素时，如果头孢呱啊、氟哌酸、头孢平板培养基对牛粪中的纤维素分解性细菌进行分唑啉、丁胺卡那类药物服用过多，将会大量杀死该离，由于在此培养基中只有纤维素分解性细菌能够菌，从而阻碍该细菌对纤维素的分解。如果这种情利用其中物质进行存活，所以３７～后从该培养基中况时间过长，就会造成反刍动物的一些消化系统疾

一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810315353.9(22)申请日 2018.04.10(71)申请人福建农林大学地址 350000 福建省福州市仓山区建新镇上下店路15号(72)发明人胡霞　张飞萍　李明　吴松青　梁光红　王荣　罗巧玉　陈昊　(74)专利代理机构北京高沃律师事务所 11569代理人刘奇(51)Int.Cl.C12N 1/02(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)(54)发明名称一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法(57)摘要本发明提供了一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，属于微生物技术领域。

将松墨天牛幼虫的后肠道进行研磨，得到原始菌液，将原始菌液经过梯度稀释，分别涂布在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的4号培养基上有氧培养，得到的单菌落进行形态观察和分子鉴定。

本发明提供的方法从松墨天牛幼虫中后肠肠道中分离出154株具纤维素酶活性的细菌，分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种。

所述分离鉴定方法为揭示肠道细菌与松墨天牛的互作关系提供理论基础。

权利要求书2页说明书11页附图2页CN 108865888 A 2018.11.23C N 108865888A1.一种松墨天牛幼虫肠道中纤维素降解细菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：1)将松墨天牛幼虫后肠部分置于磷酸盐缓冲液中研磨，得到的研磨液固液分离，收集上清液，得到原始菌液；2)将所述步骤1)中得到的原始菌液进行梯度稀释至10-9，分别取不同稀释梯度的菌液涂布于4号固体培养基上进行有氧培养，得到不同形态的单菌落；所述4号固体培养基包括以下含量组分：5g/L的羧甲基纤维素钠，0.2g/L的酵母浸提物和12g/L琼脂，所述4号固体培养基的pH值为7.0；3)挑取所述步骤2)中不同形态的单菌落进行形态鉴定、生理特征测定和分子鉴定。

云斑白条天牛肠道木质素降解菌的分离与鉴定

云斑白条天牛肠道木质素降解菌的分离与鉴定段慧娟，方小英，朱林慧，李贝娜，彭思颖，杨振德*（广西大学林学院南宁市530004）摘要：微生物降解木质素具有环境友好、低成本等优点而受到广泛关注。

自云斑白条天牛Batoceralineaolata（Chaev-roat）幼虫肠道中筛选高效木质素降解菌，以实现木质素的资源化利用。

本研究以愈创木酚为唯一碳源的选择培养基法和苯胺蓝平板法筛选高效降解木质素的菌株，采用形态学观察和16S rDNA基因序列同源性分析方法对菌株进行鉴定。

在愈创木酚选择培养基上共筛选出37株细菌菌株，在苯胺蓝平板上，B01和B12菌株的水解圈D/d值最大（1.60和1.58）；经鉴定，B01菌株为假单胞菌属（Pseudomonas）的一种，B12菌株为考氏科萨克氏菌属（Kosakonia）的一种。

关键词：云斑白条天牛；肠道；木质素降解菌；假单胞菌；考氏科萨克氏菌中图分类号：S718.83文章标识码：B文章编号：1003-8779（2021）02-0020-05木质素是具有复杂结构的高分子化合物，是由苯丙烷单元结构通过醚键和碳碳键组成的具有三维空间结构的无定型芳香类化合物，与纤维素和半纤维素构成植物骨架的主要成分[1]。

其不易降解，但含量丰富，占陆生植物干重15%～40%，是含量仅次于纤维素的生物多聚体[2-3]。

木质素作为农作物秸秆以及城市生活垃圾中常见的难降解物质[4]，将其焚烧既产生资源浪费，又造成环境破坏。

同时，木质素作为造纸业的副产物，由于难降解，如果直接排放环境中，会造成水生生态系统的破坏[5]。

由于存在于细胞壁中的纤维素受到木质素的保护，木质素是否被有效降解对纤维素降解有着重要作用[3]。

因此，开发高效降解木质素的技术成为木质纤维素资源化利用与环境保护的重要问题。

目前木质素降解方法主要为物理法、化学法和生物法。

微生物降解法具有反应条件温和、成本低、环境友好等特点[6]，成为国内外研究者关注的焦点。

探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术解析

探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术解析纤维素是地球上最为丰富的可再生生物质之一，其降解对于碳循环和生物能源利用具有重要意义。

