实验一、蛋白质含量测定2012
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告1. 引言蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。
蛋白质的含量测定是生物化学领域中常用的实验方法之一，它可以帮助我们了解生物体内蛋白质的含量及其变化情况，对于研究细胞活动、疾病发生机理等方面具有重要意义。
2. 实验目的本实验旨在通过测定样本中蛋白质的含量来探究不同方法的可行性和准确性，并了解实验操作的步骤和原理。
3. 实验材料和方法3.1 实验材料：- BSA标准溶液- Coomassie亮蓝G250试剂- 可见光分光光度计- 1 cm光学吸光皿- 雪茄盒- 离心管- 超声波清洗机3.2 实验方法：3.2.1 BSA标准曲线的制备首先，我们需要制备BSA（Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白）的标准曲线。
将一定浓度的BSA溶液分别取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL放入不同的离心管中，然后加入相同体积的去离子水，使最终体积达到 1 mL。
将各个离心管标记好，并在试剂最后加入亮蓝G250试剂20 μL。
用超声波清洗机将离心管内混合物彻底混匀，然后静置室温15分钟。
随后，在波长570 nm下使用可见光分光光度计对各组溶液的吸光度进行测定，记录下各个浓度对应的吸光度值。
3.2.2 待测样品的处理将待测样品（如细胞培养物、血浆等）放入雪茄盒中，加入足够的去离子水，然后使用超声波清洗机混匀样品，直至完全溶解。
3.2.3 样品的测定取不同体积的标样和待测样品溶液，加入相应的去离子水，使最终体积达到1 mL，并分别加入亮蓝G250试剂20 μL。
用超声波清洗机将离心管内混合物彻底混匀，然后静置室温15分钟。
随后，在波长570 nm下使用可见光分光光度计对各组溶液的吸光度进行测定，记录下各个浓度对应的吸光度值。
4. 结果和讨论通过对BSA标准曲线的绘制，我们可以得到各个浓度对应的吸光度值。
利用标准曲线，我们可以根据待测样品的吸光度值推算出其蛋白质的含量。
蛋白质的含量测定实验
蛋白质的含量测定实验蛋白质是构成生物体的重要有机分子之一，对于了解生物体的组成和功能具有重要意义。
在科学研究和食品加工等领域，准确测定蛋白质的含量是十分关键的。
本实验将介绍一种常用的蛋白质含量测定方法——低里氏法。
一、材料与试剂准备1. 组织样本：可以选择动植物组织，如肝脏、肌肉等。
2. 水浴锅：用于加热试剂，保持温度恒定。
3. 显色试剂：选择低里氏试剂，常见的有Bradford显色试剂。
4. 蛋白质标准溶液：根据需要选择适当浓度的蛋白质标准溶液，常用的有Bovine Serum Albumin（BSA）标准溶液。
5. 常用实验器材：包括离心管、移液管、离心机、比色皿等。
二、实验步骤1. 样本制备：a. 提取组织样本：取适量的组织样本，如肝脏、肌肉等，使用离心机将其离心，去除杂质和溶液。
b. 重建组织样本：向组织样本中加入一定体积的溶液，使样本浓度适宜，便于后续的测定。
2. 样本处理：a. 取相同体积的样本和蛋白质标准溶液，分别加入离心管中。
b. 添加适量的显色试剂，轻轻摇匀，使样本和标准溶液均匀与显色试剂充分接触。
c. 将离心管放入水浴锅中，调节温度为适宜条件，如常温或37℃。
d. 静置一段时间，使显色反应充分进行。
3. 比色测定：a. 取适量的显色反应液，加入比色皿中。
b. 使用光密度计或分光光度计，以试剂空白对照为基准，测定各个样本的吸光度。
c. 根据吸光度的读数，结合标准曲线，计算出样本中蛋白质的含量。
三、数据分析与结果解读根据实验的结果，我们可以得到样本中蛋白质的含量。
通过对不同样本的测定，可以比较不同组织或不同处理条件下蛋白质含量的差异。
同时，通过与蛋白质标准溶液的比较，可以验证测定方法的准确性和可靠性。
实验结果的解读应根据具体情况进行。
如果是在科学研究中，可以将结果与已有文献进行比较，探讨其在生物体功能或代谢方面的意义。
如果是在食品加工中，可以根据蛋白质含量的测定结果来评估食品的营养价值和质量。
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告
实验目的：测定样品中蛋白质的含量。
实验原理：
蛋白质是生物体中重要的营养成分，其含量的测定对于食品、生物化学研究等都具有重要意义。
本实验采用双氧水法测定蛋白质的含量。
双氧水法原理是将双氧水与被测物中的蛋白质发生氧化反应，生成到氨基酸的过氧化氢，过氧化氢再与钼酸铵生成深蓝色化合物。
根据形成的深蓝色化合物的吸光度与蛋白质的含量成正比关系，可以通过比色法测定样品中蛋白质的含量。
实验步骤：
1. 将待测样品和标准蛋白质溶液分别取1ml到不同的试管中。
2. 加入4ml双氧水试剂，混匀。
3. 在室温下放置20分钟。
4. 加入适量的硫酸试剂，混匀。
5. 在60℃水浴锅中恒温加热10分钟。
6. 冷却至室温。
7. 分别将标准蛋白质溶液和待测样品溶液吸取1ml到比色皿中。
8. 用比色皿中的溶液分别测定吸光度，以比色皿中双氧水试剂为参比。
9. 根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验结果：
根据吸光度测定值和标准曲线得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
实验讨论：
蛋白质的含量测定是一项常见的实验，通过双氧水法可以快速准确地测定样品中蛋白质的含量。
在实验过程中，应注意操作的准确性和实验条件的控制，避免测定误差的产生。
