Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李鑫;李亚芯;戴建君【摘要】基因敲除是研究基因功能最直接的方法.对于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂.Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟.作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项.大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考.%Knock-out is the most direct way to exploregene''s function.The traditional method of Escherichia coli (E.coli) gene knock-out is to use its own RecA reorganization system, which relies onthe specific given cleavage sites of restriction enzymes, requires long homologous arm, furthermore, the operation is complex.Modification of the genome has become simple and rapid since the advent of Red homologous recombination method.And its application in E.coli gene knock-out has been more mature.The structure and functional principle of Red homologous recombination is introduced, besides, this review expounds the operating steps and notices of the common two-step Red-mediated recombination.The Red homologous recombination technologyin E.coli has made great contribution in the area of modifications ofengineering strain, pathogenicity and bacterial resistance of the pathogenic bacteria.Additionally,the advantages and shortcomings of the method are set forth.According to the disadvantage that the traditional method do leave recombinase recognition site scars and has low efficiency, a sum of classical methods for scar-less gene replacement are described in the final part of the article.These approach can provide better applications for the construction of E.coli genome.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)007【总页数】7页(P1934-1940)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除;两步法【作者】李鑫;李亚芯;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q784通过一定途径使基因去除或失活的技术称为基因敲除，又称基因打靶[1]，该技术可定向改造微生物，近年来已成为构建新型大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)生物工程菌的重要手段。
尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株的构建及其生物学特性
尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株的构建及其生物学特性邓聪;彭亮;邓小燕;潘嘉韵;吴晓蔓【摘要】目的构建尿路致病性大肠埃希菌FYUA基因敲除株,比较野生株和敲除株之间生物学特性的改变.方法利用λRed同源重组系统构建FYUA基因敲除株△FYUA;测定A600绘制CFT073和△FYUA在LB液体培养基和无菌尿液中的增殖曲线;平板菌落计数法比较CFT073和△FYUA菌落形成能力;利用96孔板结晶紫染色法比较CFT073和△FYUA生物膜形成能力.结果成功构建CFT073 FYUA基因敲除株△FYUA;CFT073和△FYUA在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线,△FYUA在无菌尿液中的增殖速率明显低于CFT073(P＜0.05);CFT073和△FYUA菌落形成能力无明显区别;△FYUA的生物膜形成能力低于CFT073(P＜0.05).结论 FYUA基因对于菌株在无菌尿液中的生长繁殖以及生物膜形成可能发挥重要作用.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2015(035)004【总页数】6页(P502-507)【关键词】FYUA基因;基因敲除;尿路感染;大肠埃希菌【作者】邓聪;彭亮;邓小燕;潘嘉韵;吴晓蔓【作者单位】广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州510260;广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州510260;广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州510260;广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州510260;广州医科大学附属第二医院检验科,广东广州510260【正文语种】中文【中图分类】R378.2+1尿路感染(urinary tract infection，UTIs)是目前临床上最普遍的细菌感染之一，每年都有数百万人患尿路感染，并且复发率很高[1- 2]。
80%～90%的尿路感染由尿路致病性大肠埃希菌(uropathogenic Escherichia coli, UPEC)所引起。
Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用
综
述
Ｒ ｄ同源重组在 大肠杆菌基 因组修饰 中的应用 ｅ
孙旭 １ ， 长林 ， ２周 方宏 清
１ ．中国 药科 大 学 生 命 科 学 与技 术 学 院 ， 苏 南京 ２ ０ ０ ；２ 江 １０ ９ ．军 事 医 学科 学 院 生 物 工程 研 究所 ， 京 １０ ７ 北 ００ １ ［ 要 ］ Ｒ ｄ同源 重 组 技 术 发 展 迅 速 ， 摘 ｅ 已广 泛 应 用 于 大 肠 杆 菌 基 因组 修 饰 ， 点 突 变 、 因 敲 除 、 列整 合 等 方 面发 在 基 序 挥 着 重 要作 用 。 要 综述 了 Ｒ ｄ同源 重 组 的 重 组 机 制 和操 作 策 略 等研 究进 展 ， 简 ｅ 并介 绍 了 Ｒ ｄ同源 重 组 在 大 肠 杆 菌 基 ｅ
Ａｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ Ｒｅ Ｍ ｅ ｉ ｔ ｄ Ｒｅ ｏ ｂ ｎ ｔｏ ｉ Ｅｓ ｈ ｒｃ ｉ ｃ ｌ ｐ ｉ ｔｏ ｆ ｃ ｄ ｄａ ｅ ｃ ｍ ｉ ａｉｎ ｎ ｃ ｅ ｉｈ ａ ｏｉ Ｇｅ ｏ ｅ Ｍ ｏ ｉ ｃ ｔｏ ｎｍ ｄｆ ａ ｉｎ ｉ
Ｓ ＮＸ Ｚ Ｕ ｕ ＨＯＵ Ｃ ａｇ Ｌｎ， Ａ ｎ － ｉｇ ｈ ｎ－ ｉ Ｆ ＮＧ Ｈｏｇ Ｑｎ
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中国畜牧兽医!!"#$!%%"$#$#'I %!#'%"!"#$%&$#'%()*+,%$-./01232.#$%./42-#5#$2"#$$%&'%()*%%+',-.$'%(/%!/0*('0&%/'&/'&&8),>两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李!鑫 李亚芯 戴建君""南京农业大学动物医学院!南京0%&&18#摘!要 基因敲除是研究基因功能最直接的方法(对于大肠杆菌"M +5"2.#5"#%57(#!M 657(##而言!传统的基因敲除方法是利用其原有的3>,5系统!此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点!且所需同源臂长!操作复杂(3>"同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速'简单!在M 657(#基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟(作者介绍了3>"同源重组系统的组成和同源重组原理!阐述了常用的两步同源重组法敲除M 657(#基因的操作步骤及注意事项(大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造'病原菌致病机理'耐药机制研究等领域做出巨大贡献!由于两步法仍保留有3>"同源重组系统电转效率低'有序列残留的缺陷!作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍!通过对以上方法及应用进行综述!为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考(关键词 大肠杆菌&3>"同源重组&基因敲除&两步法中图分类号 G /2)文献标识码 5文章编号 %(/%!/0*("0&%/#&/!%1*)!&/收稿日期 0&%/!&0!&(基金项目 中央高校基本科研业务费专项"]a R 0&%*0(#&江苏省高校优势学科建设项目作者简介 李!鑫"%118!#!女!河南开封人!学士!研究方向$致病性大肠杆菌的耐药机制!F !A ?$6$%/)%*%%%!-+?B '>"B ',-"通信作者 戴建君"%1(/!#!男!安徽安庆人!博士!教授!研究方向$致病性大肠杆菌的致病机理!;>6$&08!2)*1(8((&F !A ?$6$"?$+$?-+B -!-+?B '>"B ',-Z :0-,2<E D 2J :1,K ),>X 2;2/2-2.:),62;B 98019285,172>12C 826A 2.117,S ,8,2<!+#/*0&#/&'#$(&S KM $-!S Ka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通过一定途径使基因去除或失活的技术称为基因敲除!又称基因打靶,%-!该技术可定向改造微生物!近年来已成为构建新型大肠杆菌"M +5"2.#5"#%57(#!M 657(##生物工程菌的重要手段(同时!基因敲Copyright ©博看网. All Rights Reserved.!/期李!鑫等$3>"两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用除作为研究基因功能最直接的方法!在生物科学中得到广泛应用,0!)-(此外!在兽医科学中!通过基因缺失的手段制作的基因工程疫苗!突破了传统疫苗周期长'特异性差的缺点!成为控制动物传染病的有效途径,8!(-(无论是作为工程菌还是致病微生物!大肠杆菌一直是科学家研究的热点对象!在基因工程'合成生物学等领域发挥着重要作用(大肠杆菌基因敲除的传统方法是利用其本身的3>,5重组系统构建环状质粒载体(3>,5重组系统是大肠杆菌内源性同源重组机制!它由3>,5和3>,N9E等蛋白组成,/!2-!前者为单链结合蛋白!结合单链E45后促进其与同源序列进行配对&后者为3>,N'3>,9' 3>,E*种蛋白的复合体!作用是解开E45双链并在9L$位点形成单链,1-(该方法有许多不足$#需较长的靶基因同源臂"%.H左右#,%&-&$3>,N9E具有核酸外切酶c的活性!能够降解线性E45分子!