纤维素降解微生物是实现纤维素高效降解的关键因素，因此分离和鉴定纤维素降解微生物的技术手段显得尤为重要。

本文将探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术，分析不同方法在该领域的应用和优势。

一、传统菌落计数法在纤维素降解微生物分离中的应用传统的菌落计数法广泛应用于微生物学领域，通过稀释涂布和平皿计数的方法分离和计数微生物。

在纤维素降解微生物的研究中，也可利用该方法，首先通过选择性培养基筛选可降解纤维素的微生物，之后对菌落进行鉴定。

该方法具有操作简单、成本较低的优势，但需要较长的培养周期，且存在着菌落形态相似导致鉴定偏差的问题。

二、分子生物学方法在纤维素降解微生物分离中的应用1. 提取微生物的基因组DNA为了鉴定微生物的种类和多样性，在纤维素降解微生物的研究中常常采用分子生物学方法。

首先需要从样品中提取微生物的基因组DNA，可以通过商用试剂盒或自制方法进行提取。

2. 16S rRNA基因测序在分子生物学领域，16S rRNA基因是常用的微生物分类和鉴定的分子标记。

通过PCR扩增样品中微生物的16S rRNA基因，然后进行测序，最终可以通过比对数据库的方式鉴定纤维素降解微生物的种类。

该方法相比传统的菌落计数法，具有更高的准确性和鉴定速度。

3. 基于转录组学的方法基于转录组学的方法可以研究微生物在降解纤维素过程中的基因表达情况。

通过提取微生物的RNA，进行RNA测序，可以深入了解微生物参与纤维素降解的代谢途径和调控机制。

这种方法在研究纤维素降解的机理和提高降解效率方面具有重要作用。

三、基于纳米离子流动技术的应用传统的分子生物学方法虽然在鉴定微生物的种类方面具有优势，但对于在微生物水平上进行降解机理研究仍存在一定局限性。

基于纳米离子流动技术的应用为解决这一问题提供了新思路。

纳米离子流动技术是一种基于离子流动速度的物理特性进行微生物鉴定的方法。

分解纤维素微生物的筛选与鉴定关键技术与方法论

分解纤维素微生物的筛选与鉴定关键技术与方法论背景介绍：分解纤维素是一种具有广泛应用前景的生物技术，能够将纤维素转化为可再生能源和有机化学品。

而在分解纤维素的过程中，微生物起着至关重要的作用。

在本文中，将讨论分解纤维素微生物的筛选与鉴定的关键技术与方法论。

一、测定纤维素分解能力针对分解纤维素微生物的筛选与鉴定，首先需要明确微生物对纤维素的分解能力。

常用的方法是通过测定微生物产生的纤维素酶活性来评估其分解能力。

温度、pH值、底物浓度等因素的调控可以对纤维素酶的分解活性产生影响。

二、筛选菌种的方法1. 采集样品：从自然环境中采集样品，例如土壤、堆肥等。

将样品分离培养在富含纤维素的培养基中，筛选出能够分解纤维素的微生物。

2. 高通量筛选：利用高通量筛选技术可以快速筛选出具有较高纤维素分解能力的微生物。

例如，通过利用微生物芯片技术，对大量微生物进行快速检测和鉴定。

3. Genomic Mining：通过对微生物基因组的分析，筛选出具有纤维素分解相关基因的微生物。

该方法能够识别出具有潜在的纤维素分解能力的微生物。

三、纤维素分解菌种的鉴定1. 形态学特征：通过观察微生物的形态学特征，包括菌落形状、颜色、大小等，结合显微镜观察，可以初步鉴定纤维素分解微生物的种属。

2. 生理生化特征：可以通过对微生物进行生理生化特性的检测，例如碳源利用能力、酶活性等，进一步鉴定微生物的属种。

3. 分子生物学方法：通过对微生物的基因序列进行PCR扩增和测序，利用基因序列的比对和系统进化树的构建，可以准确地鉴定微生物的属种。

四、验证纤维素分解能力确认筛选出的微生物能够真正分解纤维素是至关重要的。

常用的验证方法包括测定微生物对纤维素底物的降解率、产生的降解产物等。

结论：通过对分解纤维素微生物的筛选与鉴定关键技术与方法论的探讨，可以为寻找纤维素分解菌种提供一定的理论指导和实践参考。

微生物的筛选和鉴定是分解纤维素的关键步骤，科学合理的方法和准确可靠的手段将有助于发现和利用具有高效分解纤维素能力的微生物资源。

分解纤维素的细菌的分离讲义专家讲座

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6.纯化培养
在产生显著透明圈菌落, 挑取并接种到纤维素分解菌选择培养基上, 在300C－ 370C培养, 可取得纯化培养。
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四、结果分析与评价
1.培养基制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落
对照培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。假如观察到产生透明圈菌落, 则说明可能取得了分解纤维素微生物。
B.这个培养基对微生物是否含有选择作用？假如含有，是怎样进行选择？
有选择作用, 本配方中纤维素作为主要碳源, 只有能分解纤维素微生物能够大量繁殖。
C.你能否设计一个对照试验，说明选择培养基作用
提醒: 自变量为培养基种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。
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二、实验设计
请你依据试验流程图和提供三个资料以及“操作提醒”, 在思索相关问题基础上, 设计出一个详细试验方案。
土壤取样
选择培养
梯度稀释
将样品涂布在判别纤维素分解菌培养基上
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筛选产生透明圈菌落
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操作步骤 1.土壤取样：
①分布环境
富含纤维素环境中
最少包含三种组分, 即C1酶(外切酶)、CX
酶(内切酶)和葡萄糖苷酶, 前两种酶使纤
维素分解成纤维二糖, 第三种酶将纤维二
糖分解成葡萄糖。
纤维素
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶纤维二糖
葡萄糖
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试验: 纤维素酶分解纤维素试验

纤维素分解细菌的分离和鉴定

纤维素分解细菌的分离和鉴定李安市;耿学磊;贾晶;张小葵;陈冠军【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)009【摘要】[目的]研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定.[方法]采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细菌,通过PCR克隆这3株菌的16S rDNA并与相似菌株做比对,进一步构建分子进化树,来研究其分类情况.[结果]综合其个体形态、菌落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据,鉴定3株菌均为假单胞菌属(Pseudomonas).[结论]WH3为Pseudomonas putida,WH1和WH12还需进一步鉴定.【总页数】4页(P3956-3959)【作者】李安市;耿学磊;贾晶;张小葵;陈冠军【作者单位】山东大学威海分校海洋学院,山东威海,264209;山东大学威海分校海洋学院,山东威海,264209;山东大学威海分校海洋学院,山东威海,264209;山东大学威海分校海洋学院,山东威海,264209;山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南,250100【正文语种】中文【中图分类】S182【相关文献】1.桑粒肩天牛肠道木质纤维素分解细菌的分离和鉴定 [J], 刘晨娟;蔡皓;李庆;喻子牛2.桑粒肩天牛肠道纤维素分解细菌的分离和鉴定 [J], 曹月青;殷幼平;董亚敏;何正波3.西双版纳原始森林土壤中分离的两株纤维素分解细菌的鉴定 [J], 余萍;姚斌;罗红梅;李树红;张绍松4.瘤胃内分解纤维素细菌的分离与鉴定 [J], 程超;郝永清;张林冲5.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定 [J], 顿宝庆;吴薇;王旭静;曲小爽;李桂英;林敏;路明;张保明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

