[整理]S2实验二培养基及其配制理论.
实验二.培养基的配制及灭菌
实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。
4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。
二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。
培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。
为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。
基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。
在配制母液时应注意防止沉淀产生。
绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。
各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。
通常使用的浓度单位是mg/L。
配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。
灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。
培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。
培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。
灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。
（一）、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。
培养基的配制与灭菌实验报告
培养基的配制与灭菌实验报告篇一：培养基的制备与灭菌实验报告陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目培养基的制备与灭菌姓名刘伟学号专业生物科学批次/层次指导教师学习中心培养基的制备与灭菌一、目的要求1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
2. 掌握培养基的配置原则和方法。
3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。
高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。
待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。
此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。
三、实验材料1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
3. 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装1．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。
移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2．灭菌前玻璃器皿的包装（1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。
包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
（2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。
培养基的配制过程及注意事项
培养基的配制过程及注意事项
培养基是一种用于培养微生物和其他生物体的溶液，通常包含营养物质、溶剂和添加剂等成分。
配制培养基的过程需要遵循一定的步骤和技巧，以确保培养基的质量和稳定性。
以下是培养基的配制过程简述:
1. 收集和准备成分：培养基的主要成分包括营养物质、溶剂和添加剂等。
营养物质通常包括葡萄糖、氨基酸、维生素、矿物质等，溶剂通常是水，而添加剂可以是抗生素、激素、缓冲剂等。
这些成分的质量和配比对培养基的质量至关重要。
2. 计量和称量：准备好所需成分后，需要按照一定比例进行计量和称量。
计量和称量的准确性对于培养基的质量和稳定性非常重要，因此需要使用精确的计量和称量工具。
3. 溶解和混合：将称量好的营养物质、溶剂和添加剂等成分倒入容器中，然后进行充分溶解和混合。
在溶解和混合过程中，需要注意不要混入气泡和沉淀物，以免影响培养基的质量和稳定性。
4. 调整 pH 值：培养基的 pH 值对微生物的生长和代谢有重要影响，因此需要对培养基进行适当调整。
通常可以使用氢氧化钠或氢氧化钾等化学试剂进行调整，但要注意控制 pH 值的范围，避免过高或过低的 pH 值对微生物的影响。
5. 冷却和储存：将配制好的培养基冷却至适当的温度，通常是室温或稍低，然后密封储存在冰箱里。
储存的温度和时间是培养基制备过程中非常重要的因素，过长的储存时间和温度过高都会影响培养基的质量和稳定性。
培养基的配制过程需要认真、细心的工作态度，以确保培养基的质量和稳定性。
同时，不同种类的培养基还需要根据不同的微生物和实验需要进行专门的配
制和调整。
常见培养基的配制操作方法和注意事项
常见培养基的配制操作方法和注意事项一、培养基的配制方法：1.准备所需材料：培养基主要由基础成分和添加剂组成，根据不同需求，可以选择不同的成分配制培养基。
常见的基础成分包括碳源、氮源、矿物质盐和特定生长因子等，添加剂包括琼脂、酵母浸泡液等。
2.称量和溶解：根据配方比例，准确称量各个成分并分别溶解在适量的蒸馏水中，可以加温以加快溶解速度。
3.调整pH值：通常需要调整培养基的pH值，使用盐酸或氢氧化钠等酸碱调节剂，逐滴加入直至达到指定的pH值，一般为7.0-7.44.加入琼脂：在溶解各个成分的培养基溶液冷却至约50℃时，加入适量的琼脂，并充分搅拌溶解。
最后通过高温高压灭菌，使培养基凝固。
二、培养基配制的注意事项：1.材料和器皿的消毒：操作前需预先进行灭菌处理，如使用高温高压灭菌器、自闭式消毒法或紫外线照射等方法，以确保培养基的无菌性。