基因敲除时需要构建打靶质粒来克服这一缺陷,%%-& %3>,5重组发生的几率很低!用此方法难以获得基因缺失株,%0-(%112年![B C<L I,%0-首先尝试用5噬菌体的3>"重组系统在大肠杆菌中进行基因缺失!缩短了试验周期!由此建立了新的原核缺失操作技术( 0&&&年!研究者将一个缺陷型5噬菌体左向操纵子从==位点整合到M657(#的P*%%&染色体上!建立了基于3>"重组酶的高效修饰染色体系统,%*-(之后!相继出现了众多以此为基础的同源重组方法( E?=@>-.#等,%)-在辅助性质粒<]E)(中表达了整套3>"同源重组系统!首创了两步同源重组法!该方法成功利用了来自5噬菌体的同源重组系统!克服了大肠杆菌自身核酸外切酶降解线性E45的缺陷&在其建立的3>"重组技术中!引物所需同源臂"O%与O0#长度大大减少!仅为*(个核苷酸!这无疑是对工作量的有效简化!简单而高效是两步同源重组法经典的原因所在(0&&*年!研究者首次用Q>-> 7#C7$-7法将大肠杆菌中的丙氨酸密码子替换为琥珀密码子"终止密码子_5Q#&S>>等,%8-在此基础上于0&&1年提出了更高效可靠的Q>->"#,=#C$-7法!这两种方法突破了两步法*有痕+的限制(但是由于无痕重组效率较低!而两步法又近似于无痕!可以满足绝大多数基因敲除的要求!目前应用最广泛的仍是E?=@>-.#等,%)-在[B C<L I建立的53>"同源重组技术基础上改造的两步法同源重组(作者主要介绍了两步法的原理及操作步骤!阐述了近年来在两步法基础上进行的无痕改造方法(#!),>同源重组系统介绍5噬菌体基因组中!包含一个3>"重组编码区段!可启动外源性E45和细菌染色体的同源重组!称之为3>"同源重组系统(根据3>"同源重组系统构建的'将外源性E45片段和细菌染色体或质粒基因同源重组的基因改造技术!称为3>"同源重组技术,2-(3>"系统是一种原核中断系统!含有5噬菌体上的*个重组相关的基因!其翻译产物分别为F V#'N>=?'Q?A*种蛋白质,%(!%/-(F V#蛋白又称3>"1蛋白!属于5核酸外切酶!在3>"同源重组过程中!与E45双链末端结合!从8^端向*^端降解核苷酸!产生*^突出端,%2-(该蛋白是一种三聚体环状分子!中间的*通道+状结构两端各自分别容纳双链和单链E45分子,%1-(N>=?蛋白是一种分子质量为02.B的单体蛋白!可促进互补链的复性!可自发以环状结构与被F V#降解的单链E45*^突出端紧密结合!以免其被单链核酸酶降解,0&!0%-&同时!N>=?蛋白也具有退火蛋白的活性!互补单链E45的退火也由其介导!退火完成后!N>=?蛋白即与E45双链脱离(分子质量为%(.B的Q?A蛋白则以二聚物的形态与宿主菌表达的核酸外切酶3>,N9E'X H,! 9E结合使之失活!抑制其降解作用!保护外源性E45,%1!00-(!!),>两步同源重组法进行大肠杆菌基因敲除的原理!!在3>"两步同源重组法中!E?=@>-.#等,%)-巧妙地将3>"同源重组基因整合于阿拉伯糖启动子的控制下!并转入<]E)(质粒中!该质粒具有氨苄西林抗性基因!且为温敏性复制子!)0f时复制可被抑制(预先将具有3>"同源重组序列的<]E)(质粒导入目的菌株中!以<]E*或<]E)为模板!合成:93基因打靶片段产物!该片段含有抗性基因!两端含有)&"(&H<的目的基因同源序列(制备目的菌株的感受态细胞!在S!阿拉伯糖的诱导下! <]E)(质粒编码的3>"重组酶得以表达!在F V#' N>=?'Q?A等蛋白的作用下!导入细菌的线性打靶E45片段与染色体的相应序列发生同源重组(含有抗性基因标记的打靶片段将靶序列置换下来,1!0*!0)-(重组过程中!Q?A蛋白以二聚物的形式与3>,N9E编码的酶结合!使之失活!并从外源线性E45序列的双链末端启动3>"同源重组介导的8*1%Copyright©博看网. All Rights Reserved.中!国!畜!牧!兽!医))卷!基因置换(与此同时!5外切核酸酶则与外源线性E45序列的双链末端结合!降解8^末端链!留下突出的*^单链末端,%/-(接着!E45的*^单链突出端与N>=?蛋白结合!形成环状!在3>,5和53>,-蛋白的协同作用下!侵入目的菌株染色体的靶基因同源序列!置换靶基因(其中!若参与重组的另一序列为未断裂的双螺旋E45链!重组将依赖于3>,5蛋白!且以链侵入的方式进行!称之为链侵入模型&如另一序列正在复制或具有断链位点!则N>=?蛋白参与介导互补的E45单链退火!这种重组过程称为单链退火模型,08!0(-!如图%所示(图#!),>同源重组的两种不同模型 !$9-G#!E D2>9<<,3,81;2>,/:2<),>72;2/2-2.:3,62;B9801928 !$!!除此之外!质粒<]E*和<]E)分别编码有氯霉素和卡那霉素抗性基因!且具有翻转酶结合位点"T6$<<?@>C>,#7-$=$#-=?C7>=!`3;#&质粒<9:0&含有T6$<<?@>基因!表达的`S:翻转酶"一种重组酶!来自酿酒酵母D%55"%.7'/52+52.2=#+#%2的0/A质粒#可以与`3;位点结合!消除抗性基因片段,02-(I!),>两步同源重组法在大肠杆菌中进行基因敲除的操作方法!!首先!将<]E)(质粒转化入目的菌株中(以<]E*或<]E)为模板!合成:93基因打靶片段产物(制备目的菌株的感受态细胞!加入S!阿拉伯糖诱导重组酶的表达!并将打靶片段电转化入目的菌株!在3>"同源重组系统的作用下!细菌染色体基因和融合:93基因打靶片段进行重组!目的基因被抗性基因取代(其次!用加有相应抗性"<]E*$氯霉素抗性!9L6C&<]E)$卡那霉素抗性!]?-C#的S N琼脂平板筛选得到重组菌株(将温敏质粒<9:0&电转化入目的菌株!利用`S:翻转酶去除目的菌株染色体上的抗性基因,02-!在)0f培养0)L以上!去除<9:0&质粒!目的基因即得到敲除(简单来说!两步法的第一步是将一段含有`3;位点的抗性基因与目的菌株染色体待敲除片段置换&第二步是通过电转化导入<9:0&质粒!在宿主细胞内表达`S:翻转酶!最终敲除抗性基因,02-(现将3>"两步同源重组法的操作步骤进行具体阐述(I G#!缺失前准备将目的菌株接种于含不同抗性的S N平板上!观察细菌生长情况!筛选出目的菌株不具有的抗性!以选择合适的质粒进行操作(选用<]E0&"氨苄西林抗性!5A<C#或<]E)("5A<C#导入目标菌株进行3>"同源重组系统的表达&选用<]E*"9L6C#或<]E)"]?-C#质粒进行基因打靶片段的扩增&选用辅助性质粒<9:0&"5A<C!9L6C#进行抗性基因去除(若目标菌株均具有以上抗性!可以用基因工程方法将质粒进行抗性改造,01-(下文以<]E)质粒和<]E)(质粒为例!说明运用3>"同源重组法对大肠杆菌5的%基因进行敲除的方法(在缺失前!将<]E)(质粒电转入目的菌株中(I G!!引物设计此试验中需要设计组引物$#?!<%%?!<0!两端长度约(&H<的%基因同源臂&$?!`%?!3!%基因的(*1%Copyright©博看网. All Rights Reserved.!/期李!鑫等$3>"两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用检测引物&%!B <%?!"#U -!%基因两侧引物!用于%基因的缺失检测及缺失交叉检测"图*#&&]%"序列$8^!95Q ;95;5Q 99Q 55;5Q 99;!*^#!]0"序列$8^!9Q Q ;Q 999;Q 55;Q 559;Q 9!*^#!]="序列$8^!9Q Q 99595Q ;9Q 5;Q 55;99!*^#!<]E )(质粒中?%$.检测基因!用于交叉检测&'<]E )(!<%"序列$8^!;;;Q 5Q ;;Q ;Q Q Q ;5;9;Q ;!*^#%<]E )(!<0"序列$8^!9;;Q ;5;;5;Q Q Q ;5Q ;;;99!*^#!用于<]E )(质粒的检测"图0#(图!!交叉V F )鉴定引物图示9-G !!=,-,8>2<2@,3/0K K 98-VF )9>,819<9601928 :K 39;,3:IG I !基因缺失以<]E )为模板!使用引物?!<%'?!<0扩增两侧包含%基因同源臂的]?-C抗性基因!琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收!回收产物纯化后得到的:93产物!即为基因打靶片段(将8&/S 含<]E )(质粒的5菌液%g%&&接种于8A S S N 液体培养基中!*&f '%2&C %A $-摇床孵育!过夜(次日%g 8&转接于%&&A S 液体S N 中!*&f '%2&C %A $-摇床孵育至H (&&-A 值处于&'0"&'*之间!加入S !阿拉伯糖!*&f '%0&C %A $-摇床孵育%L !冰上放置0&A $-!冷却后)&&&C %A $-离心%&A $-!弃上清!用甘油洗涤'离心*次(第*次离心后!弃去大部分上清!重悬菌体!加入胶回收所得融合:93产物!冰上孵育*&A $-(将回收的:93产物与感受态细胞混匀!转入已预冷的电击杯!进行电击(电击转化条件$0*&&c !0&&6'08/`(电击后立即加入*&f 预热的%A SX D 9培养基!*&f '%0&C %A $-摇床复苏0L !8&&&C %A $-离心8A $-!弃去大部分上清!重悬菌体!涂布于具有]?-C的S N 琼脂平板!置于02f温箱过夜孵育(挑取单菌落于%A S S N 液体中进行培养!进行交叉:93扩增鉴定(所用引物?!B <%!"#U -'?!B <%]%']0%?!"#U -']0%]=(若在相应长度出现条带!则说明电转化成功(可用!B <%!"#U -扩增目的条带!进行胶回收!用胶回收引物进行测序!来确定%基因是否成功去除(I G %!质粒与抗性的去除将转化成功的菌株在含卡那霉素的S N 平板上划线接种!置于)0f 温箱孵育!0)L 后挑取单菌落依次接种在卡那平板和氨苄平板的对应部位!*/f 温箱过夜(次日观察平板$在卡那平板上生长'在氨苄平板上对应位置未生长的细菌!:93检测确定之后!即是已去除<.E )(质粒的克隆(用电转化的方法!将<9:0&质粒转化入得到抗性基因的缺失菌株中"步骤同前!无需加阿拉伯糖#!用含有氨苄青霉素抗性的S N 琼脂培养基筛选阳性克隆!然后在普通S N 琼脂培养基上进行阴性筛选,*&-!最后获得不含卡那霉素基因的缺失株!)0f 培养后去除<9:0&质粒!:93鉴定!5菌株的%基因缺失株则构建成功(I G (!注意事项在电转化中!感受态的制备至关重要(若目的菌株细胞壁较厚!在使用甘油重悬前!可以先用""O 0D 重悬一次!静置0&"*&A $-!使细菌细胞胀大!细胞壁变薄!更易电转(此外!可根据目的菌株细胞壁厚度的不同!调节电击转化的电压(%!),>两步同源重组法进行大肠杆菌基因敲除的无痕改造!!与传统的基因敲除方法相比!3>"同源重组法有很多优势$首先!不受酶切位点的限制!理论上可以将任何一个基因敲除&需要基因打靶同源臂短!可以直接连接在引物上(而作者着重介绍的两步法3>"同源重组!则更具有操作简单'试验周期短'应用范围广的优势(然而!该方法中的电转化步骤限制了操作效率的提高!此外!尽管其基因敲除近乎无痕!在敲除的位置还是会残留一个`3;重组酶的作用位点!可能会对后续的基因操作造成影响,*%-!如不能连续敲除!甚至造成突变,*0-(0&&%年!S ?6$#=$等,**-率先发明了->#!@?,N 基因盒介导的正负筛选法进行基因的无痕修饰!/*1%Copyright ©博看网. All Rights Reserved.中!国!畜!牧!兽!医))卷!0&&8"0&&2年!又相继出现了类似的7?K.'=L I5' =#69等基因盒正负筛选技术,*)-!尽管实现了无痕操作!但它们都只适用于某一特定基因缺失的大肠杆菌!故局限性较大,%%-(0&&0年!]#6$@-I,L>-.#等,*8-对3>"同源重组系统进行改造!得到一种更简化的3>"无痕重组方法!即3>"重组系统与大范围核酸内切酶*!@,>*的切割插入序列结合!利用后者引发双链断裂!再激活分子内重组(0&&*年!基于3>"同源重组的根本原理!在两步法之外!O>C! C$-7等,*(-建立了双质粒系统的同源重组!即Q>-> 7#C7$-7法!该法以重组质粒导入靶基因取代之前的电穿孔法!在细胞内完成质粒的线性化!但仍有筛选效率不高的缺陷&0&&1年!S>>等,%8-对此进一步改造!建立了Q>->"#,=#C$-7法!即构建一套<E D9质粒及<59N X9F重组质粒!使用+%5>基因筛选重组菌株来提高识别效率!减少重组产物诱变的几率(然而!当实际操作中需要同时进行多位点基因改造时!该方法难以很好地适应(0&%8年!a?-7等,*/-在此基础上构建了包含*个等位基因的<]X K,77=供体质粒!过程为$第一步!在*!@,>*系统识别区域的基因置换位点两端插入抗性标记基因&第二步! *!@,>*系统表达的核酸外切酶同时切割供体质粒和菌体基因组!使目的基因片段整合至后者!