纤维素分解菌的分离和鉴定

纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。

如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。

由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。

从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。

迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。

主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。

以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。

与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。

纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。

随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。

利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。

因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。

二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。

三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。

2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。

3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。

松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌的分离与鉴定

松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌的分离与鉴定胡霞;傅慧静;李俊楠;林中平;张飞萍【摘要】The cellulolytic bacterial community in the intestine of Monochamus alternatus larvae was investigated in the liquid media with the unique carbon sources of sodium carboxymethylcellulose or filter paper. The results showed that a total of 154 cellulolytic bacteria belong to Proteobacteria,Firmicutes and Bacteroidetes were isolated and 10 species in 8 genera were identified.The commo-nest species was Siphonobacter aquaeclarae which accounted for 31.8% in the cellulolytic bacterial community,followed by Serratia marcescens which accounted for 20.1%. The other species in Bacillus,Klebsiella,Sphingobium,Comamonas and Lysobacter were al-so found.%为揭示松墨天牛幼虫肠道木质纤维素降解细菌群落的结构和功能,采用羧甲基纤维素钠为唯一碳源,结合刚果红法筛选肠道纤维素降解细菌,共获得154株肠道纤维素降解细菌,分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种.其中噬纤维细菌科细菌Siphonobacter aquaeclarae表现为最优势纤维素降解菌,占肠道纤维素降解细菌群落的31.8%,其次为沙雷氏菌Serratia marcescens,占20.1%,其它依次为芽孢杆菌(Bacillus),克雷伯氏杆菌(Klebsiella),鞘脂菌(Sphingobium),丛毛单孢菌(Comamonas)和黄色单胞菌(Lysobacter).【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(047)003【总页数】7页(P322-328)【关键词】松墨天牛;肠道细菌;群落结构;纤维素酶;细菌鉴定【作者】胡霞;傅慧静;李俊楠;林中平;张飞萍【作者单位】福建农林大学林学院,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福建农林大学林学院,福建福州350002;福州市林业局,福建福州350000;福建农林大学林学院,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S763.3纤维素是林木蛀干害虫食物中的主要营养成分，在害虫完成其正常生长发育过程中起着重要作用[1].