2.避免污染：在操作过程中应尽量避免培养基的污染，如使用干净的器皿和工具，并注意操作环境卫生。
3.精确称量：根据配方比例准确称量各个成分，尤其是微量元素等特定剂量的添加剂。
4.pH值调节：在调整培养基的pH值时，应逐滴添加酸碱调节剂，并反复检测和调整，以确保达到设定的pH值。
5.良好的溶解和混合：搅拌培养基溶液时应充分混合，以确保各个成分均匀分布。
6.温度控制：培养基配制过程中需要注意温度控制，避免溶液过热或过冷，影响琼脂的溶解或培养基的凝固。
7.灭菌处理：配制好的培养基需要通过高温高压灭菌或过滤灭菌进行处理，以保证培养基的无菌性。
8.存储条件：灭菌后的培养基应放置在低温、干燥和避光的环境中保存，并注意严格控制培养基的有效期。
总结：培养基的配制方法包括准备材料、称量和溶解、调整pH值、加入琼脂和灭菌处理等步骤。
在操作过程中需要注意材料和器皿的消毒、避免污染、精确称量、pH值调节、良好的溶解和混合、温度控制、灭菌处理和存储条件等方面的注意事项。
通过严格控制操作环境和工艺要求，可以确保培养基的质量和无菌性。
微生物学实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及共56页文档
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
微生物学实验二 培养基配制、相关器
皿的包扎及
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
实验2-培养基的制备
实验二微生物培养基的制备一、目的要求1、巩固培养基的配制原理及培养基的理论知识2、掌握培养基制作的基本方法3、熟悉2种常用培养基的制作过程二、实验原理培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。
人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。
把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。
自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。
但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。
此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。
按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。
根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。
培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的选择配制。
固化体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。
琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。
因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。
三、实验器材1、药品琼脂，1N NaOH溶液，1N HCl溶液，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基的配方药品；2、材料具刻度1000毫升塘瓷盅，铝锅，天平，20×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签。
培养基配制201603-2
实验一：培养基母液配置（8、9）1.清洗器皿（初次使用注意事项）并晾干。
2.配置N6培养基等母液（每种母液体积100ml）3.培养皿（每组10个）清洗、晾干、报纸包裹、线绳捆扎、灭菌烘干4.蒸馏水灭菌天平的用法：水平调节；称重时需要关好天平所有玻璃窗。
药品内部的塑料盖，记得盖上，如果不明，擦拭干净再盖上。
定容：先称2/3体积水，然后顺序加试剂，前一试剂溶解后，加另一试剂，最后用滴定瓶定容。
值日：清洁桌面、地面；所有物品使用后归位（天平盖上罩子）；座椅归位；不迟到早退，需要的克数=（0.166g/147g）*165g摩尔浓度=0.166/147=x/1651）N6培养基母液（实际使用为20x）：本次实验做100ml 10xKNO3 2.830gCaCl2·2H2O 0.166gMgSO4·7H2O 0.135gKH2PO40.400g(NH4)2SO40.463g注：配制时按表中所列顺序逐一添加，每种成分溶解后再溶解另外一种成分。
2）B5微量母液：本次实验做：1000ml (100倍)含KI 0.0750gH3BO30.3000gMnSO4·H2O 1.0000gZnSO4·7H2O 0. 2000gNa2MoO4·2H2O 0.0250gCuSO4·5H2O 0.0025gCoCl2·6H2O 0.0025g注：本次实验各试剂用量过少，精确度不够，可全班3个组先做1000X，再平均分成3份给每个组。
天平用万分之一天平。
3）B5有机母液：烟酸（Nicotinic acid）1mg/ml盐酸吡哆醇(VB6)1mg/ml盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇(myo-Inositol) 10 mg/ml4)铁盐：本次实验做：100ml (100倍)FeSO4·7H2O 0.278gNa2EDTA·2H2O 0.373g注：配制顺序如下1.称取0.278g FeSO4·7H2O溶解于20ml去离子水中（A）。
培养基 配制方法
培养基配制方法
培养基的配制方法是根据不同微生物的生长要求来确定的。
下面是一般的培养基配制方法：
1. 准备所需成分：根据所需的培养基成分，准备好相应的化学品和试剂，如氨基酸、糖类、盐类、维生素等。
2. 称量和溶解：按照配方中各成分的比例和浓度，称取相应的化学品，并加入适量的蒸馏水或去离子水中溶解。
3. 调节pH 值：使用pH 仪或pH 纸检测溶液的pH 值，并根据需要，用盐酸或氢氧化钠等酸碱溶液调节pH 值，使其符合要求。
4. 加热和消毒：将配制好的培养基溶液倒入试管、烧杯等容器中，并加热至沸腾，持续煮沸几分钟以杀灭其中的微生物。
5. 经冷却和灭菌：将煮沸后的培养基放置自然冷却至室温，并使用高压灭菌器或培养器进行灭菌处理，以确保培养基的无菌性。