取代了相应的内源性等位基因(试验最终敲除了5%-&基因!同时插入了9-"&基因(该方法大大提高了工程菌多位点基因改造的效率!为大肠杆菌的基因改造提供了可行的新策略(同年!王瑶等,*2-以9C>% S#V:抗性消除策略取代`6<%`3;策略!在模板质粒<X S[中引入多克隆位点!建立X9S[系统!实现了多基因连续敲除与整合(此外!针对无痕操作效率低的缺点!葛高顺等,*1-适当延长了引物中的同源臂长度!同时提高了筛选培养基中的抗生素浓度!在使重组菌不携带任何抗性筛选标记!实现无痕敲除的基础上!显著提高了基因敲除的成功率(3>$@,L等,)&-在已有的大肠杆菌基因组无痕编辑方法的基础上!建立了一种更为高效的操作系统...X,?C6>@@9?@15@@$@=>"3>,#A H$->>C$-7"-#!X953#(该方法构建了<9?@1,C)质粒!利用3>"同源重组系统促进供体E45的基因组整合!同时通过9?@1介导E45双链裂解进行宿主细胞的反向筛选!由此可见!该方法不需要进行染色体标记(与常规的将9?@1和3>"同源重组系统结合的方法不同!3>$@,L等,)&-利用单链导向345"@$-76>7B$">345#温敏复制特性实现其所编码质粒的简单修复!且不干扰质粒在后续基因操作中的转化!因此具备显著的高效优势((!展!望基于3>"同源重组原理!有多种基因操作方法!作者介绍的两步法是目前大肠杆菌最常用的基因敲除方法(两步法操作简便!应用广泛!且接近无痕!所以在大肠杆菌的基因敲除中得到了广泛应用(此外!针对其并非彻底无痕的不足!国内外科学家对两步法进行了改造!建立了多种无痕重组方法!并取得了一定成果(利用3>"重组法对大肠杆菌进行基因操作已经具有了广泛的应用实践(0&&/年! [$Z#7B,L$等,)%-通过@?,N!,?=基因盒介导的敲除技术成功得到了基因组大小缩减00\的突变株(同时!在致病机理与耐药机制的研究方面!潘虹,)0-对产志贺毒素大肠杆菌@=>V0>毒力基因进行敲除!研究其缺失株的致病性&陈燕杰,)*-通过敲除鸭大肠杆菌标准菌株的多重耐药调控基因'%.&探讨其多重耐药机制(除了在大肠杆菌上的应用外!研究者还将3>"重组法应用于啤酒酵母'假单胞菌'痢疾杆菌'沙门氏菌'志贺杆菌'耶尔辛氏菌'克罗诺氏菌等微生物的基因缺失株与突变株构建!体现了其广泛的应用前景,*)!))!)8-(3>"同源重组技术!尤其是3>"两步同源重组技术方便'快捷'可修正'可改造!在微生物基因操作中具有不可替代的优势!在基因的缺失及功能研究方面的应用也将更加广泛,*%-(而从单纯的3>"同源重组发展到无痕重组!有利于大肠杆菌这一工程菌的基因组精简!减少基因组的非必需区!可减少不必要的代谢途径!从而减少宿主的遗传背景,2-!使后续菌株改造的操作更准确方便(相信随着基因工程技术及对大肠杆菌等工程菌研究的不断深入!3>"同源重组这一基因敲除工具将通过与其他新技术的有机融合而不断完善!并使大肠杆菌的基因改造更加便捷!进而加速微生物科学的发展(参考文献,%-!阳!燕!杨英明!胡!涛'原核微生物基因敲除策略的研究进展,J-'国际口腔科学杂志!0&%(!)*"8#$8/2!82*',0-!P?-7X'E#=_>V<C>@@$#-$@L$7L6I$-"B,>""B C$-7#$ =#=7$-T>,=$#-?-"C>@<#-@$H6>T#C W$C B6>-,>?-"O,<%@>,C>=$#-$-?W$?-<?=L#7>-$,M+5"2.#5"#%57(#,J-'U.7$3#2.+#$4#5.7,#7(79/!0&%)!8$822'2*1%Copyright©博看网. All Rights Reserved.!/期李!鑫等$3>"两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用,*-!P?-7X'K H>3T?,$6$=?=>@@=C>@@!C>@$@=?-,>!$-W?@$#-?-"<=L#7>-$,$=I#T?W$?-<?=L#7>-$,M+5"2.#5"#%57(#,J-'L@7DF$2!0&%8!%&"*#$>&%%1(12',)-!李继东!才学鹏'山羊痘病毒8?基因功能缺失对其增殖的影响,J-'中国畜牧兽医!0&%/!))"0#$*%1!*0(',8-!赵雪丽!闫若潜!吴志明!等'鉴别猪伪狂犬病病毒9M 基因缺失疫苗和野毒感染的二重:93诊断方法的建立和应用,J-'中国畜牧兽医!0&%8!)0")#$2(8!2/&',(-!陈!柳!余!斌!倪!征!等'表达小鹅瘟病毒c:0蛋白重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性,J-'中国农业科学!0&%(!)1"%)#$02%*!020%',/-!周化民!孙旭利!陈建明'同源重组和重组酶3?"8%的调控,J-'生物化学与生物物理进展!0&%(!%0$%%8)!%%(0',2-!卫亚红!段!敏!向照举!等'降解布洛芬克隆菌株转座子插入突变体的构建,J-'西北农林科技大学学报"自然科学版#!0&%(!))")#$%*8!%)%',1-!吴程华!严玉霖!高!洪!等'3>"同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用,J-'上海畜牧兽医通讯!0&%8!%$1!%%',%&-!曾吉祥'3>"%F;同源重组技术在载体构建中的应用,J-'生物技术世界!0&%8!/$0*0!0**',%%-!刘陆罡!纪晓俊!沈梦秋!等'大肠杆菌无痕重组的策略与应用,J-'中国生物工程杂志!0&%)!*)"2#$22!1(',%0-![B C<L I]9'_@>#T H?,=>C$#<L?7>6?A H"?C>,#A H$!-?=$#-T B-,=$#-@=#<C#A#=>7>->C><6?,>A>-=$-M+5"2.#5"#%57(#,J-'>%53M.#7(!%112!%2&"2#$0&(*!0&/%',%*-!a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a>4!S$R!>=?6';L>H>=?<C#=>$-#T <L?7>6?A H"?H$-"@<C>T>C>-=$?66I=#?-$-=>C A>"$?=>$-E45C>-?=B C?=$#-,J-'K7*.$%(7:47(25*(%.>#7(J79/!%112!0/(")#$/0%!/*%',0%-!S$R!]?C?.#B@$@Q!9L$BX]!>=?6';L>H>=?<C#!=>$-#T<L?7>6?A H"?<C#A#=>@@=C?-">V,L?-7>,J-'K7*.$%(7:47(25*(%.>#7(79/!%112!0/(")#$/**!/))',00-!]#W?663![?==L>U@N P';#C#$"?6@=C B,=B C>#T 6?A H"?!>V#-B,6>?@>,J-'D5#2$52!%11/!0//"8***#$%20)!%20/',0*-!王!锴!张志强!朱春红!等'致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌5/%'5.C双基因缺失株构建及部分生物学特性分析,J-'中国兽医学报!0&%*!**"1#$)1!8)',0)-!]C$@L-?-X;![##6A?-[9!S??C;c!>=?6' F@@>-=$?6W?6$"?=$#-A>=L#"@T#C M657(#@=C?$-@,C>?!=>"H I,L C#A#@#A>>-7$->>C$-7,J-'K7*.$%(7:>#7J(79#5%(M$9#$22.#$9!0&%8!1"%#$%!%)',08-!:?@@I X K!a BM!S$R!>=?6'3$-7@?-"T$6?A>-=@#TH>=?<C#=>$-T C#AH?,=>C$#<L?7>6?A H"?@B77>@=?@B!<>C T?A$6I#TC>,#A H$-?=$#-<C#=>$-@,J-'L.7522-#$9+7:3"2I%3#7$%(&5%-2'/7:D5#2$52+7:3"2<$#32-D3%32+7:&'2.#5%!%111!1("2#$)0/1!)02)',0(-!:#=>>=>53!`>-=#-59![B C<L I]9'3#6>@#T 3B W9?-"3>,Q$-:L?7>53>"!A>"$?=>"C>,#A H$-?!=$#-,J-'K7*.$%(7:>%532.#7(79/!%111!%2%"%/#$8)&0!8)&2',0/-!原志伟'`%2大肠杆菌黏附素菌体表面功能性展呈及其染色体b质粒平衡致死系统的构建,E-'扬州$扬州大学!0&&/',02-!吕沈聪!赵颖颖!钟卫鸿'3>"同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用,J-'化学与生物工程!0&%*!*&"(#$%!(',01-!程毅鹏!饶志明!杨套伟!等'一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用,J-'应用与环境生物学报!0&%8!0%"*#$)*8!))&',*&-!王少辉'禽致病性大肠杆菌E F0&8N黏附及侵袭相关因子的致病作用,E-'南京$南京农业大学!0&%%' ,*%-!胡逢雪!丁!锐!崔震海!等'大肠杆菌基因无痕敲1*1%Copyright©博看网. All Rights Reserved.中!国!畜!牧!兽!医))卷!除技术及策略,J-'生物技术通讯!0&%*!)$880!88/' ,*0-!;$@,L>C N]!c#-FJ!]?B T>CN!>=?6';U#!@=><C>"!A>"$?=>"C>,#A H$-?=$#-T#C W>C@?=$6>L$7L!>T T$,$>-,IA?C.>C6>@@E45A?-$<B6?=$#-$-M+5"2.#5"#%57(#,J-'>#7325"$#P*2+!0&&(!)&")&#$%1%!%1/',**-!S?6$#=$[E!O>?=LJ]'5->U A>=L#"T#C7>->C?!=$-7<#$-=A B=?=$#-@$-H?,=>C$?6?C=$T$,$?6,L C#A#!@#A>@H I L#A#6#7#B@C>,#A H$-?=$#-$-M+5"2.#5"#%57(#,J-'I*5(2#5&5#-+B2+2%.5"!0&&%!01"*#$F%)' ,*)-![?"I?7#6[!56!56?A$O!S>W?C@.$R!>=?6'Q>->C><6?,>A>-==>,L-$Y B>@T#C M+5"2.#5"#%57(#7>-#A>A#"$T$,?=$#-,J-'U7(#%4#5.7,#7(79#5%!0&%%!8("*#$08*!0(*',*8-!]#6$@-I,L>-.#c!:6B-.>==Q!O>C C$-79E!>=?6' F-7$->>C$-7?C>"B,>"M+5"2.#5"#%57(#7>-#A>,J-'A2$7'2B2+2%.5"!0&&0!%0")#$()&!()/',*(-!O>C C$-79E!Q6?@->CJE!N6?==->C`3'Q>->C>!<6?,>A>-=U$=L#B=@>6>,=$#-$3>7B6?=>"@B<<C>@@$#-#T?A H>C A B=?=$#-@$-M+5"2.#5"#%57(#,J-'A2$2!0&&*!*%%"0#$%8*!%(*',*/-!a?-7J!X B-N!O B?-7O!>=?6'[B6=$<6>!@$=>7>->=!$,A#"$T$,?=$#-@$-M+5"2.#5"#%57(#B@$-76?A H"?!3>"C>,#A H$-?=$#-?-"K!X,>K,6>?W?7>,J-'>#7325"$7(79/@2332.+!0&%8!*/"%&#$%!2',*2-!王!瑶!许!杨!陈!楠!等'在大肠杆菌中利用X9S[系统进行高效率5!3>"基因敲除%整合的新策略,J-'微生物学通报!0&%8!)0")#$(11!/%%',*1-!葛高顺!张立超!赵!昕!等'大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法,J-'中国生物工程杂志!0&%)!*)"(#$(2!/)',)&-!3>$@,L93!:C?=L>C]SJ';L>-#!X953"X,?C6>@@ 9?@15@@$@=>"3>,#A H$->>C$-7#@I@=>A T#C7>-#A>>"$=$-7$-M+5"2.#5"#%57(#,J-'D5#2$3#:#5B2C7.3+!0&%8!8$%8&1(',)%-![$Z#7B,L$O!;?-?.?A?@B"?]![#C$O'5@$A<6>A>=L#"T#C A B6=$<6>A#"$T$,?=$#-#T=L>M+5"2.#5"#%57(#]!%0,L C#A#@#A>,J-'>#7+5#2$52!>#7325"$7(79/!%$->#75"2'#+3./!0&&/!/%"%0#$01&8!01%%',)0-!潘!虹'产志贺毒素大肠杆菌毒素基因敲除及毒力测定的研究,E-'兰州$甘肃农业大学!0&%0',)*-!陈燕杰''%.&基因对鸭大肠杆菌多重耐药的调控作用,E-'郑州$河南农业大学!0&%0',))-!S$?-73!S$BJ'X,?C6>@@?-"@>Y B>-=$?67>->A#"$T$!,?=$#-$-L+2*-7'7$%+B@$-7:93<C#"B,=T6?-.>"H I@L#C=L#A#6#7I C>7$#-@,J-'>4!4#5.7,#7(79/!0&%&!%&"%#$0&1',)8-!吕雪莲!于申业!倪宏波!等'通过改进3>"重组方法快速构建肠炎沙门菌毒力岛X:K!%缺失株,J-'中国预防兽医学报!0&%)!*("%%#$280!288'"责任编辑!晋大鹏#&)1%Copyright©博看网. 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Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展