大量研究表明，蛀干害虫肠道内生长着许多微生物，其数量甚至远远超过昆虫自身细胞的总数[2].这些微生物可以分泌纤维素降解酶，从而在昆虫自身消化系统和体内共生微生物的协同作用下，完成对木质纤维素的高效降解、消化、吸收和利用[3].因此，蛀干害虫肠道微生物是其完成生活史不可或缺的协同因素.目前已知的蛀干害虫肠道微生物主要包括细菌、真菌和原生动物，其中真菌、细菌被认为是木质纤维素类物质的主要降解者.在以往的研究中，国内外学者大多关注形态较大，能够胞外分泌酶的木质纤维素降解真菌，如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)等[4].但是，目前发现的纤维素降解真菌大多为好氧菌，它们一般不适宜在昆虫肠道的缺氧型环境中生长[5].具有厌氧或兼性厌氧特点的纤维素降解细菌，则能够在昆虫肠道内维持较高的种群丰度，其种类和数量要远远超过真菌[6].Cazemier et al在1头太阳甲虫(Pachnoda marginata)成虫肠道内，就发现了数量多达2.5±1.1×108的纤维素降解细菌，而Delalibera et al在楔天牛(Saperda vestita)肠道也发现了多达0.24～3.57×106的纤维素降解细菌[7,8].由此可见，细菌是蛀干害虫肠道中降解木质纤维素的重要成员.松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)是松树的主要蛀干害虫，除能直接钻蛀危害造成松树衰弱甚至死亡外，还是松材线虫病的病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus Nickle)的传播媒介[9].松材线虫病作为世界上最危险的森林病害，自1982年传入中国以来，已造成15个省份，100多万hm2的松林枯死，经济损失超过200亿美元[10].长期以来，控制松墨天牛，切断松材线虫病传播途径，是我国防控松材线虫病最重要和最有效的措施之一.与其它蛀干类害虫相同，在松墨天牛整个生长发育周期，尤其是幼虫时期，木质纤维是其最主要的营养来源[11]，肠道细菌在天牛幼虫降解木质纤维，帮助消化这类大分子物质中可能发挥了重要作用.目前有关微生物降解纤维素的研究已较为深入，然而有关松墨天牛肠道细菌的纤维素降解研究鲜见报道.本研究通过可培养的方法筛选松墨天牛幼虫肠道木质纤维素降解细菌，并测定其纤维素酶活性，从而为解析松墨天牛幼虫肠道木质纤维素降解细菌的群落结构及功能奠定基础，也为进一步揭示肠道细菌与松墨天牛的互作关系提供理论依据.1 材料与方法1.1 供试昆虫马尾松虫害木采集于福建省连江琯头镇(N 26°150′；E 119°593′)，将虫害木锯成长约1 m的木段，置于1.5 m3的养虫笼内，养虫笼用网径小于2 mm的铁砂网密封.采用剥开马尾松树皮，劈开木段的办法收集松墨天牛幼虫以备实验需要. 1.2 试验方法(1)昆虫的预处理：将收集的松墨天牛幼虫立即置于湿润的无菌环境中，饥饿处理48 h，以排空松墨天牛肠道食物残渣.选取9头健康的松墨天牛幼虫，用75%的酒精浸泡3 min，然后用无菌水漂洗3遍，继而在体式显微镜下进行肠道解剖，将获得的幼虫中后肠部分转移至含有0.01 mL磷酸盐缓冲液(PBS：138 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4)的1.5 mL离心管中.(2)培养基的配制：参照Delalibera et al[8]的方法，1号液体培养基(滤纸培养基)内含有5 g·L-1滤纸条(Whatman)，40 mg·L-1胰蛋白粉(Becton Dickinson, Sparks, MD)，100 mg·L-1麦芽粉(Becton Dickinson)和2 g·L-1 CaCO3，pH 值为7.0；2号液体培养基(CMC培养基)内含有5 g·L-1羧甲基纤维素钠(CMC, low viscosity; Sigma, St. Louis, MO)，30 mg·L-1酵母浸提物，100 mg·L-1麦芽粉和2 g·L-1 CaCO3，pH值为7.0；3号液体培养基内含有5 g·L-1磷酸化微晶纤维素(PH105)，1.9 g·L-1 K2HPO3，0.94 g·L-1 KH2PO3，1.68 g·L-1 NaHCO3，1.6 g·L-1 KCl，1.43 g·L-1 NaCl，0.15 g·L-1 NH4Cl，0.037 g·L-1 7H2O·MgSO4，0.017 g·L-1 CaCl2·2H2O和0.1 g·L-1 yeast extract，pH值为7.0；4号固体培养基内含有5 g·L-1羧甲基纤维素钠，0.2 g·L-1酵母浸提物和12 g·L-1琼脂，pH值为7.0[6].(3)纤维素降解菌的计数与分离：参照Delalibera的方法，并进行了适当调整[8].取3只含1 mL PBS的离心管，分别装入1条松墨天牛幼虫肠道，用塑料研磨棒研磨10～20次.然后在4 ℃下以4 000 r·min-1的转速离心10 s，将肠道微生物从肠道组织分离，作为松墨天牛幼虫肠道细菌的原始菌液.为方便菌落计数，依次将原始菌液稀释至10-9，并分别取各个稀释梯度菌液100 mL涂布于4号培养基平板上，然后配合刚果红染色法记录纤维素降解菌数；为方便分离纯化纤维素降解菌株，将0.1 mL原始菌液转转移至含15 mL以滤纸作为唯一碳源的1号液体培养基或15 mL以CMC作为唯一碳源的2号液体培养基的50 mL三角瓶中，在避光条件下190 r·min-1，28 ℃有氧培养直至观察到1号培养基中滤纸出现被降解现象.