6. 添加营养补充物：在无菌培养基冷却后，根据需要可以添加营养补充物，如血清、酵母提取物等，以满足特定微生物的生长需求。
7. 盛装分装：将配制好的培养基倒入无菌试管、琼脂瓶或平板上，根据需要冷却凝固成固体或保持为液体状态。
8. 贮存和标签：将分装好的培养基密封保存在低温冰箱或冷库中，并在容器上贴上标签，注明培养基的名称、配方、pH 值和贮存日期等信息。
以上是一般培养基的配制方法，不同类型的培养基可能还有其他特殊的步骤和要求。
在配制过程中要注意无菌操作，以确保培养基的纯净度。
实验二 培养基的制备
⑩ 培养基的保存
4、培养基制备的基本方法
① 培养基配方的选定 ② 培养基的制备记录 ③ 培养基成分的称取 ④ 培养基各成份的混合和溶化 ⑤ 培养基pH的调正 ⑥ 培养基的过滤
⑦ 培养基的分装
⑧ 培养基的灭菌 ⑨ 培养基的质量测试 应存放于冷暗处，最好放于 普通冰箱内； 平板培养基不宜超过3天； 必须附有明显标签。
分装量一般超过容器装盛量 的2/3。
⑩ 培养基的保存
4、培养基制备的基本方法
① 培养基配方的选定 ② 培养基的制备记录 ③ 培养基成分的称取 ④ 培养基各成份的混合和溶化 ⑤ 培养基pH的调正 ⑥ 培养基的过滤 一般采用高压蒸汽灭菌方法 （121℃，15min）。 某些畏热成分，如糖类、血 清等，一般以过滤方法除菌， 以后再用无菌操作技术、定量 加于培养基。
⑦ 培养基的分装
⑧ 培养基的灭菌 ⑨ 培养基的质量测试
⑩ 培养基的保存
4、培养基制备的基本方法
① 培养基配方的选定 ② 培养基的制备记录 ③ 培养基成分的称取 灭菌以后，应仔细检查，如 ④ 培养基各成份的混合和溶化 发现破裂、水分浸入、色泽异 常等、均应挑出弃去。 ⑤ 培养基pH的调正 将全部培养基放入37 ℃ 恒 ⑥ 培养基的过滤 温箱培养过夜，如发现有细菌 ⑦ 培养基的分装 生长，即弃去。 ⑧ 培养基的灭菌 ⑨ 培养基的质量测试 用已知菌株接种部分培养基, 培养24~48h。如无菌生长或生 长不良，应追查原因并重复接 种一次，如结果仍同前，则该 批培养基即应弃去。
⑦ 培养基的分装
⑧ 培养基的灭菌 ⑨ 培养基的质量测试
⑩ 培养基的保存
4、培养基制备的基本方法
① 培养基配方的选定 ② 培养基的制备记录 ③ 培养基成分的称取 必须精确称取，并注意防止 错乱。
实验二 微生物培养基的配制和灭菌
培养基成分 牛肉膏 0.3g;蛋白胨 1g;氯化钠 0.5g;琼脂 2g;蒸馏水
100mL;pH 7.0～7.2;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min
用量：
100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组（涂布/划线）
制作斜面（只需1个组制备）：无需抗生素
化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒 精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液， 它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
培养基和玻璃器材的 灭菌方法
培养基配制的原则
配制培养基的配方，及方法 培养基蒸汽灭菌原理，方法
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源， 某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用 氨基酸作为能源物质。 无机氮源：碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素 有机氮：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。
生产上常用的氮源有硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含 量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。
培养基的配制原则
一、营养成分 二、PH值 三、渗透压 四、氧化还原电位
培养基的配制原则
一、营养成分 总体原则
1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基， 如自养型微生物：由简单的无机物质组成
异养做生物：至少需要含有一种有机物质。
按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母
菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分别
实验程序2:分离培养微生物常用器皿的准备
清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作
包装培养皿和吸管等。
湿热灭菌法原理
实验二 培养基的配制和灭菌
实验二培养基的配制和灭菌一'实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二'内容'材料和方法（-）培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白月东培养基。
1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）这是植病实验室最常用的培养基（简称PSA）,主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克蔗糖10~20克琼脂17~20克加水至1000毫升方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH,培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2肉汁胨培养基（BPA）这种培养基主要用于细菌的分离和培养成分：牛肉浸膏3克蛋白胨5~10克蔗糖10克酵母浸膏1克琼脂17~20克加水至1000毫升方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7,趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
实验二培养基的制备
出 ➢ 现沉淀，使培养基不透明。水的作用是溶解营养物质。 ➢ ②蛋白胨 是蛋白质经蛋白酶、酸或碱水解后的中间产物， ➢ 含有胨、肽和氨基酸等成分，主要提供氮素营养。因