2008, 28( 12)
张 雪 等: R ed重组系统用于大肠杆 菌基因修饰研究进展
91
表 1 引物同源臂长度 T ab le 1 Th e length of p rim er homo logou s arm s
国内外文献报道 R ed 载体系统 抗性模板 引物同源臂的长度
白光兴等 ( 2005) pKD 46
国内外文献报道
LO阿拉伯糖 诱导浓度
SerraOM oreno等 [11] 100 mm ol/ L
白光兴等 ( 2005) 30 mm ol /L
付小花等 ( 2007) 30 mm ol /L
L ee等 [ 13]
10 mm ol /L
韩聪等 ( 2004)
)))
(载体系统均为 pKD 46)
LO阿拉伯糖 诱导时间
复苏时间 复苏温度
))) 60 m in 90 m in ))) )))
1~ 3 h 37e
60 m in 37e
1h
30e
)))
)))
1h
30e
92
中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo.l 28 N o. 12 2008
pKD 46 含 有 温度 敏 感型 的 复 制起 点 oriR101, 在
90
中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo.l 28 N o. 12 2008
30e 培养时可以正常复制, 而高于 37e 时会自动丢失。 在 pKD46 上还含有受 ParaB启动 子调控的 exo、bet、gam 基因, 它们通过 LO阿拉伯糖诱导表达, 并携带氨苄青霉 素抗性基因作为筛选标记 ( 图 1) 。
利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除
ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年2月21(1):35～38利用R ed 重组系统对大肠杆菌ClpP 基因的敲除白光兴, 孙志伟, 黄 莺, 俞炜源3(军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071)摘要 利用含有质粒p K D46的菌株BW25113,在阿拉伯糖诱导后,表达λ噬菌体的3个重组蛋白,宿主菌就具有了同源重组的能力.设计的引物5′端有50bp 的拟敲除基因的同源臂,3′端为扩增引物,以p K D3为模板,扩增两侧含FRT 位点的氯霉素抗性基因,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体.再利用表达Flp 重组酶的质粒pCP20,可将FRT 位点之间的氯霉素抗性基因删除.利用该重组系统,构建了ClpP 蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用.关键词 ClpP ,F LP 重组酶,FRT 位点,Red 重组酶中图分类号 Q789Deletion of clpP in Chromosome of E .coli by R ed R ecombinationBAI G uang 2X ing ,S UN Zhi 2Wei ,H UANG Y ing ,Y U Wei 2Y uan3(Institute o f Biotechnology ,Academy o f Military Medical Sciences ,Beijing 100071,China )Abstract Plasmid p K D46can express three proteins :G am ,Bet and Ex o.G am inhibits the host RecBC D ex onuclease V ,s o that Bet and Ex o can gain access to DNA ends to prom ote recombination.BW25113with p K D46has the function of recombination when induced by L 2arabinose.PCR products were obtained by using primers with 502bp extension which were hom olog ous to clpP and by using tem plate plasmid named p K D3carrying chloram phenicol resistance gene flanked by FRT sites.The PCR products were introduced into BW25113by electroporation.The strains expressing chloram phenicol resistance gene were selected by chloram phenicol agar.The chloram phenicol resistance gene was then eliminated by using a helper plasmid ,pCP20,encoding the Flp ing this system ,ClpP gene in chrom os ome of E scherichia coli was deleted.K ey w ords ClpP ,F LP recombinase ,FRT sites ,Red recombinase收稿日期:2004202225,接受日期:2004204229国家高技术研究发展计划(863计划)十五课题(N o.2001AA215351)3联系人 T el :(010)66948828,E 2mail :Y uwy @nic.bm Received :February 25,2004;Accepted :April 29,2004Supported by National High T echnology Research and Development Program of China (863Program ),N o.2001AA2153513C orresponding author T el :(010)66948828E 2mail :Y uwy @nic.bm 在基因工程的研究工作中,外源蛋白在大肠杆菌中降解是一个经常遇到的问题,主要原因是大肠杆菌的蛋白水解酶识别并切割了外源蛋白的特异性氨基酸序列.目前所用的大肠杆菌工程菌株中,已有Lon 蛋白酶缺失的菌株,如BL21(DE3)等.但是,不同蛋白酶识别和切割的序列是不一样的.显然,一种蛋白酶的缺失不能减少如此众多的外源蛋白的降解,建立新的蛋白酶缺失菌株是非常必要的.ClpP 属于Clp 分子伴侣家族,与ClpA 、ClpB 和ClpX 相结合,能降解大肠杆菌内的一部分蛋白质[1].ClpP 属丝氨酸型蛋白酶,由2个七聚体形成的环状结构叠加而成.ClpP 可直接降解短肽片段(少于6个氨基酸),稍长的肽需要ClpP 复合体,但不需要ATP ,要降解更大的片段则需要ATP 提供能量.ClpP 与ClpA 结合,可降解β2半乳糖苷酶融合蛋白[2].其机制是识别蛋白质C 端的多肽序列ANDE NY A LAA ,在ClpA 或ClpX 的协助下,将含有此序列的肽链降解.本研究拟在现有的工程菌株中通过敲除ClpP 基因,构建一个蛋白酶缺失的新菌株.传统的基因敲除需要利用RecA 蛋白的同源重组功能,构建环状的打靶载体.这种载体有3个重要特点:1)含一个抗性基因作为筛选标志;2)有一个温度敏感复制子;3)含有待敲除基因两侧的长同源区.此方法有两点不足:第一,要构建一个带有长同源臂(500bp )的打靶载体;第二,RecA 的表达载体在胞内时间过长,易引起一些错误的重组,而且这些错误的重组体比原来的菌株更具生长优势[3].近年来发展起来的依赖λ噬菌体的Red 重组系统,可以直接利用含同源臂的PCR 线形片段,替换出同源臂内的目的基因.该系统利用λ噬菌体3个蛋白质Ex o 、Bet 和G am ,G am 抑制大肠杆菌的RecBC D 核酸外切酶V 活性,使外源线形DNA 不至立即被降解,Ex o 和Bet 引导线性片段与同源区发生重组置换,而且效率较传统的同源重组方法高几十倍[4].我们利用这套系统构建ClpP 蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株.1 材料与方法111 质粒与菌株p K D46(oriR 101rep A 101ts P araB 2gam 2bet 2exo Amp )为同源重组的协助质粒,是温度敏感复制子,高于37℃该质粒会丢失,阿拉伯糖诱导后表达G am ,Bet和Ex o 三个λ噬菌体重组酶(见Fig 11).p K D3(oriRγcat bla )为PCR 扩增提供氯霉素抗性基因的模板,氯霉素抗性基因两侧有FRT 位点(F LP 重组酶识别位点),为重组转化体提供筛选标志.pCP20是F LP 重组酶的表达质粒,复制子为温度敏感型,42℃诱导F LP 重组酶表达,质粒也逐渐丢失,该质粒用于消除FRT 位点间的氯霉素抗性基因.BW25113(lacIqrrnB T 14ΔlacZ WJ 16hsd 514ΔaraBAD AH 33ΔrhaBAD LD 78)是Fig.1 The map of recombinant plasm id p K D46用于进行同源重组的菌株,阿拉伯糖的代谢基因缺失,有利于p K D46的阿拉伯糖启动子的诱导表达.以上质粒和菌株由本所王恒梁博士惠赠[5].H B101和Origami (DE3)由本室保存.112 试剂Taq DNA 聚合酶,氨苄青霉素和氯霉素均购自上海生工公司,L 2阿拉伯糖购自北京新经科生物技术公司,质粒提取试剂盒购自Promega 公司,DNA 胶回收试剂盒购自T araka 公司,DNA ladder 购自华美公司.PCR 引物由上海生工公司合成.113 细菌培养,电转化及PCR 方法参见文献[5].114 PCR 引物的设计用于同源重组的引物,5′端为50bp 的ClpP 基因两侧的同源臂,3′端为20bp 的用于扩增氯霉素抗性基因(两侧有FRT 位点)的引物,以p K D3为模板,常规PCR 方法扩增氯霉素抗性基因,产物片段长1149bp ,胶回收后用于电转化.上游同源臂引物H12P1(划线部分为同源臂,是从起始密码子开始的50bp 的序列):5′2A T G GA A C C GT GC GAAAA GC C TC T T TC G GT GT TA GC GTA A CA A CA A A A GA GC GA T T GT GTA G GC T G GA G 23′下游同源臂引物H22P2(划线部分为同源臂,是从终止子向左45bp 的序列):5′2T TA C GA T GGGTCA GAA TC GAA TC GA C C A GA C C GTA T TC CA C C GC T TAA T TAA C GGC T GA CA T G G GA A T TA G 23′鉴定引物(在同源臂的外侧,见下面序列中的划框部分)上游:5′2ACG CG CT AAATT CG C AC AAAGG 23′下游:5′2AT AG CGG C AC AG TTG CG CCT 23′引物设计如下:划线部分是同源臂,省略号代表clp 的一些编码序列,阴影部分为clpP 的起始密码子和终止密码子;划框部分为鉴定引物,鉴定引物在同源臂的外侧,该引物之间的序列在野生菌株中是882bp ,clpP 被氯霉素抗性基因替换后应为1239bp ,氯霉素抗性63中国生物化学与分子生物学报21卷基因被消除后长309bp ,通过此引物作PCR 扩增可初步鉴定菌株的基因型.115 同源重组阳性克隆的获得同源重组的一般步骤[6,7]:1.PCR 扩增带FRT 位点的氯霉素抗性基因(由p K D3提供模板)(Fig.2A ).2.