为了确定微生物的微晶纤维素降解活性，将经过1号和2号培养基培养筛选获得的细菌接种至仅以微晶纤维素作为碳源的3号液体培养基中，在避光处理下190 r·min-1，28 ℃有氧培养7 d.最后将菌液梯度稀释至10-9，各梯度菌液取0.1 mL涂平板于4号固体培养基，用于菌落计数及分离松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌菌株.该部分所有试验均设置3次重复.(4)纤维素酶活性测定：分别在形成菌落的4号固体培养基中加入1 g·L-1刚果红染液染色30 min，倒出后加入1 mol·L-1 NaCl溶液浸洗30 min，倒掉浸洗液后可观察到菌落周围形成透明圈，然后通过测量透明圈直径与菌落直径的比值判断该菌落的CMC相对降解活性[12].(5)形态鉴定及生理特征测定：通过平板培养后，在光学显微镜下观察并记录单菌落的颜色，形状及质地等特征，细菌细胞形态的鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》的方法，鉴定细菌的菌落颜色、菌体形状、大小、革兰氏阴性阳性区分、有无鞭毛、有无菌膜以及该菌株代表的细菌菌落个数等[13].(6)分子鉴定：根据细菌DNA提取试剂盒(Omega，美国)说明分别提取各细菌总DNA，继而使用细菌通用引物fD1和rP1扩增细菌16S rDNA，具体办法参见Hu et al[14].将测序数据16S rDNA序列上传至Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih/gov/blast/)，本研究松墨天牛幼虫肠道具有纤维素降解活性的细菌菌株16S rDNA序列基因登陆号为：KX461909-KX461918.为进一步确定各松墨天牛肠道纤维素降解细菌的分类地位，首先将所有序列与RDPⅡ数据库序列匹配[15]，然后通过BLAST在EzTaxon-e数据库和NCBI数据库中与已知16S rDNA序列比对[16]，下载相似度高且可靠序列用于聚类分析.将测序获得的所有序列和Genbank下载的可靠相似序列通过MEGA 6.0中的MUSCLE进行匹配，计算最佳模型，构建Neighbor-joining系统发育树[17,18]，为计算每个分支的支持率，设置自展分析为1000个重复.1.3 数据分析方法差异显著性分析均采用F检验(SPSS，Version 22).2 结果与分析2.1 松墨天牛幼虫纤维素降解细菌菌落计数以羧甲基纤维素钠(CMC)作为唯一碳源，结合刚果红染色法筛选的松墨天牛幼虫消化道纤维素降解菌，通过稀释涂平板法的菌落计数结果为每头(5.2±0.38)×106 CFU·mL-1.该结果与椴六点楔天牛(Saperda vestita)肠道纤维素降解细菌的菌落计数结果类似[(0.24～3.57)×106 CFU·mL-1]，高于瑞肇大小蠹(Dendroctonu rhizophagus)肠道纤维素降解菌的菌落计数结果[(2.3±0.43)×103 CFU·mL-1][8]，明显少于太阳甲虫(Pachnoda marginata)成虫肠道纤维素降解细菌的菌落计数结果[(2.5±1.1)×108 CFU·mL-1][7].2.2 CMC酶活细菌菌株分离与鉴定不具有相同字母则表明彼此差异显著.图1 松墨天牛肠道细菌降解纤维素产生的透明圈与菌落的直径比率Fig.1 The ratio of the CMC clearance zone diameterto the colony diameter of cellulolytic bacteria associated the gut of Monochamus alternatus从松墨天牛幼虫中后肠肠道中分离出154株具纤维素酶活性的细菌，其中65株为滤纸培养基(1号培养基)所得，89株从CMC培养基(2号培养基)中得到.这些菌株均能降解微晶纤维素，且经刚果红染色显示不同大小的透明圈，其透明圈直径与菌落的直径比的平均值1.33～7.09(图1).降解能力最强菌落降解透明圈直径比与其它菌株均呈显著差异(F=33.409，P<0.05).对筛选获得的154株具有木质纤维素降解能力的细菌进行形态鉴定，结合代表菌株的分子鉴定结果表明这154株细菌分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种(表1)(图2).其中菌株HX-1具有最强的木质纤维素降解能力，其纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为7.09.细菌鉴定结果表明菌株HX-1隶属于拟杆菌门(Bacteroidetes)，纤维粘网菌纲(Cytophagia)，噬纤维菌目(Cytophagales)，噬纤维细菌科(Cytophagaceae)，Siphonobacter菌属，Siphonobacter aquaeclarae菌种.菌株HX-8也具有较强的木质纤维素降解能力，其透明圈与菌落直径比为5.30，经鉴定其为丛毛单孢菌(Comamonas koreensis).菌株HX-4经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为4.13.