此外，标准曲线的制备和测定结果的分析也是关键步骤，应进行仔细的处理和验证。
实验结论：
经过测定，得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较
①容量瓶②试管及试管架
③恒温水浴槽④吸量管
⑤分光光度计⑥电热套
⑦锥形瓶⑧比色皿
(3)紫外吸收法
试剂:
样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。
器材:
①紫外分光光度计②容量瓶
③试管、试管架④吸量管
⑤锥形瓶⑥比色皿
4．实验方法步骤及注意事项
双缩脲法
标准曲线的绘制:
取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。
实验远没有我想象的那样简单，要想做好一个实验，容不得半点马虎。综合实验正是这培养了我们的耐心、恒心和信心，让我们的思维和创造力得到了大幅度的提高，让我们的科学素养有了很大的飞越。真真正正变学生的被动学习为主动学习，激发了我们的学习热情，不管实验成功或是失败，我们都能从中获得很多从其它地方得不到的知识，让我们获益匪浅！
若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
5.实验数据处理方法
双缩脲法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
O．D540
0
0.021
0.052
0.160
0.316
0.345
0.08
0.029
标准蛋白质浓度(mg/ml）
0
1
2
3
4
5
X
Y
考马斯亮蓝染色法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
蛋白质浓度（ug/ml）
样品测定:
①制备样品的蛋白质提取液。
②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份
计算:
实验一 蛋白质含量测定方法的研究
实验一蛋白质含量测定方法的研究实验一蛋白质含量测定方法的研究实验一蛋白质含量测定方法的研究生物093孙文雅0902040306一、研究背景蛋白质是存在于生物体中的一类重要的生物大分子物质，其结构及功能的多样性决定了它在生命活动的各个领域中都有极其重要的作用。
因此，对于探究生命活动的奥秘，首先要明确的内容之一即是生命活动的主要承担者-----蛋白质的结构与功能与生命活动的内在联系。
蛋白质含量测定技术是蛋白质分离提纯流程中的基本环节。
缺少这一技术的辅助，我们就无法明确得知某种蛋白质的存在，也就无法完成分离提纯的最终目的。
目前，测定蛋白质含量的方法主要有四种：福林酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法和凯氏定氮法，其中前三种最常用。
然而为什么对同一类甚至同一种物质的测定会存在多种不同的方法呢？通常情况下，技术及方法的发展依赖于人们的需求，如果一种方法即可满足人们对于蛋白质含量测定的需要，那么其他的方法也就没有其存在的必要性了；也就是说，如果多种测定方法并存而且同时为人们所用，那么就说明仅仅一种方法并不能满足人们对于蛋白质含量测定的需要，每一种方法必然都有其特殊的适用范围及缺陷。
那么，面对各种各样的方法，我们在实际工作中如何选择呢？选择的基础是什么？首先，生物体内不同蛋白质组分、结构和性质的多样性可能是蛋白质含量测定方法多样性的原因；此外，这些方法针对蛋白质不同于其他物质的特殊性质。
因此，利用蛋白质不同于其他物质的特殊物理和化学性质已成为我们确定蛋白质含量的首要原则，实验中值得我们注意的问题是，在蛋白质含量测定过程中，如何确保将蛋白质以外的物质的干扰降至最低，并获得更准确的结果。
二、实验原理分别采用福林酚法、考马斯亮蓝（G-250）法和紫外分光光度法测定同一蛋白质样品的蛋白质含量，并对实验结果进行比较，以便对几种方法进行分析和比较。
1、folin-酚法：利用folin-酚试剂中的磷钨酸与磷钼酸在碱性条件下被蛋白质中存在酚羟基的氨基酸还原生成蓝色的钼蓝与钨蓝络合物而呈蓝色反应的原理，根据生成的络合物颜色深浅的比对，结合做出的标准曲线，对样品蛋白质的含量进行定量测定。
测蛋白质含量实验报告
测蛋白质含量实验报告测蛋白质含量实验报告蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，具有重要的生理功能。
因此，准确测定蛋白质含量对于生物学研究和食品科学等领域具有重要意义。
本文将介绍一种常用的测定蛋白质含量的方法——布拉德福法，并通过实验结果探讨其应用范围和局限性。
布拉德福法是一种基于蛋白质与染料结合的原理来测定蛋白质含量的方法。
该方法利用染料与蛋白质之间的亲和作用，通过测定染料的吸光度来间接测定蛋白质的含量。
在实验中，我们使用了布拉德福试剂和标准蛋白质溶液，以及待测样品。
首先，我们需要制备一系列不同浓度的标准蛋白质溶液。
通过将已知浓度的标准蛋白质与布拉德福试剂混合，形成一种混合物。
然后，利用分光光度计测定该混合物的吸光度，并绘制标准曲线。
标准曲线的横坐标为标准蛋白质的浓度，纵坐标为吸光度。
通过测定待测样品的吸光度，并利用标准曲线，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
在实验过程中，我们发现布拉德福法具有一定的优点和局限性。
首先，该方法操作简单，结果可靠。
布拉德福试剂与蛋白质结合后会发生颜色变化，通过测定吸光度可以准确测定蛋白质的含量。
其次，该方法适用范围广。
无论是高浓度还是低浓度的蛋白质溶液，布拉德福法都可以进行测定。
此外，该方法对于不同种类的蛋白质也适用。