将以上的线性片段转入表达Red 重组酶的菌株中(Fig.2B ).3.选择氯霉素抗性转化体(Fig.2C ).4.F LP 重组酶消除氯霉素抗性基因(Fig.2D ).Fig.2 A sim ple gene disruption strategy H1and H2refer to the hom ology extension.P1and P2refer to prim ing sites将转化有p K D46的BW25113菌株接种,30℃培养过夜,次日1∶50接种至100ml LB 培养基(氨苄青霉素的浓度为70mg Πml ),30℃培养至A 600=0125时,加入L 2阿拉伯糖至30mm ol ΠL ,诱导1h (A 600不能超过016),使p K D46上的Ex o 、Bet 和G am 三个蛋白充分表达.冰上预冷10min ,4100r Πmin ,4℃离心10min ,弃培养基,用预冷10%甘油离心洗涤3次,浓缩100倍成1ml 的感受态细胞,每管100μl ,存放于-70℃冰箱待用.将同源臂引物扩增的氯霉素抗性基因片段约200ng 加入感受态细胞,混匀,转入012cm 电击杯中,用Bio 2Rad 电击仪作电转化.电击条件:200Ω,25μF ,电击电压213kV ,电击时间为4～5ms ,电击后迅速加入1ml 的LB ,150r Πmin ,37℃培养1h ,之后涂于氯霉素平板(氯霉素浓度为34ng Πml )上.12h 后用PCR 法鉴定长出的氯霉素抗性克隆.2 结果211 氯霉素抗性基因替换了ClpP 基因氯霉素平板上长出的克隆,还需鉴定整合的位置是否正确.用鉴定引物对氯霉素抗性克隆进行PCR 扩增,扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,通过产物大小判断引物间的序列变化(见Fig.3).共鉴定了18个氯霉素抗性克隆,全部为正确重组转化体,正确重组率为100%.Fig.3 E lectrophoresis analysis of PCR products of wild type and positive clones with chloram phenicol resistance1:W ild type ;2:Recombinant with chloram phenicol resistance ;M:200bp DNA ladder 用鉴定引物对野生型和重组转化克隆进行PCR扩增,结果野生型为882bp ,而重组体为1239bp.为进一步证实核酸序列,对PCR 产物测序,结果显示clpP 同源区内序列已被氯霉素抗性基因替换.212 氯霉素抗性基因的消除pCP20是带有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因的质粒,热诱导后可表达Flp 重组酶,该酶可特异性识别FRT 位点,通过重组可将FRT 位点间的序列删除,只保留一个FRT 位点.将pCP20转入氯霉素抗性克隆,30℃培养8h ,后提高到42℃过夜,热诱导F LP 重组酶表达,质粒也逐渐丢失.用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板,挑长出的单克隆点到氯霉素抗性平板上,未生长的为氯霉素抗性基因已被Flp 重组酶删除.用鉴定引物作PCR 对氯霉素抗性消失的克隆进行鉴定(见Fig.4).Fig.4 E lectrophoresis analysis of PCR products of the positiveclones without chloram phenicol resistance1:W ild type ;2:Recombinant with chloram phenicol resistanc ;3:The clone lost chloram phenicol resistance ;M:200bp DNA ladder以上为鉴定引物对野生型,氯霉素抗性克隆和73第1期白光兴等:利用Red 重组系统对大肠杆菌ClpP 基因的敲除 氯霉素抗性基因被删除后的3个菌株进行鉴定的结果.用Flp 重组酶消除了氯霉素抗性基因,在同源区内只保留了一个FRT 位点,鉴定引物PCR 扩增的片段长309bp ,PCR 产物测序结果如下: 划线部分为同源臂,划框部分为FRT 位点,测序结果表明氯霉素抗性基因已被消除.此测序结果反映了细菌基因组上的序列情况.在同源序列的两侧还保留了ClpP 基因的非翻译区,而ClpP 基因的编码区已被删除.FRT 位点的结构如下: 向右的箭头是F LP 的结合元件,向左的箭头是两个反向重复,重组就发生在结合元件和8bp 划框的核心区之间.3 讨论利用λ噬菌体的重组系统,我们成功地敲除了大肠杆菌的ClpP 蛋白酶基因,构建了clpP 缺失的工程菌株,而且在操作位点没有留下选择标志.该菌株可望在减少某些外源蛋白的降解方面发挥一定的作用.本研究初步摸索了该系统的实验条件,优化阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间.阿拉伯糖最佳诱导浓度为30mm ol ΠL ,高于120mm ol ΠL ,细菌生长就出现抑制.诱导时间和细菌的对数生长期是一个矛盾.有文献认为,诱导后A 600值不能超过016,但不同的菌株的生长状态是不一样的.实验表明,必须要有40min 到60min 的诱导时间才能保证重组效率.该套系统在不同菌株中的作用效果不一样,在BW25113中最高,H B101次之,Origami (DE3)中最低,在BL21(DE3)和X L 2blue 中没有成功,原因尚不清楚.该方法不但可以对大肠杆菌的基因组进行修饰,还可以对细菌人工染色体(BAC )和质粒进行改造.与传统的基因操作方法相比,该方法具有以下的特点:1)可在任何位置进行点突变、缺失、插入和克隆;2)可进行大片段克隆,无须进行长链PCR 及寻找合适的酶切位点;3)克隆分子完全忠实亲代分子;这是因为重组发生在胞内,大肠杆菌的复制、修复系统保证了子代分子的忠实性[8].在功能基因的研究中,这套系统使复杂的转基因和基因敲除变得简单.还可以将cre 2或Flp 基因引入BACs ,在转基因株的子代中进行条件基因敲除.该方法是近年来才发展起来的一项新技术,对其探索才刚起步,我们期待着该项技术在分子生物学领域给我们带来更多的惊喜.参考文献(R eferences )1 Chung C H ,Seol J H ,K ang M S.Protease T i (Clp ),a multi 2com ponentATP 2dependent protease in E scherichia coli .Biol Chem ,1996,377:549～5542 Lee C ,Schwartz M P ,Prakash S ,lwakura M.ATP 2dependent proteasedegrade their substrates by processively unraveling them from the degradation signal.Mol Cell ,2001,7:627～6373 白光兴,孙志伟,俞炜源.大肠杆菌重组工程.生物技术通讯(BaiG uang 2X ing ,Sun Zhi 2W ei ,Y u W ei 2Y uan.Recombinogenic engineering 2new options for cloning and manipulating DNA in E scherichia coli .LettBiotechnol ),2003,14:410～4124 C opeland N G,Jenkins N A ,C ourt D L.Recombineering :A powerfulnew tool for m ouse functional genom ics.Nat Rev ΠG enet ,2001,2:769～7795 Sambrook J ,Russell D W.Molecular Cloning :A Laboratory Manual ,3rded.New Y ork :C old S pring Habor Laboratory Press ,20016 Datsenko K A ,W anner B L.One 2step inactivation of chrom os omal genesin E scherichia coli K 212using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA ,2000,97(12):6640～66457 Y u D ,E llis H M ,Lee E 2C ,Jenkins N A ,C opeland N G,C ourt D L.Anefficient recombination system for chrom os ome engineering in E scherichiacoli .Proc Natl Acad Sci USA ,2000,97:5978～59838 Muyrers J P P ,Zhang Y,Francis A.Recombinogenic engineering 2new options for cloning and manipulating DNA.Trends Biochem Sci ,2001,26(5):769～77983中国生物化学与分子生物学报21卷。
red同源重组基因敲除原理与步骤
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细菌λ Red 重组技术的应用及其影响因素
细菌λ Red 重组技术的应用及其影响因素付喜爱;张德显;周维;于立辉;田春莲;刘明春【摘要】由λ噬菌体的exo、beta、gam 3个基因分别编码的Exo、Beta和Gam蛋白组成λ Red同源重组系统。
λRed重组是细菌靶基因置换的有效技术，该技术发展迅速，已广泛应用于大肠埃希菌等细菌染色体DN A的基因敲除、基因整合，可以对任何大小的DN A分子进行精确修饰。
利用λ Red重组系统不仅可以构建工程菌，还可以为研究细菌的致病机理和耐药机制提供新的方法。
然而，许多应用因重组频率而受到限制，影响重组频率的因素主要有底物浓度、同源片段的长度、内源性核酸酶、错配蛋白等。
论文综述了λ Red同源重组技术的应用进展及影响重组的因素，以期为优化重组试验方案及提高实验的成功率提供帮助。
%TheλRed homologous recombination system is consisted ofExo ,Beta and Gam protein ,which are encoded by exo ,beta ,gam intheλphage respectively .This system has got an increasing development because of its efficiency in gene replacement of bacteria .It has been widely used in bacterial gene replace‐ment including gene knockout and gene integration in E .coli genomic DNA ,precise modification without consideration of any molecule weight .TheλRed homologus recombination system can not only build engi‐neering bacteria ,but also can provide a new insight for mechanisms of drug resistance and pathogenicity in bacteria .However ,many applications are limited by its low recombination frequency .Reports indicated that many factors contribute to recombination such as concentration of substrate ,length of homologous fragment ,endogenous nucleases ,mismatch protein and so on .In thispaper ,the application and factors , which may influenceλRed homologous recombination ,were discussed in detail ,and aimed to optimize pro‐tocol and improve the efficiency in experiments .【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P91-95)【关键词】λRed同源重组;重组频率;底物;内源性核酸酶;错配蛋白【作者】付喜爱;张德显;周维;于立辉;田春莲;刘明春【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】Q78同源重组是指发生在姐妹染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，常用于基因敲除或者置换。