菌株HX-7和菌株HX-5纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比近似，分别为3.55和3.30，经鉴定二者分别为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans).菌株3纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为2.51，经鉴定其为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).菌株HX-9为黄色单胞菌(Lysobacter enzymogenes)，其纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比为2.30.菌株HX-10、菌株HX-2和菌株HX-6纤维素降解透明圈与细菌菌落直径比都较小，分别为1.62、1.43和1.33，经鉴定其分别为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鞘脂菌(Sphingobium rhizovicinum).表1 松墨天牛肠道纤维素降解细菌的形态鉴定及菌落计数1)Table 1 Characteristics of cellulose-degrading microorganisms separated fromguts of Monochamus alternatus代表菌株菌属分类菌落颜色细胞形态/μm菌膜鞭毛革兰氏染色1号培养基菌落数/个2号培养基菌落数/个HX-1噬纤维细菌Siphonobacter aquae-clarae浅黄色杆状(0.21～0.38)×(1.05～2.50)+ND-2029HX-2铜绿假单胞菌Pseudomonas aerugino-sa深绿色杆状(0.39～0.72)×(0.92～2.43)-ND-46HX-3粘质沙雷氏菌Serratia marcescens粉色杆状(0.31～0.66)×(0.96～5.54)+周生-1318HX-4假单胞菌Pseudomonas sp.乳白色杆状(0.35～0.66)×(1.08～2.75)-ND-86HX-5环状芽孢杆菌Bacillus circulans乳白色杆状(0.37～0.67)×(0.80～4.30)+周生+210HX-6鞘脂菌Sphingobium rhizovicinum黄色杆状(0.33～0.61)×(0.98～9.89)-周生-42HX-7蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus乳白色杆状(0.32～0.59)×(0.98～2.62) μm+周生+37HX-8丛毛单孢菌Comamonas koreensis灰白色杆状(0.36～0.70)×(0.91～4.98)-端生-41HX-9黄色单胞菌Lysobacter enzymo-genes黄色杆状(0.61～1.13)×(1.64～3.50)+端生-02HX-10克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoni-ae灰白色杆状(0.50～0.80)×(1.16～2.08)+周生-781)+表示有；-表示无；ND表示未观察到.图2 松墨天牛肠道纤维素降解细菌16S rRNA系统发育树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene fragments of Monochamus alternatus gut cellulolytic bacteria对筛选培养的154株具有木质纤维素降解能力的细菌进行菌落计数分析，结果表明，松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落由46.8%的γ变形菌(γ-Proteobacteria)、31.8%的拟杆菌(Bacteroidetes)、14.3%的厚壁菌(Firmicutes)、3.3%的β变形菌(β-Proteobacteria)和3.9%的α变形菌(α-Proteobacteria)组成(图3).从菌属水平分析，有49株细菌被鉴定为噬纤维菌(Siphonobacter)，占肠道纤维素降解细菌群落的31.8%，为松墨天牛幼虫肠道纤维素降解优势菌；31株沙雷菌(Serratia)占肠道纤维素降解细菌群落的20.1%，24株假单胞菌属细菌(Pseudomonas)和22株芽孢杆菌属细菌(Bacillus)分别占肠道纤维素降解细菌群落的15.6%和14.3%；而另外4个菌属在松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落中的比例相对较小，其中克雷伯氏杆菌(Klebsiella)占9.7%，鞘脂菌(Sphingobium)占3.9%，丛毛单孢菌(Comamonas)占3.3%，黄色单胞菌(Lysobacter)占1.3%.图3 松墨天牛肠道纤维素降解细菌的菌落计数百分比(n=154)Fig.3 The percentof cellulolytic bacteria derived from Monochamus alternatus3 讨论本研究采用可培养的方法从松墨天牛幼虫肠道中获得154株纤维素降解细菌，分别隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的8个菌属、10个菌种.相对于其它鞘翅目昆虫而言，松墨天牛幼虫肠道纤维素降解菌菌落密度较高，但菌群落结构组成相对简单，这可能与部分细菌不能被纯培养获得有关[7,14].