其为 ➢ 两性化合物，故有酸碱缓冲作用，可维持pH的稳定。 ➢ ③肉浸汁或牛肉膏 肉浸汁为牛肉的水浸出液，牛肉膏是
➢ [方法和步骤] ➢ 1、普通肉汤培养基
配方： 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml
pH 7.4
➢ 配制方法： ➢ ①按配方剂量称取各种试剂，置于搪瓷缸中。 ➢ ②上述成分混合、加热溶解，补足蒸发的水分。 ➢ ③以1mol／L氢氧化钠溶液调pH至7.4～7.6。 ➢ 〔 初配好的培养液是偏酸性的，需用NaOH
实验二 培养基的制备
➢ [实验内容]
➢
普通肉汤及普通琼脂培养基的制备。
➢ [目的要求]
➢ 1、掌握一般培养基制备的原那么和要 求。
➢ 2、熟悉一般培养基制备的过程。
➢ 3、掌握培养基酸碱度的测定。
➢ [培养基的概念和用途]
➢ 概念：
➢
培养基是按照各类微生物的生长需要，
➢
以人工方法配制成的一种混合营养基
一
➢ 种半乳糖硫酸脂，98℃时溶于水，45℃ ➢ 以下重新凝成凝胶状，它在培养基中只
起
➢ 凝固剂的作用，以便观察菌落特征。培 养
➢ 基中琼脂含量在1.5% 以上时呈固体状态， ➢ 在0.5% 左右时呈半固体状态。 ➢ ②指示剂 用来观察pH的变化或其他反响现
➢ [实验材料] 1、器皿及仪器： 量筒(100ml)、搪瓷缸 (500ml)、漏斗、 漏斗架、三角瓶(100ml)、试管、玻璃棒 、 吸管(1ml和10ml各1个)、pH酸度计、滤 纸、电子天平、电磁炉、硅胶塞、包装纸、 扎绳、洗耳球等。 2、试剂： 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂条或粉、 1 mol／L的NaOH和1 mol／L的HCl溶液、 蒸馏水等。
实验二常用基础培养基的制备
实验二常用基础培养基的制备同学们大家好欢迎来到微生物检验课堂今天我们做的实验是常用基础培养基的制备。
这节课我们一起来学习三种不同的培养基制备的操作;好那我们开始，这节课的实验原理是：培养基是人工合成的一种混合营养料，用以分离细菌。
基础培养基中含有大多数常见菌生长繁殖所需要的营养物质，并可制成液体、半固体、固体三种不同的性状。
实验项目是细菌培养基的制备，最常见的培养基包括：肉汤培养基的制备普通琼脂平板培养基的制备半固体斜面培养基的制备等三种方法实验目的是：掌握培养基制备方法实验材料有：牛肉膏、蛋白胨，氯化钠、蒸馏水琼脂粉，10%NaOH pH试纸、三角烧瓶量筒，天平酒精灯、等培养基的制备步骤：配料→熔化→测定pH→滤过+分装→灭菌→备用。
肉汤培养基:取1000ml蒸馏水,加人牛肉膏3-5g,蛋白胨10g,氯化钠5g,混合加热溶解，调整pH至7.4-7.6,分装于烧瓶中，可供一般细菌生长。
(2) 普通琼脂培养基:取1000ml肉汤培养基，加入2% ~3%琼脂，加热溶化，过滤,分装于烧瓶或试管中。
(3)半固体培养基:取1000ml肉汤培养基，加人3-5g琼脂，分装于烧瓶或试管中，主要用于保存菌种或观察细菌动力三种培养基分装好后均在全自动高压灭菌器中高压。
高压灭菌的主要方法：首先把制备好的培养基放入灭菌器里，把盖子盖好，温度调制121.3摄氏度，时间调制30分钟，开始高压灭菌，好，灭菌时间到了，取出培养基，待冷却后即可以使用。
利用PPT照片展示结果：一下就是三种培养基制备好后的形态。
注意：通过今天的实验我们已经学到了固体培养基，液体培养基，半固体培养基等三种不同培养基的制备，下课后希望大家可以分组讨论本次实验收获。
好同学们，今天的课程就讲到这里，下节课再见。
S2实验二 培养基及其配制(理论)
实验二培养基及其配制（理论）一、培养基成分及作用培养基（culture medium）是植物组织培养的物质基础，也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之一。
培养基成分对离体培养植物的生长发育起调控作用。
选择合适的培养基并掌握正确的制备方法是组织培养成功的前提。
（一）植物必需的营养元素植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：1、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；2、构成一些特殊的胜利活性物质，参与活跃的新陈代谢；3、这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等点化学方面的作用；4、在发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。
Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准：A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充改元素来预防和恢复C、改元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。
国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。
根据植物体内含量多少，可把这些元素分为：大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种。
微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg。
Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种。
（二）培养基营养成分及作用培养基是外植体生长的土壤，它所含有的不同营养元素直接影响着培养材料的生长发育。
培养基中的营养元素以有机物和无机物两类形式存在，绝大多数营养元素以无机物的形式存在。
按照国际植物生理协会的建议：所需浓度> 0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度< 0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置，又称生命元素。
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实验二培养基及其配制（理论）一、培养基成分及作用培养基（culture medium）是植物组织培养的物质基础，也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之一。