细菌基因缺失株的构建方法
二、Red重组系统介绍 Red重组系统
Байду номын сангаас
背景 组成 原理
利弊
3
二、Red重组系统介绍
1、背 景
敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统。RecA重 组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系，它由RecA蛋白和 RecBCD蛋白组成。这种方法需要较长的靶基因同源序列，还 需构建具有靶位点的质粒，重组效率较低。
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二、Red重组系统介绍
2、组 成
质粒pCP20： 是具有氨苄青霉素(Amp) 抗性和氯霉素(Cm)抗性 的质粒，含有温度敏感 型复制子，能够表达 FLP重组酶，42℃诱导 下FLP重组酶得到表达， 质粒也逐渐丢失，该质 粒用于消除FRT位点间 的cat基因。
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二、Red重组系统介绍 3、原 理
汇报提纲
1.
基本概念
2.
Red重组系统介绍
3. 重组自杀性质粒方法简介
1
一、基 本 概 念
基因的同源重组（homologous recombination） ， 又叫基因打靶（gene targeting）， 是指外
源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发 生重组， 并整合在预定的位置上， 从而改变了 细胞某些遗传特性的方法， 重组的目的是为了敲 除某个基因。
4
二、Red重组系统介绍
2、组 成
质粒pKD46： 为同源重组的 辅助质粒，含 温度敏感型复 制子，高于 37℃该质粒会 丢失，阿拉伯 糖诱导后能够 表达Gam、Beta 和Exo 3个λ噬 菌体重组酶。
5
二、Red重组系统介绍
2、组 成
质粒pKD3： 为 PCR 扩增提供 氯霉素抗性基因 的模板，氯霉素 抗性基因两侧有 FRT位点(FLP重组 酶识别位点)，为 重组转化子提供 筛选标志。
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法基因敲除是一种使特定的基因失活或缺失的技术，它可以用来研究基因的功能和表型。
基因敲除的一种常用方法是利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
然而，这种方法并不总是有效，有时候细胞会利用非同源末端连接机制来修复DNA双链断裂，从而导致不可预测的突变或损伤。
本文将介绍利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法，以及它们的优缺点和影响因素。
同源重组同源重组是一种利用未受伤的姐妹染色单体或者人工提供的供体模板作为修复模板的方式，它可以保持基因组的完整性和稳定性。
同源重组主要发生在S期或G2期，当细胞有两份相同或相似的染色单体时。
同源重组的步骤如下：•首先，细胞需要将双链断裂的末端进行修剪，产生3’单链DNA（ssDNA），这个过程需要MRN复合物（由Rad50、Mre11和Nbs1组成）和转录因子CtIP（CtBP-interacting protein）等蛋白质的参与。
•然后，ssDNA被复制蛋白A（Replication protein A，RPA）包被，使其免受核酸酶的降解，并去除二级结构。
•接着，由BRCA2蛋白介导，RPA被重组酶RAD51替换，形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上或供体模板上的同源序列。
•最后，RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板，并与同源DNA序列配对形成D-Loop结构，D-Loop延伸或与另一个末端连接，完成修复过程。
利用同源重组实现基因敲除的方法是设计一个与目标基因有一定同源性但也有一些差异的供体模板，比如在其中插入了一个标记基因或者删除了一个关键片段。
这样，当细胞利用同源重组机制来修复双链断裂时，供体模板会与双链断裂的末端配对，并将修改过的目标基因整合到细胞基因组中，从而达到基因敲除的目的。
利用同源重组实现基因敲除的优点是可以精确地替换或插入目标基因，不会引入额外的突变或缺失。
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
同源重组在细菌基因敲除中的运用
• 基因功能研究方法
– 计算机预测基因功能 – 基因失活
• 基因敲除knock out • 转座子插入突变 • 反义RNA技术（RNA沉默）：knock down
– 基因过表达（over-expression） – 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
• 细菌是生命科学研究重要的模式生物
细菌的遗传变异现象
• 遗传（heredity): 子代与亲代之间生物学 性状具有相似性。使细菌的性状保持相对 稳定，且代代相传，使其种属得以保存。 • 变异(variation)：在一定条件下，若子代 与亲代或子代与子代之间的生物学性状出 现差异。变异使细菌产生变种和新种，以 利于细菌的生存及进化。
表皮葡萄球菌saeRS敲除
4. 运用pKOR1质粒敲除G+球菌基因
Map of pKOR1
pKOR1质粒特点
• A replacement plasmid that employs antisense secY RNA expression (secY expression are essential for bacterial growth and survival) for counter-selection （obviated the need for antibiotic marker selection） • The lambda recombination cassette (Invitrogen) is another feature of pKOR1 that permits rapid cloning of mutant alleles without the use of restriction enzymes and ligases
Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【摘要】大肠杆茵基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟.综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势.%Gene knockout technique of Escherichia coli is developing rapidly.Emerging of various kinds of new technologies has simplified the genome modification of E.coli than before.Especially,the Red homologous recombination system becomes more and more mature in gene knockout of E.coll.In this article,a few different kinds of Red homologous recombination technologies were reviewed.The mechanism and application strategies of each method were analyzed with its characteristics and superiority highlighted.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除【作者】吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032【正文语种】中文【中图分类】Q78随着多种细菌基因组测序工作的完成，获得了大量的分子遗传学信息。
大肠埃希菌中λ-Red同源重组系统介导的trp和yfp基因融合表达的研究
大肠埃希菌中λ-Red同源重组系统介导的trp和yfp基因融合表达的研究陈兴;姚玉峰;周爱萍;倪进婧【摘要】目的为研究大肠埃希菌中色氨酸合成酶α亚基编码基因(trpA)的表达,利用λ-Red系统将trpA、黄色荧光蛋白基因(yfp)、氯霉素抗性编码基因(cat)融合片段敲入基因组中.方法将trpA、yfp、cat基因进行融合PCR,获得重组片段,转化入MG1655菌株中,利用pKD46编码的λ-Red系统将片段重组入基因组中,经PCR 验证及测序鉴定正确后,荧光显微镜观察融合蛋白表达.结果成功获得trpA-yfp-cat 重组片段,转化入MG1655菌株中获得阳性克隆,经测序鉴定正确.荧光显微镜观察可见细菌胞质内弥散分布黄色荧光,表明trpA-yfp融合表达片段成功地在MG1655菌株中表达.结论运用λ-Red系统可将trpA-yfp融合片段敲入MG1655菌株基因组中原位替换trpA基因,通过观察YFP蛋白的表达间接反映trpA基因的表达,具有不改变trpA基因自身功能和细菌生长的优点,为进一步研究大肠埃希菌色氨酸合成途径奠定基础.%Objective To investigate the expression of tryptophan synthase a subunit-encoding gene (trpA) of Escherichia coli (E. coli), fusion fragment of trpA, yellow fluorescent protein gene (yfp) and ehloramphenicol-encoding gene (cat) was knocked into E. coli strainMG1655 genome using X-Red system. Methods Target genes trpA, yfp and cat were amplified by PCR, and the recombinant fragment was obtained by fusion PCR. The recombinant fragment was transformed into E. coli strain MG1655 harboring genes of X-Red system in plasmid pKD46. After PCR checking and sequencing confirmation, the fusion protein expression was observed by fluorescence microscopy. Results The recombinant fragmenttrpA-yfp-cat was successfully obtained and transformed into MG1655, and the positive clones were screened out and confirmed by sequencing. The yellow fluorescence was observed throughout the bacterial cytoplasm, indicating that trpA-yfp fusion protein was successfully expressed inMG1655. Conclusion The trpA gene could be replaced by trpA-yfp fusion fragment in situ using X-Red system, and its expression could be reflected indirectly by observing the expression of yellow fluorescent protein. The function of trpA and bacterial growth have not been changed, which lays foundation for the further study of E. coli tryptophan synthesis.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)011【总页数】5页(P1406-1410)【关键词】λ-Red系统;融合PCR;黄色荧光蛋白;色氨酸合成酶α亚基【作者】陈兴;姚玉峰;周爱萍;倪进婧【作者单位】华中农业大学工学院,武汉430070;上海交通大学基础医学院病原生物学教研室,上海200025;上海交通大学基础医学院病原生物学教研室,上海200025;上海交通大学基础医学院病原生物学教研室,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R37色氨酸是必需氨基酸之一，对于人类和动物的生长发育都至关重要，哺乳细胞不能自身合成，因此色氨酸被广泛应用于食品、药品、饲料添加等领域。