肠道纤维素降解细菌在蛀干类害虫高效降解、消化、吸收和利用木质纤维素的过程中起到非常重要的作用，对天牛类蛀干害虫幼虫肠道纤维素降解细菌的研究已是害虫生物防治的热点.曹月青等从桑粒肩天牛(Apriona germari)幼虫中肠分离获得一种兼性厌氧纤维素分解菌[19]；Delalibera et al在椴六点楔天牛(Saperda vestita)幼虫肠道中也得到了分解纤维素细菌菌群，但这些细菌仅能分解羧甲基纤维素钠，不具有滤纸降解活性[8]；苏丽娟等从桃红颈天牛(Aromia bungii)幼虫肠道中筛选的一株枯草芽孢杆菌能高效降解纤维素[20]；周峻沛从云斑天牛(Batocera horsfieldi)幼虫肠道细菌群落中也发现了大量具有纤维素酶活的细菌菌群，并认为纤维素降解细菌对云斑天牛的幼虫生长发育和抵御寄主营养匮乏具有重要的作用[21].本研究筛选获得的噬纤维菌(Siphonobacter aquaeclarae)纤维素降解能力最强，且在松墨天牛幼虫肠道中表现为优势菌，占肠道纤维素降解细菌群落的31.8%.Wilson和David在S.aquaeclarae所隶属的噬纤维菌科细菌中发现存在第三种纤维素降解机制：其既不分泌游离的纤维素酶，也没有纤维小体结构，而是通过菌体表面分泌纤维素酶并吸附结晶纤维素，增大接触面积来实现高效降解[22].基于噬纤维菌科细菌强大的纤维素降解能力和独特的纤维素降解机制，国内外学者先后对该科哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii，古字状菌Runella slithyformis，蟑螂杆状体Leadbetterella byssophila，螺状菌Spirosoma linguale, Dyadobacter fermentans展开研究，结果发现这类细菌的纤维素降解酶活力与细胞相关联，它们对纤维素的降解可能是细胞表面纤维素酶以及部分非酶蛋白的协同作用来完成的[23].基于其独特的纤维素降解机制，松墨天牛肠道内木质纤维丰富的微环境，恰好为S.aquaeclarae的大量富集提供可能.另外，噬纤维菌科细菌常常具有高效的纤维素降解能力，这一特性对于以纤维素为主要营养源的昆虫来说非常重要.松墨天牛幼虫以马尾松韧皮部和木质部为食物来源，通过松墨天牛的咀嚼和肠道自身分泌的消化酶液等并不能很好地吸收纤维素大分子物质，满足其营养需求，因此，高丰度的具有纤维素降解活性的S.aquaeclarae为松墨天牛幼虫的营养代谢及生长发育提供了必要条件.这也可能是S.aquaeclarae在松墨天牛幼虫肠道占据种群丰度优势的一个重要原因.在以往对昆虫肠道微生物的研究中，仅在地下害虫暗黑鳃金龟幼虫肠道中有发现S.aquaeclarae，而对其在暗黑鳃金龟幼虫该肠道中的功能尚不清晰[24].在松墨天牛肠道中发现S.aquaeclarae尚属蛀干类害虫中的第一例，该菌极有可能是蛀干害虫肠道木质纤维降解细菌的一个新成员.但是，针对该科Siphonobacter属细菌的木质纤维素降解功能和机制还未见报道，作为蛀干害虫肠道木质纤维降解细菌的一个新成员，噬纤维细菌S.aquaeclarae也可能在纤维素酶系组成、酶学特性、功能基因和代谢通路上存在特异性，以适应松墨天牛肠道独特的微生态环境，S.aquaeclarae在松墨天牛肠道的木质纤维素降解功能和作用机制还有待于进一步研究.沙雷菌(Serratia)在松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落中的比例相对较高，占20.1%，为优势菌属.沙雷菌为革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地，能够在水，土壤和各种动物肠道等复杂环境中存活[25].何正波等从桑粒肩天牛幼虫肠道中也分离出了具有纤维素降解活性的沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌[26].目前研究发现沙雷菌具有分泌纤维素酶等多种胞外酶的能力[27]，这表明沙雷菌普遍存在于松墨天牛等木食性昆虫肠道中，并与宿主的纤维素降解功能息息相关.沙雷菌还具有的稳定性强和快速适应环境的能力，这可能也是沙雷菌在松墨天牛幼虫肠道纤维素降解细菌群落中占据种群丰度优势的一个重要原因[25].变形菌纲肠杆菌科假单胞菌(Pseudomonas)是松墨天牛幼虫肠道降解纤维素细菌群落中的第三大类群.Huang等在鞘翅目暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫肠道中也发现假单胞菌(Pseudomonas)为优势细菌菌群[24].假单胞菌广泛分布于植物组织、动物组织、水和土壤中，也是动植物的病原菌，但同时许多假单胞菌也具有纤维素降解活性[28-30].本研究通过单碳源培养基筛选培养、形态及分子鉴定和相对纤维素降解活性测定方法，明确了松墨天牛肠道纤维素降解细菌的群落多样性及部分功能，但肠道细菌纤维素降解机制还有待进一步研究.本研究结果不仅有助于丰富昆虫肠道微生物研究素材，还有助于深入理解松墨天牛的营养代谢和生境适应性，并为进一步揭示肠道细菌与松墨天牛的互作关系提供理论依据.参考文献【相关文献】[1] PETERSON B F, STEWART H L, SCHARF M E. 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纤维素降解细菌的筛选及酶活测定

