酶法提取鸡蛋壳膜中透明质酸的工艺优化_朱文婷

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提取物与应用
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2016年 第 41卷 第 01期
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2.3.3 验证实验设计 通过正交实验得出各因素 的最佳组合水平，若在单因素实验中未出现该最 佳组合则需进行验证实验，即将正交实验中的最 佳因素组合与通过正交实验得出各因素的最佳水 平组合通过实验计算透明质酸的提取量，选择最 佳提取工艺条件。 2.4 透明质酸提取物成分分析的方法 2.4.1 氨基葡萄糖的测定方法 利用Elson-Morgan 法测定透明质酸中氨基葡萄糖的含量。配制浓度 为100 mg/L的盐酸氨基葡萄糖标准溶液，分别吸 取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5支具塞 试管中，补水至2.0 mL，另一支管中加2.0 mL蒸 馏水作为空白对照；分别加入7%乙酰丙酮试液1 mL，沸水浴加热25 min，冰浴5 min，放至室温， 加入对-二甲氨基苯甲醛试液1 mL，加乙醇至10 mL，60 ℃水浴1 h，测定530 nm波长下的吸光度。 以盐酸氨基葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐 标制作标准曲线。 2.4.2 残留蛋白质的测定方法 以牛血清白蛋白 为参考标准，选用考马斯亮蓝法测定提取物中残 留蛋白质含量。配制浓度为100 mg/L的蛋白标准 溶液，分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于5支试管中，补水至0.5 mL，另取一支试管中 加0.5 mL蒸馏水作为空白对照，分别在6支试管中 加入5 mL考马斯亮蓝G-250试液，混匀并静置10 min，测定595 nm波长下的吸光度。以蛋白质浓度 为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。 2.4.3 提取物成分的测定方法 称取透明质酸提 取物，加入6 mol/L盐酸溶解，沸水浴2 h，冷却 至室温，调pH至7，定容，吸取1 mL至具塞试管 中，加水1 mL，按标准曲线操作方法进行测定。
热15 min，冷却并测定530 nm波长下的吸光度。以 葡萄糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作 标准曲线。 2.2 鸡蛋壳膜的预处理
鸡蛋壳膜粉：蛋壳加入适量的水于搅拌机中 搅拌，选取上浮的壳膜进行漂洗，45 ℃烘干。将 干燥后的蛋壳膜用粉碎机粉碎，过50目筛，密封 保存备用。
分别精密称取鸡蛋壳膜粉末1.00 g于4个清洁 干燥的小锥形瓶中(编号为1~4号)，并加入40 mL蒸 馏水，使鸡蛋壳膜粉浸润。
分别精密称取鸡蛋壳膜粉末1.00 g于5个清洁 干燥的小锥形瓶中，加入40 mL的缓冲液，调节 pH，使鸡蛋壳膜粉浸润，搅拌并加热至90 ℃， 保温10 min，冷却至室温。加入1%氯化钠，加入 一定量的酶，在适当水浴温度下进行酶解提取。 待酶解完成后立即进行离心，5000 r/min离心10 min，收集上清液定容，测定葡萄糖醛酸含量。 2.3.2 正交实验设计 在单因素实验的基础上， 确定酶种类及料液比，以酶用量、pH、酶解温 度、酶解时间为因素，选择合适的水平，设计 L9(34)正交实验，确定鸡蛋壳膜透明质酸最佳提取 工艺条件。
DOI:10.13684/ki.spkj.2016.01.041
Optimization of the process of extracting hyaluronic acid from egg shell membrane by enzymatic method
ZHU Wen-ting, WU Shi-jun, YANG Hui, XU Wen-guang
精密电子天平，pH计，恒温水浴锅，高速离 心机，可见分光光度计。
2 主要方法
2.1 葡萄糖醛酸标准曲线的绘制 采用Bitter-Muir咔唑法测定葡萄糖醛酸含
量。配制浓度为80 mg/L的葡萄糖醛酸标准溶液， 分别吸取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 支具塞试管中，补水至1.0 mL，另一支管中加入 1.0 mL蒸馏水作为空白；在冰浴冷却条件下缓慢 加入硼砂硫酸试剂5 mL，沸水浴加热10 min，然 后冷却至室温，加入咔唑试液0.2 mL，沸水浴加
1号：搅拌并加热至90 ℃，保温10 min， 冷却至室温，并加入1%氯化钠；2号：搅拌并 加热至90 ℃，保温10 min，冷却至室温；3号： 加入1%氯化钠；4号：作为对照，不进行加热 和加盐操作。
分别加入复合胰蛋白酶8000 U/g，50 ℃水 浴，酶解提取5 h。待酶解完成后立即进行离心， 5000 r/min离心10 min，收集上清液进行浓缩，加 入2~3倍体积的95%乙醇进行沉淀，收集沉淀， 加水溶解用CTAB络合，收集沉淀用氯化钠溶液 解离，加入95%乙醇进行沉淀，沉淀用无水乙醇 洗涤，干燥得到透明质酸提取物。分别溶解并定 容，采用Bitter-Muir咔唑法测定葡萄糖醛酸含量， 得到透明质酸提取量。 2.3 工艺条件的优化 2.3.1 单因素实验设计 以酶种类(木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和复合胰蛋 白酶)、酶用量(20000、40000、60000、80000、 100000 U/g)、酶解时间(1、3、5、7、9 h)、酶解温 度(20、30、40、50、60 ℃)、pH(6.0，7.0，8.0， 9.0，10.0)、料液比6个因素进行单因素实验设计。
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提取物与应用
解质扩散及运转，促进创伤愈合等[1]；在临床上其 应用于黏连性手术、关节炎治疗、药物缓释、软 组织增大等方面[2]；同时它是国际公认最好的保湿 剂[3]。