利用Red同源重组技术构建产L_苏氨酸的基因工程菌(1)
本研究通 过分析 L-苏氨酸 的代谢途 径, 应用 R ed 同源重组技术敲除大肠杆菌 ITH R 中 L-苏 氨酸合成的 支路代谢途径中编码高丝氨酸转酰基酶的 m etA 基因和 编码苏氨酸脱 氢酶的 ilvA 基因, 分别构 建了单敲 除突 变菌和双敲除突变菌。将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065转入突变株中, 进行 5 L 发酵罐连续发酵 培养, 结果表明阻断 L-苏氨酸的代 谢旁路途径 可以增 强 L-苏氨酸的积累。
2010, 30( 3)
闫继爱 等: 利用 R ed同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌
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pW YE065与 ITHR / pW YE 065L-苏氨酸产量差异的统计 学意义 检 验 采 用 Coch ran 检 验 方 法 分 析 比 较; 菌 株 ITHR v m etA v ilvA / pW YE 065 与 ITH R /pWYE065 L-苏 氨酸产量差异的统计学意义检验采用 W ilcoxon 秩和检 验方法分析比较。p < 0. 05时结果具有统计学意义。
收稿日期: 2009-09-23 修回日期: 2009-11-04 * 国家 / 8630计划 ( 2006AA 02Z216 ) 资助项目 ** 通讯作者, 电子信箱: w enty@ im. ac. cn
苏氨酸生产菌 株, 由于随机 突变造成菌 体遗传背 景改 变、生产能力减 弱、发酵周期长, 不利于 进一步提 高产 量。而利用分子生 物学的研究 方法和 技术, 通过 对基 因的表达和调控进行有目的性的改造而构建的工程菌 株, 不产生次 级突 变, 代 谢副 产物 少, 产 量容 易 提高。 随着分子生 物学技术以 及系统代谢工 程理论 的发展, 更多的分子生 物学手段运 用于菌种的 构建和改 造, 以 提高生产菌 L-苏氨酸的产量。
肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建
肠出血型大肠埃希菌O157：H7 espF基因缺失株和回补株的构建华颖;孙琦;王湘雨;杜艳丽;邵娜;张其威;赵卫;万成松【摘要】目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的espF基因及其核苷酸片段;建立以pBAD33质粒为载体的espF基因回补实验平台.方法设计1对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46质粒的EDL933w,在PKD46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体espF基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增espF及其核苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入pBAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株.采用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中espF及其核苷酸片段是否转录.结果构建了espF基因及其核苷酸片段缺失的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且espF基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录.结论本研究运用Red重组t系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株,并建立以pBAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中espF基因的调控机制奠定了基础.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2015(035)011【总页数】6页(P1546-1551)【关键词】大肠埃希菌;espF基因;同源重组;突变株;基因回补【作者】华颖;孙琦;王湘雨;杜艳丽;邵娜;张其威;赵卫;万成松【作者单位】南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515;南方医科大学公共卫生与热带医学学院BSL-3实验室,广东广州510515【正文语种】中文肠出血型大肠埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7是一种食源性人畜共患肠道病原微生物，可导致食物中毒，引起人和动物严重的腹泻、出血性肠炎（haemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒综合症（Haemolyticuraemic syndrome，HUS）等［1-3］。
利用_Red重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因_姜娜
研究报告doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．007利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因姜娜，王芃，王艳春，袁盛凌，展德文，陶好霞，王令春，刘纯杰军事医学科学院生物工程研究所，病原微生物与生物安全国家重点实验室，北京100071［摘要］目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。
方法：以伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi Ty2，S．ty2）基因组为模板扩增得到的同源臂，与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体；以重组载体为模板扩增打靶片段，将其转化S．ty2；在抗生素压力和λRed重组系统帮助下，打靶片段和菌体基因组发生同源重组，通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌；转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记，得到保留单一FRT位点的突变菌株；通过PCR鉴定重组菌，并经透射电子显微镜分析表型。
结果：在S．ty2中敲除了rfaH基因，经PCR扩增和序列测定正确；初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。
结论：获得了S．ty2突变株，为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。
［关键词］伤寒沙门氏菌；λRed重组系统；rfaH基因；基因敲除［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0173－04Knock－Out of rfaH Gene in Salmonella typhi Ty2byλRed Recombination System JIANG Na,WANG Peng,WANG Yan－Chun,YUAN Sheng－Ling,ZHAN De－Wen,TAO Hao－Xia,WANG Ling－Chun,LIU Chun－JieState Key Laboratory of Pathogen and Biosafety,Beijing Institute of Biotechnology,Beijing100071,China［Abstract］Objective:To construct rfaH gene deletion mutant of Salmonella typhi Ty2(S．ty2)withλRed recombination system．Methods:Homologous regions and kanamycin cassette with two FRT sites were amplified from the corresponding templates and were inserted into plasmid pET22b－kana to construct a recombinant vector．The resultant fragments were then amplified from the recombinant vector and transformed into S．ty2．Under the pressure of antibiotic and with the work ofλRed system,homologous recombination occurred between the fragments and genome of host strain,and the recombi-nants were selected on kanamycin agar plate．Plasmid pCP20was introduced into the recombinant to remove the kanamycin resistant relevant DNA fragment,resulting in a single FRT site within the targeted genomic segment．The markerless mutant strains were detected by genome PCR．Phenotype analysis was performed by transmission electron mi-crographs．Results:rfaH gene deletion mutant was obtained and identified by PCR method and sequencing．Phenotype analysis indicated that the flagella synthesis of mutant decreased dramatically．Conclusions:The rfaH deletion mutant of Salmonella typhi Ty2was obtained,and it will be modified further to be the live attenuated bacterial vector．［Key words］Salmonella typhi Ty2;λRed recombination system;rfaH gene;gene knock－out在现代疫苗学研究中，沙门氏菌（Salmonella）常被用作疫苗载体。
Red同源重组技术研究进展
Red同源重组技术研究进展Red 同源重组技术研究进展韩聪1,2张惟材1*游松2(1军事医学科学院⽣物⼯程研究所北京 100071 2沈阳药科⼤学沈阳 110016)摘要伴随着分⼦⽣物学的发展,⼀种基于噬菌体Red 重组酶的同源重组系统已应⽤于⼤肠杆菌基因⼯程研究。