无论是动物蛋白质还是植物蛋白质，布拉德福法都可以准确测定其含量。
然而，布拉德福法也存在一些局限性。
首先，该方法对于某些特定的蛋白质可能不适用。
某些蛋白质的氨基酸组成可能会影响其与布拉德福试剂的结合情况，从而导致测定结果的不准确。
其次，该方法对于含有干扰物的样品可能会出现误差。
某些样品中可能存在与蛋白质结合的其他物质，这些物质可能会干扰布拉德福试剂与蛋白质的结合，导致测定结果的偏差。
综上所述，布拉德福法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，具有操作简单、适用范围广的优点。
然而，该方法也存在一定的局限性，对于某些特定的蛋白质和含有干扰物的样品可能会出现误差。
蛋白质含量测定方法的研究_2
实验一蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景蛋白质是生物的重要组成部分，在人类发现蛋白质后一直没有停下过研究得脚步。
在实验室提取蛋白质的过程中，目标蛋白质的来源是广泛的，而不同的样品中目标蛋白质的含量是不同的，为了得到更多的目标蛋白，就需要了解样品中蛋白质的含量。
在实际的生活中也需要运用蛋白质含量的测定，例如牛奶、奶粉中蛋白质含量。
记得前几年轰动一时三聚氰胺事件，国家的标准蛋白质检测方法被不法分子所利用，通过蛋白质检测方法的缺陷来谋取暴利。
目前常用的蛋白质检测方法有五种：凯式定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝法、紫外法、双缩脲法。
不同的方法有不同的优缺点。
二、研究目标通过四种不同的蛋白质测定方法了解各种方法的优缺点。
在不同的条件下，能选择正确的测定方法，从而获得正确的数据。
三、研究策略根据资料可以知道四种方法的局限性，针对这一个单一的变量设计五组实验。
一个是标准对照组，其他四组分别在标准组的基础上引入一种变量。
用四种方法分别测定五种溶液。
在对同一种溶液的测定结果中，必有一种方法的结果和其他的结果有显著差异，同时与标准液的结果也有显著的差异。
我们就认为这组溶液中的变量对于该蛋白质测定的方法影响较大。
四、研究方案及可行性分析研究方案：1、配置一组浓度梯度的标准液，分别用四种方法测定，并建立标准曲线。
2、配置五种等浓度的样品蛋白质溶液并编号ABCDE。
在配置过程中，A组加10毫升蒸馏水；B组加10毫升嘌呤溶液；C组加入10毫升EDTA溶液；D组加入10毫升双氧水溶液；E组加入10毫升盐酸溶液。
3、分别用四种方法测定五种蛋白质溶液。
4、分析结果可行性分析：更具已有资料设计了四个单一的变量，分别针对四种实验的缺点，同时保证没有其他的变量。
预期结果：在每组实验的结果中分别有一个数据是在横向和纵向上都有显著差异的。
我们可以确定这个变量对该实验有很大的影响。
五、具体实验设计1.建立标准曲线紫外法a.仪器：紫外分光光度仪、移液管、试管和试管架试剂：标准牛血清蛋白溶液b.280nm下测其光密度值。
实验一蛋白质含量的测定
2NH3+ H2SO4(NH4)2SO4(2)
(NH4)2SO4+ 2NaOH2H2O +Na2SO4+ 2NH3(3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
（250g/ml）
未知蛋白质0.2 0.4 0.6
（约250g/ml）
蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 00.8 0.6 0.4
试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙0.5 0.50.50.50.50.50.50.50.50.5
2.试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3.标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250g/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。
2.器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250g/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过测定食物中蛋白质含量的方法，掌握蛋白质的测定原理和操作技能，加深对蛋白质的认识，为日常饮食提供科学依据。
二、实验原理。
本实验采用了比色法测定蛋白质含量。
比色法是根据蛋白质与双酚类物质在碱性条件下生成紫色化合物的原理，利用紫外可见光谱法测定其吸光度，从而计算出蛋白质的含量。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将食物样品研磨成粉末状。
2. 蛋白质提取，取适量样品加入提取液，振荡离心，收集上清液。
3. 比色反应，将提取液与试剂混合，待反应完成后进行测定。
4. 吸光度测定，用紫外可见光谱仪测定吸光度。
5. 计算蛋白质含量，根据吸光度值计算出样品中蛋白质的含量。
四、实验结果。
经过实验测定，得出食物样品中蛋白质含量为Xg/100g。
五、实验分析。
通过本次实验，我们了解了蛋白质含量测定的原理和方法，掌握了比色法测定蛋白质含量的操作技能。
同时，也发现不同食物样品中蛋白质含量的差异，为我们科学合理地进行日常饮食提供了参考。
六、实验总结。
蛋白质是人体生命活动的重要组成部分，合理摄入足够的蛋白质对维持身体健康至关重要。
通过本次实验，我们不仅学会了测定蛋白质含量的方法，也增加了对蛋白质的认识，为我们的健康饮食提供了科学依据。
七、实验感想。
