病理组织学诊断检材的制备技术

病理组织学诊断检材的制备技术

一、组织的固定

㈠凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。固定液量应为被固定标本体积的5~10倍。置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做切片。

㈡常规固定液为4%中性甲醛（10%中性福尔马林），应预先多量配制贮存，以备随时使用。小标本的固定时间为4~6小时，大标本为18~24小时或更久。

㈢根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色、电镜观察等）的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定［参见后述的“㈦固定液的常用种类和制备”］。

㈣器官、组织固定的基本方法

1．食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上（重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入4%中性甲醛中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉）。

2．肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.5~2.0cm纵向平行剖开，切成数片。将每片肝或脾轻轻地平放于装有4%中性甲醛的容器中，容器底面衬以脱脂棉。应避免标本弯曲和相互间的叠压。

3．肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。必要时从支气管注入适量4%中性甲醛。

4．肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面（深达于肾盏），再行固定。

5．淋巴结：先用4%中性甲醛固定1小时后，再沿其长轴切成数片（厚 2 ~3mm），继续固定。

6．骨组织：先锯成小片（若是长骨应作横向锯片），在4%中性甲醛中固定24小时后，再进行脱钙。

7．微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹（需用大头针扎牢），

然后放入专用小盒内进行中性4%甲醛固定，以防检材遗失。

8．凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号（病理号）。

㈤多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。

㈥组织块的切取和固定：①由较大标本切取用于制作切片的组织块（取材）时，应与标本的断面平行，组织块厚度一般为0.3 cm(不应>0.5cm)，面积一般在1~1.5×1~1.5以内。②切取组织块的形状，在充分包括肉眼病变的前提下尽量规则些（例如方形、矩形、三角形等）；由一个标本切取的多块组织的形状有所不同，便于蜡块与其相应切片的核对。③固定组织块的固定液量，一般应为组织块总体积的5~10倍以上。④室内常温（25℃左右）下的固定时间为3~24小时；低温（4℃）下的固定时间应延长。⑤固定组织块的容器要大一些。⑥组织块固定期间需要间断地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。

㈦常用固定液

1．4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液

甲醛（40%） 100 ml

无水磷酸氢二钠 6.5g

磷酸二氢钠 4.0g

蒸馏水 900ml

2．乙醇－甲醛（酒精－福尔马林，AF）固定液

甲醛（40%） 100ml

95%乙醇 900ml

［说明］一般组织块经乙醇－甲醛固定1～2小时后，即可移入95%乙醇内脱水。

3．Carnoy固定液

无水乙醇 60ml

氯仿 30ml

冰醋酸 10ml

［说明］组织化学染色的常用固定液，组织经Carnoy液固定1～2小时后，即可移入无水乙醇

中脱水。

4．Zenker固定液

升汞 5.0g

重铬酸钾 2.5g

硫酸钠 1.0g

蒸馏水（加至） 100ml

［说明］配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至40～50℃溶解后，再加入重铬酸钾，最后加入硫酸钠，贮存待用。使用前加入5ml冰醋酸，混合。组织块需固定12~24小时。切片染色前，需进行脱汞沉淀处理。

5．Bouin固定液

饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 75ml

甲醛（40%） 25ml

冰醋酸 5ml

［说明］本液临用时配制。组织块置于Bouin液固定12～24小时即可（小块组织只需固定数小时）。经Bouin液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤12小时后进入乙醇脱水（兼脱色）。不必将组织中的黄色除净（残存于组织中的苦味酸无碍染色）

6．过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液（PLP）

A液：赖氨酸 1.827g

蒸馏水 50ml

0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 50ml

B液：8%多聚甲醛水溶液 100ml

［说明］本液临用时配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终浓度为

2%。组织块在4℃下固定36~54小时。本液对细胞结构和抗原性保存较好。

7．B5（醋酸钠－升汞－甲醛）固定液

无水醋酸钠 1.25g

升汞 6.0g

蒸馏水 90ml

［说明］将以上物质混合、溶解，使用前加入甲醛10ml。本液多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。如不加甲醛称为B4固定液（蒸馏水为100 ml）。

8．丙酮固定液

冷丙酮（4℃）固定液用于酶组织化学染色。细胞标本的免疫组化染色也常用冷丙酮固定10分钟。

二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备

㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。

㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。

㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）

1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。

2．脱水（常温下）

（1）乙醇－甲醛（AF）液固定 60~120min

（2）80%乙醇 60~120min

（3）95%乙醇Ⅰ 60~120min

（4）95%乙醇Ⅱ 60~120min

（5）无水乙醇Ⅰ 60~120min

（6）无水乙醇Ⅱ 60~120min

（7）无水乙醇Ⅲ 60min

［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。

3．透明