培养基成分对离体培养植物的生长发育起调控作用。
选择合适的培养基并掌握正确的制备方法是组织培养成功的前提。
（一）植物必需的营养元素植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：1、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；2、构成一些特殊的胜利活性物质，参与活跃的新陈代谢；3、这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等点化学方面的作用；4、在发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。
Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准：A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充改元素来预防和恢复C、改元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。
国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。
根据植物体内含量多少，可把这些元素分为：大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种。
微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg。
Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种。
（二）培养基营养成分及作用培养基是外植体生长的土壤，它所含有的不同营养元素直接影响着培养材料的生长发育。
培养基中的营养元素以有机物和无机物两类形式存在，绝大多数营养元素以无机物的形式存在。
按照国际植物生理协会的建议：所需浓度> 0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度< 0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置，又称生命元素。
在培养基中主要以NO3—-N和NH4—-N两种形式存在。
P是磷脂主要成分。
培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。
K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。
培养基中常以KCl、KNO3等盐类提供。
Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。
它们常以MgSO4·7H2O提供，用量为1—3mg/L 较为适宜；Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。
常以CaCl·2H2O提供。
2、微量元素在微量元素中，铁的使用最大，铁是一些氧化酶的组成成分。
同时又是叶绿素形成的必要条件。
由于培养基的pH较高，所以培养中几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁这种鳌合物来防止铁的沉淀。
硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；锰参与植物的光合、呼吸代谢；钼参与氮素的代谢；氯是光合作用水光解的活化剂。
微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。
缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。
随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。
严重缺铁时，新梢顶端枯死。
缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。
枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。
缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。
缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。
十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦缺硼典型症状：受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。
3、碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。
一般来说，蔗糖是最好的糖源，它具有热易变的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，仅剩下部分的蔗糖，这更利于吸收和利用。
蔗糖使用浓度一般在2%—5%。
此外，糖还可以提供能源和调节渗透压，调节培养基的渗透压一般在1.5—4.1 MPa。
4、维生素类这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长，分化等有很好的促进作用。
主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素。
5、肌醇又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用，是细胞壁的构建材料。
肌醇参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动，具有促进活性物质发挥作用的效果，在培养基中加入1.0mg/L的肌醇就足以影响V B1的效应。
使用浓度一般在50—100mg/L。
6、氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。
培养基中常用的是甘氨酸，还有其他氨基酸，用量一般在10—1000mg/L之间。
7、天然复合物为了促进某些愈伤组织和器官的生长，在培养基中还常加入多种化学成分不明的、复杂的天然营养混合物，如水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物等。