本次实验让我深刻认识到蛋白质在日常饮食中的重要性，也让我对科学实验有了更深的理解和体会。
希望通过今后的学习和实践，能够更好地运用所学知识，为自己和他人的健康提供帮助。
八、参考文献。
1. 《食品分析实验指导》，XXX，XXX出版社，XXXX年。
2. 《食品化学与分析》，XXX，XXX出版社，XXXX年。
以上就是本次蛋白质含量测定实验的报告内容，希望对大家有所帮助。
蛋白质含量的测定实验报告
蛋白质含量的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过测定食品中蛋白质含量的方法，掌握蛋白质含量的测定原理和操作技能，为食品质量的检验提供科学依据。
二、实验原理。
蛋白质含量的测定方法有多种，本实验采用的是经典的凯氏试剂法。
该方法是利用碱性铜溶液与蛋白质中的蛋白质结合成紫色沉淀，通过比色计算出蛋白质含量。
三、实验仪器和试剂。
1. 仪器，量筒、烧杯、比色皿、分析天平等。
2. 试剂，凯氏试剂、蛋白质标准品、硫酸铜溶液、碱液等。
四、实验步骤。
1. 样品制备，将待测样品称取适量，加入适量的硫酸铜溶液，摇匀后放置一段时间。
2. 沉淀分离，将沉淀转移到预先称量的滤纸上，用水洗涤至无碱性铜试剂残留。
3. 沉淀溶解，将沉淀与少量硫酸铜溶液混合，加入碱液溶解。
4. 比色计算，用比色皿盛放试液，通过比色计算出蛋白质含量。
五、实验结果。
通过实验测得样品的蛋白质含量为XXg/100g。
六、实验分析。
根据实验结果，可以初步判断样品的蛋白质含量符合标准要求。
但需要注意的是，蛋白质含量的测定结果受到多种因素的影响，如样品制备不均匀、操作不规范等，因此在实际应用中还需要结合其他分析方法进行综合判断。
七、实验结论。
本实验通过凯氏试剂法测定了样品的蛋白质含量，结果表明样品的蛋白质含量符合标准要求。
但仍需注意实验操作的规范性，以确保结果的准确性和可靠性。
八、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了蛋白质含量的测定方法和操作技能，提高了对食品质量检验的能力，为今后的实验和工作积累了经验。
以上就是本次蛋白质含量的测定实验报告，希望对大家有所帮助。
测蛋白质含量实验报告
测蛋白质含量实验报告测蛋白质含量实验报告引言：蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于维持生命活动具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于生物学、医学等领域的研究具有重要意义。
本实验旨在通过测定蛋白质含量的方法，探究不同样品中蛋白质的含量差异。
实验方法：1. 准备不同浓度的蛋白质标准溶液，分别为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3mg/mL、0.4 mg/mL和0.5 mg/mL。
2. 取一定量的不同样品，如鸡蛋清、牛奶、豆浆等。
3. 将标准溶液和样品分别加入试管中，每个样品和标准溶液各加入相同体积。
4. 加入适量的Bradford试剂，轻轻摇匀。
5. 在室温下孵育15分钟，使试剂与蛋白质反应。
6. 使用分光光度计，以595 nm波长测量吸光度。
实验结果：通过测量吸光度，得到了不同标准溶液和样品的吸光度值，如下表所示：标准溶液浓度（mg/mL）吸光度0.1 0.220.2 0.340.3 0.470.4 0.610.5 0.75样品吸光度鸡蛋清 0.39牛奶 0.52豆浆 0.45讨论：根据实验结果，可以看出标准溶液的吸光度随浓度的增加而增加，呈现出明显的线性关系。
而样品的吸光度值则介于标准溶液的吸光度之间，说明样品中也含有一定量的蛋白质。
在本实验中，我们使用了Bradford试剂进行蛋白质含量的测定。
Bradford试剂的原理是根据蛋白质与染料之间的结合反应，使染料的吸收峰位发生变化，从而测定蛋白质的含量。
由于Bradford试剂对蛋白质有较高的选择性，且反应时间短，因此被广泛应用于蛋白质含量的测定。
然而，需要注意的是，Bradford试剂对于不同蛋白质的反应性可能存在差异。
一些特殊的蛋白质，如硫醇蛋白质、胶原蛋白等，可能会导致测定结果的误差。
因此，在具体实验中，需要根据不同样品的特点选择合适的蛋白质测定方法。
此外，实验结果还表明不同样品中蛋白质的含量存在差异。
鸡蛋清中的蛋白质含量较低，而牛奶和豆浆中的蛋白质含量较高。
实验一蛋白质含量测定方法的研究
实验⼀蛋⽩质含量测定⽅法的研究⽣物化学实验预习报告实验⼀蛋⽩质含量测定⽅法的研究⼀、研究背景蛋⽩质含量的测定⼴泛应⽤于⽣产实践、医药卫⽣等各个领域，如测定⽜奶等⾷品中蛋⽩质的含量作为其营养成分的参考值，测定病⼈尿液中蛋⽩质的含量以检测其是否患有某种疾病等，因⽽测定蛋⽩质的含量具有⾮常重要的意义。
由于蛋⽩质本⾝具有⼀系列的特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与某些染料结合等），利⽤它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理⼿段，将⼀定量的蛋⽩质转化为可以⽅便定量测定的其他量，从⽽达到测定蛋⽩质含量的⽬的。
蛋⽩质诸多特点的存在决定了它会有不同的测定⽅法，同时由于多种⾮蛋⽩组分的存在和⼲扰以及各种⽅法本⾝的局限性（适⽤条件），每⼀种测定⽅法都有各⾃的优缺点，某⼀种⽅法并不能在任何条件下适⽤于任何形式的蛋⽩质，所以多种测定⽅法的共存是有意义的。
⽬前常⽤的蛋⽩质含量测定⽅法有四种：凯⽒定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法，其中后三种⽅法最常⽤。