Red 重组系统由三种蛋⽩组成:E xo 蛋⽩是⼀种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端,从5 端向3 端降解DNA,产⽣3 突出端;Beta 蛋⽩结合在单链DNA 上,介导互补单链DNA 退⽕;Gam 蛋⽩可与RecBC D 酶结合,抑制其降解外源DNA 的活性。
Red 同源重组技术具有同源序列短(40~60bp)、重组效率⾼的特点。
这种技术可在DNA 靶标分⼦的任意位点进⾏基因敲除、敲⼊、点突变等操作,⽆需使⽤限制性内切酶和连接酶。
此外,这种新型重组技术可直接将⽬的基因克隆于载体上,⽬的基因既可来源于细菌⼈⼯染⾊体也可是基因组DNA 。
Red 同源重组技术使难度较⼤的基因⼯程实验顺利进⾏,⼤⼤推动功能基因组研究的发展。
关键词 Red 同源重组基因打靶基因⼯程收稿⽇期:2003 08 05 修回⽇期:2003 11 03*通讯作者,电⼦信箱zhangweicai@/doc/c711836424.html同源重组是基因⼯程实验中常⽤的技术⼿段,在基因打靶和基因克隆⽅⾯具有重要作⽤。
常规的基因打靶技术是以Rec A 同源重组为基础,通常需要数百碱基甚⾄更长的同源序列,并且重组效率较低,更由于真核基因组中⼤量重复序列的存在,⽽导致意外重排现象的发⽣。
B AC 、PAC 、YAC 等克隆载体的构建为基因克隆提供了有⼒⼯具,但常规的克隆操作依赖于限制性酶切位点的存在,还需繁琐的连接、纯化步骤,⼤⼤限制了对⼤⽚段基因功能的研究。
近⼏年来,⼀种基于噬菌体Red 重组酶作⽤的同源重组技术逐渐成为基因⼯程研究的热点之⼀,并取得了⼀系列重要进展。
Red 同源重组技术的原理是将⼀段携带与靶基因两翼各有40~60bp 同源序列的PCR ⽚段导⼊宿主菌细胞,利⽤噬菌体Red 重组酶的作⽤,使导⼊细胞的线性DNA ⽚段与染⾊体(或载体)的特定靶序列进⾏同源重组,靶基因被标记基因置换下来(如图1所⽰)。
利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达
利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达李山虎;施庆国;黄翠芬;周建光【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2008(24)4【摘要】为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达,寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点,使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术,将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因.检测该位点的表达效率结果显示:大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因,初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体,不会影响细菌的生长繁殖.【总页数】5页(P576-580)【作者】李山虎;施庆国;黄翠芬;周建光【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系 [J], 尹国华;刘楠;孙兆楠;宋云枝;朱常香;温孚江2.重组大肠杆菌的发酵与外源基因的表达 [J], 顾维新3.操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念 [J], 洪梅;陈伟京;李丹4.pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用 [J], 陈伟;于梅;李山虎;王鸣刚;周建光5.操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念 [J], 陈伟京;洪梅;李丹;卢圣栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RedET同源重组技术概述
RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。
该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。
本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。
RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。
酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。
在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。
RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。
该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。
RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。
然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。
最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。
RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。
首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。
其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。
此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。
然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。
首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。
其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。
此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。
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端向 ３ ’ 端 降解 ＤＮＡ， 产生 ３ ’ 端 突 出 。Ｂ ｅ ｔ ａ蛋 白是
一
种退火蛋 白 单 亚 基 的分 子 量 为 ２ ５ ． ８ ｋ Ｄ。在 溶
液中， Ｂ ｅ ｔ ａ蛋 白可 自发 地 形 成 环 状 结 构 ， 紧 紧地 结 合在 ｓ ｓ ＤＮＡ ３ 突 出端 ， 防止 ＤＮＡ被 单 链 核酸 酶 降
速， 各 种 新 型技 术 的 出现 使 得 其 基 因组 的 改 造 较 以往 更 为 快 速 、 简肠埃 希 茵基 因敲 除 中的应 用 已经越 来 越 成 熟 。本 文 简要 综 述 了利 用 Ｒ ｅ ｄ同 源 重组 技 术 进 行 大 肠 埃希 茵基 因敲 除 的原理 、 策略及 应 用现状 。
Ｒ ｅ ｄ同源重 组 系统 由 入噬菌 体 的 ｅ ｘ ｏ 、 ｂ ｅ ｔ 、 ｇ ａ ｍ ３个 基因组 成 ， 它们分别编码 Ｅ ｘ ｏ 、 Ｂ ｅ ｔ ａ 、 Ｇ ａ ｍ 蛋 白。 Ｒ ｅ ｄ同源重 组技 术 与 常 规 的基 因 打 靶 技 术 相 比 ， 具
端 可容 纳 单 链 ＤＮＡ（ ｓ ｓ ＤＮＡ） 。Ｅ ｘ ｏ蛋 白可 结
１ ． ２ 提 高 重 组 效 率 的措 施
Ｍｕ ｒ ｅ ｒ ｓ 等 于 １ ９ ９ ９年率 先 构建 了表达 噬菌 体 重组 酶 的质 粒 ， 之后 有 很 多 研 究 者在 此 基 础 上 对 质
粒 进 行 改 造 。 目前 应 用 最 广 泛 的 是 Ｄ ａ ｔ ｓ ｅ ｎ ｋ ｏ等 ｎ 。 ＝
Ｒ ｅ ｃ Ｄ组成 的复 合体 ， 功 能 多样 ， 具有 Ａ Ｔ Ｐ 依 赖 的外 切核 酸酶 Ｖ 和解 旋 酶 活性 ， 它 能 与 双链 切 口结 合解
开 Ｄ ＮＡ链 ， 并在 ｃ ｈ ｉ 位点（ ５ ’ 一 Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ ＧＴ Ｇ Ｇ － ３ ’ ） 形 成
单链 ， 然后 由 Ｒ ｅ ｃ Ａ 蛋 白促 进 同 源 重 组 。
这种 蛋 白的活 性形 式 是 一 种 环 状 三 聚 物 分子 ， 中 间 有 一 中空 的通 道 ， 通 道 的一 端 可容 纳 双 链 ＤＮＡ， 另
一
套 比较 成熟 的重组 系统 ， 以重组 效 率 高 和方 法 简 便 著称 。同源 重 组 是 基 因 工 程 实 验 中常 用 的 技 术 手 段， 在基 因 打靶 和 基 因 克 隆方 面 具有 重 要 作 用。
关 键 词 ：大 肠 埃 希 菌 ；基 因 敲 除 ；Ｒ ｅ ｄ同 源 重 组 技 术
研究 基 因 功 能 最 直 接 的方 法 便 是 将 待 研 究 的 基 因失 活 。近年 来 ， Ｒｅ ｄ同源 重 组 已经 发 展 成 为 一
Ｅ Ｔ同源 重组 系 统 。
噬 菌体 基 因 Ｒｅ ｄ区段 编码 了一 个 能够 启 动 细 菌染 色体 与外 源 Ｄ ＮＡ 发 生 同 源 重 组 的 系 统 。Ｅ ｘ ｏ 蛋 白是一 种核 酸外 切酶 ， 单 亚基 的分 子量 为 ２ ４ ｋ Ｄ，
合在 双链 Ｄ ＮＡ（ ｄ ｓ Ｄ ＮＡ） 的末端 ， 从 Ｄ ＮＡ 双链 的 ５ ’
有无 需使 用 限制 性 内切 酶 和连 接 酶 ， 且 同源 序 列 短 （ ４ ０ ￣６ ０ ｂ ｐ ） 和重 组效 率高 的特 点ｎ 。实 验证 明 ， 这
种基 因打靶 技 术 是 基 因功 能研 究 和 新 菌 株 构 建 的 有力 工具 。
《 上 海 畜 牧 兽 医通 讯 》 ２ ０ １ ５年 第 １ 期
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Ｒｅ ｄ同源 重 组 技术 在 大肠 埃 希菌 基 因敲 除 中 的应 用
吴 程 华 严 玉 霖 高 洪 谭 锐 董 驳
（云 南农业 大 学动 物科 学技 术学 院 云南 昆 明 ６ ５ ０ ２ ０ １） 【 摘 要】近 年 来 ， 大肠埃 希 菌一 直是 分子 生物 学和基 因组 学 的重 要研 究对 象。２ ０世 纪 ８ ０年代 以来 ， 生物 学 家发 展 了一 种 新 型 分 子 生物 学技 术 一基 因敲 除 。大 肠 埃 希 菌 基 因敲 除 技 术 发 展 迅
解 ， 同时 介导 互补 ｓ ｓ ＤＮＡ 的退火 ， ｄ ｓ ＤＮＡ 退火 完 成后 ， Ｂ ｅ ｔ ａ蛋 白从 ＤＮＡ 双链 上 解 离 下来 。Ｂ ｅ ｔ ａ蛋 白在 同源重组 过程 中起 着 决 定 性 的作 用 ， 它 与 沙 门 氏菌 Ｐ ２ ２噬 菌体 的 Ｅ ｒ ｒ 蛋 白、 Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ 隐 蔽 型 原 噬 菌 体 Ｒ ａ ｃ噬菌体 的 Ｒｅ ｃ Ｔ蛋 白 、 真核 生 物 的 Ｒ ａ ｄ ５ ２蛋
１ ． １ Ｒｅ ｄ 同 源 重 组 系 统 的 组 成
Ｚ ｈ ａ ｎ ｇ等∞ 于１ ９ ９ ８年发 现 ， 大肠 埃 希菌 本 身存
在 的 Ｒｅ ｃ Ｅ ／ Ｒ ｅ ｃ Ｔ 系 统 具 有 高 效 重 组 功 能 。Ｚ ｈ ａ ｎ ｇ 等 在 ２ ０ ０ ０年 又发 现 入噬菌体 的 Ｅ ｘ ｏ和 Ｂ ｅ ｔ ａ蛋 白
１ Ｒｅ ｄ同 源 重 组 的 原 理
传统 的 大肠 埃 希菌 同源 重 组是 利 用 Ｒ ｅ ｃ Ａ 重组
系统 。它 由 Ｒ ｅ ｃ Ａ和 Ｒ ｅ ｃ Ｂ Ｃ Ｄ组 成 。Ｒ ｅ ｃ Ａ 蛋 白促 进 各类 Ｄ ＮＡ分子 间的 同源联 会 、 配对 以及 链 交换 和分 支 迁 移 。Ｒ ｅ ｃ Ｂ Ｃ Ｄ分 子 量 较 大 ， 是 由 Ｒ ｅ ｃ Ｂ 、 Ｒ ｅ ｃ Ｃ 和
白同属一 类重 组 蛋 白家族 ， 都 具有 介 导 互补 ｓ ｓ Ｄ ＮＡ
退火 的功 能 。Ｇａ ｍ 蛋 白作 为 Ｅ ｘ ｏ 、 Ｂ ｅ ｔ ａ的辅 助 蛋 白， 可与 Ｒ ｅ ｃ Ｂ Ｃ Ｄ核 酸外 切酶 结合 ， 抑制 Ｒｅ ｃ Ｂ Ｃ Ｄ核
酸外 切 酶活性 ， 抑 制体 内的外 源 Ｄ ＮＡ 的降解 。