我国蛋类食品工业市场需求大，禽蛋消耗 量巨大，但蛋壳一般被废弃，利用率极低[4]， 尤其是蛋壳膜，不仅造成了资源浪费，而且会 造成环境污染。如果对蛋壳膜加以回收利用， 不仅可以消除环境污染，而且可以充分利用资 源，变废为宝。
Key words: eggshell membrane; enzyme; hyaluronic acid
透明质酸(HA)又称糖醛酸，是由2个双糖单位 D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大分子黏多
糖。透明质酸有着多种重要的生理功能，如润滑 关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电
收稿日期：2015-08-07 作者简介：朱文婷(1983—)，女，硕士，讲师，研究方向为生物化学。
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2016年 第 41卷 第 01期
酶法提取鸡蛋壳膜中透明质酸的 工艺优化
朱文婷，吴士筠，杨 惠，徐文广 (武汉工商学院环境与生物工程学院，武汉 430065)
摘要：以机械法分离得到鸡蛋壳膜，经预处理，以酶种类、酶用量、料液比、pH、酶解温度、 酶解时间为考察因素，设计单因素实验。在此基础上设计L9(34)正交实验，优化透明质酸提取 的工艺条件，并对透明质酸提取物进行成分分析。结果表明，最佳提取工艺条件为复合胰蛋白
3 结果与分析
3.1 葡萄糖醛酸标准曲线的绘制


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图1 葡萄糖醛酸标准曲线
由图1可得，吸光度对葡萄糖醛酸浓度的线 性回归方程：y=0.0119x+0.0094，R²=0.9988。
酶80000 U/g、料液比1:40、pH9.0、酶解温度50 ℃、酶解时间7 h，透明质酸的提取量为23.694
mg/g。提取物中透明质酸纯度较高，其成分为：氨基葡萄糖含量为30.2%，葡萄糖醛酸含量为
32.9%。
关键词：鸡蛋壳膜；酶；透明质酸
中图分类号：TS 253
文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2016)01-0204-05
由于透明质酸中葡萄糖醛酸的含量是一定的，
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根据计算可知透明质酸中葡萄糖醛酸的含量为
46.32%，因此根据葡萄糖醛酸的含量得到透明
质酸的含量。
3.2 鸡蛋壳膜预处理的结果及分析
表1 预处理实验结果
编号 乙醇沉淀情况
水溶液 澄清度
CTAB HA提取量/
络合情况
(mg/g)
1 沉淀明显
清澈 细小粒状沉淀 4.665
本实验以鸡蛋壳膜为实验材料，对鸡蛋壳膜 中透明质酸进行研究，为能更好地利用鸡蛋壳膜 提供理论依据和技术指导。通过资源的再利用， 促进社会向绿色环保、资源节约型不断发展。
1 材料与仪器
木瓜蛋白酶；中性蛋白酶60000 U；碱性蛋白 酶60000 U；胰蛋白酶NF≥250 U/mg；复合胰蛋白 酶NF≥250 U/mg；胰凝乳蛋白酶NF≤75 U/mg； 葡萄糖醛酸标准品；Tris(三羟甲基氨基甲烷)纯度 ＞99.9%；盐酸氨基葡糖纯度＞98%；CTAB(十六 烷基三甲基溴化铵)、咔唑、硼砂(四硼酸钠)、乙 酰丙酮、碳酸钠、对-二甲氨基苯甲醛：AR；盐 酸；无水乙醇；考马斯亮蓝G-250。
目前，对于蛋壳膜中透明质酸的研究很少。 蛋壳膜是一种具有生物活性的天然亲水性半透 膜，可以选择性透过水等小分子物质，阻隔葡萄 糖等大分子物质[5]。其中主要含有乙酰氨基葡萄糖 醛酸、透明质酸、硫酸软骨素、氨基酸等可溶性 大分子[6]，这些成分在人体中有着重要的生理作 用。壳膜水解液加入化妆品中，可以使皮肤光滑 细腻有弹性。
(College of Environmental and Biological Engineering, Wuhan Technology and Business University, Wuhan 430065)
Abstract: In this experiment, the egg shell membrane was isolated by mechanical method, after pretreatment, to design a single factor experiment, the factors were investigated by using enzyme type, enzyme dosage, ratio of material to liquid, pH, temperature and time of enzymatic hydrolysis. On this basis, to design of L9(34) orthogonal experiment, optimized the process conditions for the extraction of hyaluronic acid. Analyzed the components of hyaluronic acid extract. The results showed that the optimal extraction conditionsis were that the composite trypsin was 80000 U/g, the ratio of material to liquid ratio was 1:40, pH9.0, the temperature was 50 ℃, and the time of enzymatic hydrolysis was 7 h. The extraction rate was 23.694 mg/g. The purity of hyaluronic acid in the extract was relatively high, the content of amino glucose was 30.2%, and the content of glucuronic acid is 32.9%.