纤维素降解细菌的筛选及酶活测定1 材料与方法1．1 含菌样品含菌样品取自校园里的腐烂树叶处的土壤。

1．2 培养基(1)CMC(羧甲基纤维素)培养基：CMC-Na15 g， NH4NO3 1 g，MgSO4 ·7H20 0．5 g，KH2PO4 0.5 g，琼脂2％，H201 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌。

(2)刚果红鉴定培养基：KH2PO4 0.2％，MgSO4 0．05％，(NH )2SO40．1％，琼脂2％，刚果红0．02％，CMC—Na 2％，NaC1 0．05％，pH自然。

(3)液体产酶培养基：CMC—Na 15 g，NH4 NO31 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0．5 g，H20 1000 mL,初始pH值霉菌调为5，细菌调为8 1.3 菌株的筛选初筛采用滤纸条崩解实验及刚果红平板识别，复筛采用液态产酶鉴定。

1.4 CMC酶活力的测定1.4.1 DNS法绘制标准曲线采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) 测定酶解液中还原糖含量。

取9支比色管，分别按表顺序加入各种试剂，将各管溶液混匀，用空白管溶液调零，测520 nm处的光密度值，绘制标准曲线1.4.2 测酶活将菌株接种于发酵培养基，30℃，l80 rpm培养4 d，从培养基中取l ml菌液放人试管，加水稀释至5 ml，4000 rpm离心5 min。

移取上清液 0．5 ml于试管中，加入含 0．5％ CMC—Na的柠檬酸缓冲液(0．05 mol／L，pH 4．4)1．5 ml，50℃水浴锅准确作用30 min，在每试管内加 1.5 ml DNS试剂，沸水浴 5 min，立即冷却，520 nm处测定其OD值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。

酶活力计算公式：酶活力=葡萄糖量×10(10一稀释倍数)酶活力单位(u)=(1 mg葡萄糖／m1)·30 min。

2.流程分析(1)纤维素降解菌的筛选：将含菌样品富集培养后，取菌液0．1 mL 涂布于羧甲基纤维素平板中，待其长出菌落后，进行平皿划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。

纤维素分解微生物的分离与鉴定

环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。

纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。

在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。

纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。

但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。

而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。

灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。

如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。

②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。

我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。

但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。