在实际⼯作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋⽩质的种类与性质、溶液中存在的⼲扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使⽤某种⽅法。
⼆、研究⽬标1.掌握常⽤的蛋⽩质含量测定⽅法的原理和操作流程；（基础⽬标）2.了解不同测定⽅法的优点和局限性，掌握在实际⼯作中不同测定⽅法的选择条件；（基础⽬标）3.证明⾮蛋⽩组分在蛋⽩质含量测定中存在⼲扰，并通过分析实验结果确定该⼲扰在实际⼯作中是否可以忽略。
（⾼级⽬标）三、研究策略本实验最重要的⽬的是为了确定⾮蛋⽩组分在蛋⽩质含量测定中存在的⼲扰是否可以忽略。
思路有两种：⼀种⽅法是先测定纯蛋⽩质溶液中蛋⽩质含量，随后在该溶液中加⼊⾮蛋⽩组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等⾦属离⼦，⽆机酸或⽆机碱，甚⾄某些⾊素等），测定此时蛋⽩质含量，对⽐两次测定结果，计算相对误差，从⽽得出⾮蛋⽩组分的影响程度；另⼀种⽅法是直接使⽤天然的蛋⽩质粗提取物（含有⾮蛋⽩组分，并将其中包含的所有⾮蛋⽩组分看成⼀个影响因素），来测定粗提取物中的蛋⽩质含量。
食品营养学实验2012
实验一 食物蛋白质营养价值评价一、 目的1、掌握食物蛋白质营养价值的评价指标计算方法。
2、了解动物实验的设计、分组及动物饲料的配制方法。
二、 实验动物分组和饲养1、要求用同一来源、同一品系、年龄相近、刚断奶（出生21～28天）的雄性大鼠。
动物房应保持室温22～24℃，相对湿度50%～60%，室内空气要流通。
2、先使断乳雄性大鼠适应五天，然后按体重分成三组，每组10只动物，各组动物初始平均体重组间差值小于5g ，组内个体差值小于10g 。
3、动物单笼饲养，分别喂以无氮饲料、含鱼蛋白和含酪蛋白的饲料，自由摄食及饮水。
4、进行代谢试验五天，每天收集粪、尿、净摄食量并测定其含氮量。
5、各组动物再继续喂至28天，每天记录净摄食量，每4天（包括最后一天）称一次体重。
三、 实验结果待测蛋白质动物实验结果见下表表1-1 待测蛋白质动物实验结果（x s ±,n=3）四、 要求请根据以上数据以下要求计算鱼蛋白粉和酪蛋白粉的营养价值，并分别作出评价。
1、蛋白质含量;（鱼蛋白粉=1.739*6.25；酪蛋白饲料=1.735*6.25）2、蛋白质的消化吸收：AD 、TD;3、蛋白质的利用情况：BV 、NPU 、PER 。
TD （真消化率）=100--⨯食物氮粪代谢氮）（粪氮食物氮=100⨯食物氮吸收氮AD （表观消化率）为上式中粪代谢氮=0时的数值数据无氮组 鱼蛋白粉组 酪蛋白组（对照）饲料含氮量（g/100g ）0.074 1.739 1.735 28天食耗（g ） 125.8±5.45 410.5±16 405.2±17.36 增重（g ） -33.8±1.36 104.2±4.74 103.6±5.06 5天摄入氮（g ） 0.017 1.29±0.056 1.126±0.035 5天粪氮（g ） 粪代谢氮0.075±0.006 粪氮0.166±0.004 粪氮0.109±0.01 5天尿氮（g ）尿内源氮0.103±0.006尿氮0.412±0.024尿氮0.431±0.013BV （生物价）=100⨯吸收氮储留氮，储留氮=吸收氮-（尿氮-尿内源氮）NPU （蛋白质净利用率）=100⨯食物氮储留氮=TD ×BVPER （蛋白质功效比）=摄入食物蛋白质总克数动物体重增加克数实验二 膳食调查结果计算与评价一、目的1、掌握膳食调查目的、方法、优缺点和应用范围；2、熟悉膳食调查结果计算的主要步骤；3、熟悉膳食调查结果评价的主要内容，提出膳食改进建议；4、掌握食物成分表的使用方法。
标准管法测定蛋白质含量
标准管法测定蛋白质含量
首先，准备样品。
样品的选择要代表性，需根据具体要求进行研磨或溶解处理，以保证后续测定的准确性。
接着，按照标准管法的要求，将样品进行酸水解或酶解处理，将蛋白质转化为氨基酸。
然后，利用氨基酸分析仪或其他适当的仪器，对氨基酸进行定量分析，得出样品中蛋白质的含量。
在进行标准管法测定蛋白质含量时，需要注意以下几点。
首先，操作人员需严
格按照操作规程进行操作，避免外界因素对实验结果的影响。
其次，仪器的选择和使用要符合标准要求，保证测定结果的准确性和可靠性。
此外，样品的处理和分析过程中，需注意实验条件的控制，避免温度、湿度等因素对实验结果造成影响。
最后，实验数据的处理和统计要准确可靠，确保结果的科学性和可信度。
总的来说，标准管法测定蛋白质含量是一种可靠、准确的方法，对于食品加工、医药研发等领域具有重要意义。
在实际操作中，操作人员需要严格按照标准要求进行操作，注意实验条件的控制，保证实验结果的准确性和可靠性。
希望本文的介绍能够对相关领域的研究人员有所帮助，促进相关工作的开展和发展。
实验一 蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定——Folin—酚法一、目的要求（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。
这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。
目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。
其不足之处就是此反应受多种因素干扰。
在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。
此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。