8、琼脂为使培养材料在培养基上固定和生长，要外加一些支持物，构成固体培养基。
琼脂是使用最普遍的凝固剂。
用量一般在6—10g/L之间，以颜色浅、透明度高好，洁净为上品。
除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。
9、活性炭培养基中加入活性炭主要是为了吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质。
加入适量的活性炭对抑制外植体褐变、防止玻璃苗的产生、促进培养物生长和分化、促进生根具有一定作用。
但活性炭也有副作用，它的吸附作用没有选择性，所以在吸附抑制物的同时，使一些营养成分也吸附了。
10、抗生素主要目的是防止外植体内生菌造成的污染。
11、生长素类主要生理作用是促进细胞伸长和分裂，还有促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实等作用。
在职物组织培养中，主要被用于诱导愈伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长。
生长素一般溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，以后者的溶解效果更好。
常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。
12、细胞分裂素类细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎芽的分化等。
主要作用是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。
还用于离体成花的调控。
细胞分裂素一般溶于0.5—1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中。
常用的细胞分裂素有KT (激动素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素等。
13、赤霉素类和脱落酸在组织培养中不常使用。
赤霉素主要作用是加速细胞的伸长生长，也促进细胞的分裂。
主要是GA3。
脱落酸具有抑制细胞分裂和伸长、促进脱落和衰老、促进休眠和提高抗逆能力等作用。
二、培养基的分类与配制（一）培养基的种类根据培养基的形态不同可以分为固体培养基与液体培养基；根据培养过程不同可以分为初代培养基与继代培养基；根据其作用不同可以分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；根据其营养水平不同则分为基本培养基和完全培养基。
（二）几种常见培养基的特点1、MS培养基特点是无机盐浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，营养丰富，不需要添加更多的有机附加物。
2、White培养基是1943年White设计的，1963年做了改良，特点是无机盐浓度较低。
使用广泛，在生根培养、胚胎培养中有良好的效果。
3、B5培养基是1968年由Gamborg等设计的，特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。
4、N6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计的，特点是KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼。
（三）培养基的配制配制培养基应做好几点工作：1、实验用具的准备。
包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备；2、试剂、药品的准备。
3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量。
具体操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水或去离子水至培养基最终体积的3/4，在恒温水浴中加热使之溶解，并不断搅拌，防止琼脂凝块儿。
配制液体培养基时因不含凝固剂，无须高温加热。
2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀。
吸取各种母液的移液器应专用，以免产生交叉感染。
对高温高压条件下不稳定或容易分解的植物生长调节物质必须在培养基进行高温高压灭菌后，用过滤的方法加入。
3、加水定容至规定体积，搅拌均匀。
在标准温度下将培养基定容后进行称量，并以此质量为标准进行较高温度的培养基的定容。
4、调整培养基的pH值。
一般采用1mol/LNaOH与1mol/LHCl来调整其pH值。
5、分装。
已经配制好的培养基应尽快的分装，以防止含琼脂的培养基在较低温度下凝固。
分装时应注意到培养基占该容器的1/3—1/4为宜。
6、封口。
培养基分装后，应立刻用封口膜将容器口部封严。
封口膜应具有透光、透气性，但不通透尘埃、微生物等杂质。
（四）培养基的灭菌组织培养必须在无菌环境中进行，因此作为外植体生长的介质的培养基的灭菌操作非常重要。
培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。
一般采用的是高压蒸汽灭菌。
高压蒸汽灭菌的原理：通过加热，在密闭的高压锅内随着水蒸汽压力的不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.105MPa压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度乃热的芽孢。
一般情况下，灭菌在温度121℃，压力0.105MPa下，保持20—30min即可。
灭菌锅有很多种，实验室中手提式高压蒸汽灭菌锅是最常用的，但是在使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。
（五）培养基的保存灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，若要检验灭菌效果，可将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。
培养基最好保存在低温条件下，但在常温下保存时要进行防尘和避光处理，保存时间不可过长。