实时荧光定量聚合酶链反应检测复发性阿弗他溃疡患者中人类疱疹病毒5型和8型的潜伏

国际口腔医学杂志 第 ３５ 卷 第 ２ 期 ２００８ 年 ３ 月 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．２ Ｍａｒ． ２００８
论著
－ １ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ３－
实时荧光定量聚合酶链反应检测复发性阿弗他溃疡患者中 人类疱疹病毒 ５ 型和 ８ 型的潜伏
顾 杨１， 李晶泉２， 尚 巍１， 徐 昊２， 李文颜１， 张 虹１， 陈政翰２ （ １．大连医科大学口腔医学院口腔内科教研室 辽宁 大连 １１６０２７； ２．宝生物工程（ 大连） 有限公司 辽宁 大连 １１６６００）
［摘要］ 目的 采用实时荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测轻型复发性阿弗他溃疡（ＲＡＵ）患者４种样本中人类疱 疹病毒 ５ 型（ＨＨＶ－ ５）和８型（ＨＨＶ－ ８）的潜伏情况。方法 选择 １８ 例轻型 ＲＡＵ 患者为试验组，同时选择健康者 ２３ 名为对照组进行临床采样，样本包括唾液、病变区脱落细胞、病变区组织块及外周血。然后用实时荧光定量 ＰＣＲ 检测 ４ 种样本中 ＨＨＶ－ ５ 和 ＨＨＶ－ ８ 的 ＤＮＡ。结果 ＨＨＶ－ ５ 仅在试验组患者病损区组织块样本中能检测到， 而在对照组的组织块样本中没有检测到。试验组和对照组的血液和唾液样本中均有 ＨＨＶ－ ５ 阳性检出，但两组 比较其差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；试验组和对照组的脱落细胞样本中均无 ＨＨＶ－ ５ 阳性检出。试验组和对照组 的 ４ 种样本中 ＨＨＶ－ ８ 均检出阴性。结论 ＨＨＶ－ ５ 在 ＲＡＵ 患者的溃疡区可能有潜伏。 ［关键词］ 复发性阿弗他溃疡； 实时荧光定量聚合酶链反应； 人类疱疹病毒 ５ 型； 人类疱疹病毒 ８ 型 ［中图分类号］ ７８１．５＋３ ［文献标识码］ Ａ
使用大连宝生物公司提供的样本总 ＤＮＡ 纯 化试剂盒提取纯化所有样本的ＤＮＡ（严格按照使 用 说 明 操 作）。 已 知 细 胞 数 量 的 白 细 胞 样 本 、 １ ｍＬ 唾液样本、黏膜脱落细胞样本 （用胰蛋白酶 法分离细胞，相差显微镜下计数黏膜脱落细胞总 数不少于 １０６个）、经匀浆处理后的组织块样本均 用于 ＤＮＡ 的提取与纯化［９－１１］。除了唾液之外，其 他样本的 ＤＮＡ 均需作 ＯＤ２６０ ｎｍ测定。 １．３ 实时荧光定量 ＰＣＲ 检测 １．３．１ 检测方法及原理 本试验是采用 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 方法行定量 ＰＣＲ 检测。Ｃｙｃｌｅａｖｅ 法是由 ＲＮＡ 和 ＤＮＡ 构成的杂合 Ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ 与 ＲＮａｓｅ Ｈ 组合 使用的高灵敏度检出法，能够高效率地检出目的 基因。Ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ 内部夹有 ＲＮＡ 部分，５′端标 记荧光物质，３′端标记荧光淬灭物质，当探针处 于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质 发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂 交后，ＲＮａｓｅ Ｈ 在 ＲＮＡ 部分将探针切断，淬灭 抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧 光强度，能够实时监控扩增产物量。如果探针的 ＲＮＡ 部分或与 ＲＮＡ 部分相邻的 ２～３ 个碱基与模 板不互补，ＲＮａｓｅ Ｈ 就不能切断探针，所以该检 出方法是一种即使一个碱基不同也能识别的高特 异性检出方法。 １．３．２ 引物和探针 本试验所用人类疱疹病毒 ５ 型和 ８ 型的引物区及探针区见表 １。 １．３．３ 实验步骤 １）目的片段调取及 ＴＡ 克隆。 选择临床样本若干份提取 ＤＮＡ，将提取获得的 ＤＮＡ 模板作定性 ＰＣＲ 扩增以筛查 ＨＨＶ－ ５；扩增 产物经 １％琼脂糖凝胶电泳，然后对ＨＨＶ－ ５ 的特 异性阳性条带割胶纯化；纯化的 ＰＣＲ 扩增产物作 测序验证。再调取 ＨＨＶ－ ５ 目的基因片段克隆到 ｐＭＤ１８－ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ 上扩增；将 ＨＨＶ－ ５ 质粒用 Ｈｉｎｄ Ⅲ限制酶切进行线性化处理，ＰＣＩ 抽提、乙醇精 制后得到标准品 ＤＮＡ。标准品ＤＮＡ 也作测序验
Ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｒ ｅａｌ － ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒ ｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｈｕｍａｎ ｈｅｒ ｐｅｓ ｖｉｒ ｕｓｅｓ－ ５ ａｎｄ ８ ｉｎ ｒ ｅｃｕｒ ｒ ｅｎｔ ａｐｈｔｈｏｕｓ ｕｌｃｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ＧＵ Ｙａｎｇ１， ＬＩ Ｊｉｎｇ－ ｑｕａｎ２， ＳＨＡＮＧ Ｗｅｉ１， ＸＵ Ｈａｏ２，ＬＩ Ｗｅｎ－ ｙａｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｚｈｅｎｇ－ ｈａｎ２．（１． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６０２７，Ｃｈｉｎａ；２． Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｌｉａｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６６００， Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒ ａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ＤＮＴ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ－ ５ ａｎｄ ８（ＨＨＶ－ ５ ａｎｄ ８）ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｉｎｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｐｈｔｈｏｕｓ ｕｌｃｅ（ｒ ＭｉＲＡＵ） ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａ， ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ， ｂｉｏｐｓｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ １８ ＭｉＲＡＵ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ２３ ｈｅａｌｔｈ ｐｅｒｓｏｎｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｏｎｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｏｒ ｐｅｒｓｏｎ ｂｙ ｏｒａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ． Ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｅｘａｃｔｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ－ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＨＨＶ－ ５ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ＭｉＲＡＵ ｂｉｏｐｓｙ ｓａｍｐｌｅｓ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ （Ｐ＜０．０５）． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ＨＨＶ－ ５ ｐｏｓｉ－ ｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ＭｉＲＡＵ ｓａｌｉｖａ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｅｓｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｈｅａｌｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ （Ｐ＞０．０５）． Ｉｎ ａｎｏｔｈｅｒ ｐａｒｔ， ｗｅ ｄｉｄ ｎｏｔ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ＨＨＶ－ ５ ｉｎ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ＨＨＶ－ ８ ｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｔ ｉｓ ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｔｈａｔ ＨＨＶ－ ５ ｍａｙ ｂｅ ｃｏｎｃｅａｌｅｄ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｏｒａｌ ｓｍａｌｌ ｓａｌａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ａｃｃｏｕｎｔ ｏｆ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｌ ｐｏｓｔｐｏｎｅｍｅｎｔ ｉｎ ＭｉＲＡＵ ｐａｔｉｅｎｔｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ］ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｐｈｔｈｏｕｓ ｕｌｃｅｒ； ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ－ ５； ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ－ ８
者在 ＲＡＵ 患者的病损局部和（或）外周血中找到了 人类疱疹病毒的 ＤＮＡ片断［２－５］。在样本取材方面， 以往的研究分别包括了病损部位的组织块、血液、 唾液和脱落细胞，但没有对同一患者同时采集 上述 ４ 种样本作研究的。在研究对象方面分别包 括 了 人 类 疱 疹 病 毒 １ ￣８ 型（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ， ＨＨＶ１￣８）的所有人类疱疹病毒；所使用的研究方 法分别包括了免疫组织化学、定性 ＰＣＲ 和原位
１ 材料和方法
１．１ 临床样本选取和处理 １．１．１ 试验组患者的选择 选择 ２００２ 年 ９ 月— ２００３ 年 ６ 月在大连医科大学附属第二医院口腔科 和大连医科大学整形美容口腔门诊就诊，经临床 确诊为轻型 ＲＡＵ 的患者 １８ 例作为试验组。其中 男性 ６ 例，女性 １２ 例，年龄 ２３￣６２ 岁，平均年 龄 ３５ 岁。纳入患者要求：１）患病１年以上；２）患 者均因溃疡此起彼伏，经久不愈而要求活检，知 情同意后行样本采集；３）无严重的系统性疾病； ４）近期未服用过免疫药物和抗病毒药物。 １．１．２ 健康对照组的选择 同期，在大连医科大 学附属第二医院健康体检中心选择接近患者组年 龄、性别及社会生活背景的健康且未患过 ＲＡＵ 的自愿者 １０ 例。其中男性 ３ 例，女性 ７ 例，年 龄 ２０￣６０ 岁，平均年龄 ３６ 岁；取唾液、脱落细 胞和外周血。在大连医科大学附属第二医院口腔 科和大连医科大学整形美容口腔门诊随机选择 １３ 例无 ＲＡＵ 病史的健康智齿拔除者，男性 ８ 例， 女性 ５ 例，年龄 １６￣３５ 岁，平均年龄 ２６ 岁；此 １３ 例患者知情同意后取拔牙创相邻黏膜组织块， 其中 ３ 例还收集了唾液和脱落细胞。以上共 ２３ 例健康者作为本试验的对照组。 １．１．３ 临床样本的采集 样本的采集包括：１）抽 取两组人员自然状态下舌底区唾液 １ ｍＬ；２）刮取 试验组患者病损区的黏膜脱落细胞和健康对照组 的 颊 黏 膜 脱 落 细 胞 ； ３）切 取 试 验 组 患 者 病 损 区的组织块和健康对照组的拔牙创相邻黏膜组织 块，体积不小于 １ ｍｍ３；４）留取两组人员外周血 ２～４ ｍＬ。脱落细胞采集是用改制的刮板在黏膜上 连续刮 ９ 次，每 ３ 次在 ＥＰ 管内用 ＴＥＡ 缓冲液冲 洗 １ 次；血液在两组人员作血常规化验抽血时留 取，ＥＤＴＡ 抗凝。以上所有采集到的样本均立即 放入冰盒中暂时保存，然后转送实验室。