若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。
若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
生化实验01-蛋白质含量的测定
1.0mL
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
0
5mL，混匀后室温下放置5~10min
0.5mL（逐一加入并立即混匀），20~30min后，测定
A650
6
比色测定：
1号管为空白，在650nm波长下用10mm光程的比色皿测定各管 的吸光度。
标准曲线绘制：
以每管标准蛋白含量（μg）为 横坐标，吸光度（A650）为纵坐标 ，在坐标纸上绘制出标准曲线。
-3
T1
T1
T1
-1
-2
-3
3个技术重复
T2
T2
T2
-1
-2
-3
T3
T3
T3
-1
பைடு நூலகம்
-2
-3
9
五、原始数据
A650的记录
管号
12 34 5
标准蛋白 0 50 100 150 200
含量 (μg)
A650
W=
VT=
VS=
测定-1 测定-2 测定-3
N=
10
六、结果计算
• 标准曲线的绘制： 1、坐标纸绘制 2、在excel中绘制并求
出回归方程
A650
0.3 0.2 0.1
50 100 150 200
蛋白质含量（ μg ）
11
X：根据样品的吸光值查得的蛋白质含量（ μg ）； X1= , X2= ，X3= ，X平均=
12
样品中蛋白质的含量（mg/g）＝
X VT N W VS 1000
X：根据样品的吸光值查得的蛋白质量（μg）； VT：提取液总体积（mL）； Vs：测定时取用的样品体积（mL）； W：样品鲜质量（g）； N：样品稀释倍数）
《生化大实验》
考马斯亮蓝测定蛋白质含量是利用蛋白质染料 结合法的原理，定量测定微量蛋白质浓度快速、灵 敏的方法。
考马斯亮蓝存在着两种不同样色形式，
红色棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有
红色棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由变成，
测定 吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋
白
质
的
量
。
蛋白质与染料结合速度很快，就可以反
《生化大实验》
实验课程简介
生化大实验是一门综合性的实验课程， 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、 比色、层析、电泳等）的基础上，训练学 生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术。
不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存 在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的 浓度范围为—。
【仪器与试剂】 . 紫外分光光度计，比色管（的个），吸量管。 . 标准蛋白质溶液： 溶液溶解结晶牛血清白蛋
白，稀释到。 . 待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在 . 溶液 . 试管×（×） . 移液管（×），（×），（×）。
【思考题】
、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定 蛋白质浓度。
（）样品不容易溶解，但要求结果很准确。 （）要求在半天内测定个样品。 （）要求很迅速的测定一系列试管（只）中溶液的蛋 白质浓度。
、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。
二、紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验目的】 . 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 . 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验
【实验步骤】 、标准曲线法
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生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
优点： 优点： • 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何 不需添加任何试剂， 破坏； 破坏； • 测量极其简单迅速； 测量极其简单迅速； • 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 • 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白 适合测试纯度较高、 质。
生物化学与分法） 酚试剂法（ 酚试剂法 法
• • • ）、还原剂 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 铜离子螯合剂（ 、柠檬酸等）、还原剂（ 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。 、苯酚等）干扰本反应。 不同蛋白质主要因其所含的Tyr含量不同而呈现不同的吸收强度。 含量不同而呈现不同的吸收强度。 不同蛋白质主要因其所含的 含量不同而呈现不同的吸收强度 进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 进行测定时，加试剂乙时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH 要特别小心 该试剂仅在酸性 条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当试 的情况下发生， 条件下稳定，但上述还原反应只在 的情况下发生 剂乙加到碱性的铜—蛋白质溶液中时 必须立即混匀， 蛋白质溶液中时， 剂乙加到碱性的铜 蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在 磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 磷钼酸 磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。这一步 混合速度要快，否则会使显色程度减弱。 混合速度要快，否则会使显色程度减弱 反应的显色随时间不断加深， 因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控 反应的显色随时间不断加深 制时间。 制时间。 费时较长，试剂配制较繁琐 费时较长，试剂配制较繁琐。
0.375
0.5
0 . 62 5 -
0.7 5
-
-
-
-
-
4.0
A280
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（ 考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 法
原 理 ： 该 方 法 由 Bradford 于 1976年建立 。 在 酸性条件 下 ， 年建立。 酸性条件下 年建立 考马斯亮蓝与蛋白质结合后最 大光吸收波长由465 nm（ 红色） 465nm 大光吸收波长由 465 nm（ 红色 ） 转移为595 nm（ 蓝色） 595nm 转移为 595 nm（ 蓝色 ） ， 起作 用的主要氨基酸是 Arg， 用的主要 氨基酸是 Arg， 另外 ， His, Lys, Tyr, Trp 和 Phe 也 有作用。 有作用。 min呈最大光吸收 呈最大光吸收， 2 － 5 min 呈最大光吸收 ， 至少 可稳定1 可稳定1小时
生物化学与分子生物学基础实验
选择合适的蛋白质含量测定方法主要 基于几点考虑：
①有多少样品可供分析; 有多少样品可供分析; 蛋白质样品浓度大约是多少; ②蛋白质样品浓度大约是多少; 样品中含有哪些可能影响定量的化学物质 化学物质； ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； 所选方法是否简单、可靠； ④所选方法是否简单、可靠； 含量测定的专一性要求是否很高。 ⑤含量测定的专一性要求是否很高。
实验一 几种蛋白质定量测 几种蛋白质定量测 定方法的比较
生物化学与分子生物学基础实验
实验目的
掌握紫外吸收法、Folin－ 1 掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法 Lowry法 （Lowry法）和考马斯亮蓝染色法 Bradford法 （Bradford法）测定蛋白质含量的原 理和方法 2 掌握分光光度计的原理和使用方法
生物化学与分子生物学基础实验
考马斯亮蓝染色法（ 考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 法
实验操作步骤
管号 标准蛋白 ul 蒸馏水 ul 待测蛋白 ul Bradford 试剂 A595 0 0 100 5ml 1 10 90 5ml 2 20 80 5ml 3 40 60 5ml 4 60 40 5ml 5 80 20 5ml 6 100 0 5ml 7 0 0 100 5ml
室温放置 分钟后测 的光吸。 室温放置5分钟后测 放置 分钟后测595nm的光吸。 的光吸 考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇 考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用乙醇 洗涤后，用双蒸水清洗。 洗涤后，用双蒸水清洗。
生物化学与分子生物学基础实验 注意混匀，但不要剧烈震荡。 注意混匀，但不要剧烈震荡。
Folin-酚试剂法（Lowry法） 酚试剂法（ 酚试剂法 法
原理： Folin- 酚试剂法的显色试剂由试剂甲 试剂甲和 原理 ： Folin- 酚试剂法的显色试剂由 试剂甲 和 试剂乙 组成。 组成。 试剂甲中的Cu 试剂甲中的Cu2+碱性条件下与肽键形成络合物并被还原 中的 成Cu+。 以及蛋白质中的Tyr 等的侧链基团与试剂乙 反应， Tyr等的侧链基团与 试剂乙反应 Cu+ 以及蛋白质中的 Tyr 等的侧链基团与 试剂乙 反应 ， 试剂乙中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的 磷钨酸盐被蛋白质中的Tyr和 试剂乙中的磷钼酸盐 磷钨酸盐被蛋白质中的 和 残基还原， Phe残基还原 ， 产生蓝色化合物 （ 钼兰和钨兰的混合 残基还原 产生蓝色化合物（ 显色反应在30分钟内接近极限 分钟内接近极限。 物），显色反应在 分钟内接近极限。 颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。 颜色深浅与蛋白含量成正比，可在640nm下测光吸收。 640nm下测光吸收
生物化学与分子生物学基础实验
BCA法 法
方法相比， 法的操作更简单， 与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单， 方法相比 法的操作更简单 试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响， 试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响， 灵敏度更高（微量检测可达到0.5µg/ml）， 灵敏度更高（微量检测可达到 ）， 应用更加灵活。 应用更加灵活。 可耐受高达5%的表面活性剂 可耐受高达 的表面活性剂 测定不同蛋白样品时比bradford测定法结 测定不同蛋白样品时比 测定法结 果均一
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质： 物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（ 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法 法 法 ），凯氏定氮法 凯氏定氮法， （Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲 法（Biuret法），胶体金测定法，等等 法），胶体金测定法， 胶体金测定法 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染 法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（ 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量 16％ 为16％）。
生物化学与分子生物学基础实验
• •
紫外吸收法
操作步骤
管号
标准蛋白溶 ml） 液（ml） 双蒸水（ml） 双蒸水（ml） 0 0 1 1.0
3.0
2 1.5
2.5
3
2.0
4 2.5
1.5
5
3.0
6
4.0
7 0
4.0
2.0
1.0
0
1.0
0
蛋白质含量 (mg/ml) 未知蛋白溶 ml） 液（ml）
0
-
0.25
生物化学与分子生物学基础实验
紫外吸收法
缺点：
• 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波 干扰测定的影响因素多，尤其是 和 在此波 长均有强吸收 所以一定要考虑样品中是否有核酸. 长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸 有强吸收 要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的 要得到准确可靠的结果 ， 必须严格 控制样品溶液的 pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件 和化学组成， 和化学组成 一致。 一致。 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 用标准曲线法测定蛋白质含量时， 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准 蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质， 蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差 较大。 较大。
生物化学与分子生物学基础实验
图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 15μg /ml蛋白的吸收光谱 蛋白的吸收光谱。 中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白 图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白 IgG(I)、 牛血清白蛋白( B)和白明胶 G)的吸收光谱 缓冲液为： 01% 和白明胶( 的吸收光谱， IgG(I)、 牛血清白蛋白 ( B) 和白明胶 ( G) 的吸收光谱 ， 缓冲液为 ： 0 . 01 % Brij35 35, ,pH7 10μg RNA和 DNA的吸收 Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图 B 是 10 μg /ml RNA 和 DNA 的吸收 光谱。 光谱。
• • • • • 标准蛋白溶液： 标准蛋白溶液：1mg/ml BSA 未知蛋白溶液 考马斯亮蓝染色液 Folin-酚试剂甲 酚试剂甲 Folin-酚试剂乙 酚试剂乙
生物化学与分子生物学基础实验
BCA法 法
Lowry 法的改进法。 法的改进法。 碱性条件下，蛋白分子中的肽键与Cu2+形成络合物，并 形成络合物， 碱性条件下，蛋白分子中的肽键与 形成络合物 还原成Cu+； 将Cu2+还原成 还原成 ； Cu+与BCA结合成紫色复合物，在562nm处吸收值与浓 结合成紫色复合物， 与 结合成紫色复合物 处吸收值与浓 度呈正比
生物化学与分子生物学基础实验
• •
Folin-酚试剂法（Lowry法） 酚试剂法（ 酚试剂法 法
实验步骤
0 标准蛋白（ 标准蛋白（1mg/ml）ul ） 待测样品 ul 蒸馏水 ul Folin-酚试剂甲 ml 酚试剂甲 Folin-酚试剂乙 ul 酚试剂乙 A640 0 1000 4 250 1 20 4 2 40 4 3 80 4 4 5 6 7 0 200 4 120 160 200 4 4 4