虎纹蛙骨髓细胞的染色体核型分析

10
0.15 0.24 0.39
11
0.11 0.25Байду номын сангаас0.37
12
0.17 0.19 0.36
13
0.16 0.17 0.33
表一 虎纹蛙的核型数据
臂指数=长臂 命名（简称） 着丝点位置
长/短臂长
1.33
正中部着丝 m
粒
1.59
正中部着丝 m
粒
1.55
正中部着丝 m
粒
2.52
亚中部着丝 sm
粒
1.23
[1,3,4,5]核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用，对探讨动植物起源、物种间亲缘关系、 鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。 1 材料与方法 1.1 材料
虎纹蛙成体，体重 36.51g； 1.2 试剂 1.2.1 Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）； 1.2.2 0.1%秋水仙素溶液：称取 10mg 秋水仙素，加入 10ml 0.65%生理盐水（1ml 含有 1000μg,0.1ml
空气干燥；
1.4.1.11 镜检：在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中
的分裂相进行观察。
1.4.2 青蛙骨髓细胞染色体的核型分析
染色体的基本形态学特征一般通过相对长度、臂指数、着丝粒指数三个参数进行描述。
相对长度（relative length）：指单个染色体长度与包括 X（或 Y）染色体在内的单倍染色体总
正中部着丝 m
粒
1.84
亚中部着丝 sm
粒
1.80
亚中部着丝 sm
粒
1.76
亚中部着丝 sm
粒
1.16
正中部着丝 m
粒
1.56
正中部着丝 m
粒
2.24
亚中部着丝 sm
粒
1.16
正中部着丝 m
粒
1.09
正中部着丝 m
粒
相对长度 0.14 0.14 0.11 0.11 0.09 0.06 0.06 0.06 0.05 0.05 0.04 0.04 0.04
1.4.1.3 收集骨髓细胞：用刀片切开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出
骨髓细胞至离心管中，直至股骨变为白色为止。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以 1000 r/min
离心 10 min；
1.4.1.4 低渗处理：弃上清液，加入 6 ml 蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置于 26℃温箱
175-178. [3] 包松莲, et al. "塔拉染色体核型分析." 江苏农业科学 40.7 (2012): 176-177. [4] 赵刚, 余其兴, and 刘江东. "黑斑蛙骨髓细胞染色体标本制备的新方法." 生物学杂志 006 (2010): 97-99. [5] 邹佩贞. "广东韶关地区虎纹蛙· 黑斑蛙染色体核型分析." 安徽农业科学 36.31 (2009): 13516-13518. [6] 乔永刚, and 宋芸. "利用 EXCLE 制作核型模式图." 农业网络信息 010 (2006): 97-98.
虎纹蛙骨髓细胞染色体核型分析
***（作者姓名） （中山大学生命科学学院 10 级生科 1 班 广州 510275）
摘要：虎纹蛙在中国南方分布广，可人工养殖，是常用的动物实验材料。骨髓细胞分裂旺盛，用秋
水仙素处理后，可用于染色体标本的制备，也是染色体核型分析的良好材料。染色体核型分析是物 种遗传学研究的常用方法，因此掌握染色体标本的制备和核型分析方法有重要的意义。通过对虎纹 蛙骨髓细胞染色体标本的制备和核型分析可知，虎纹蛙的染色体数为 2n=26,核型为 16m+10sm。最后， 还对虎纹蛙骨髓细胞染色体标本制备的关键因素进行了探讨。
中低渗 20 min；
1.4.1.5 预固定：加入 5 滴新配的固定液，立即打匀，并以 1000 r/min 离心 10 min 后，弃上清液；
1.4.1.6 固定：沿管壁慢慢加入 6 ml 固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定 20 min。
1000 r/min 离心 10 min 后弃上清液；
虎纹蛙的二倍体染色体数为 2n=26（16m+10sm），可配为 13 对同源染色体，其中 1-5 号为大染 色体，6-13 号为小染色体。根据 13 对染色体的相对长度和臂比值可将染色体分为 A、B、C 组。
图一 虎纹蛙的中期分裂相（由老师提供的照片清晰化处理所得）及核型
染色体序 短臂长 长臂长
Analysis on karyotype of Rana tigrinarogulosa
Lau Kimura Class 1 of the 10th Biology Science department in Life Science school, Sun Yat-sen University, Guangzhou
表二 虎纹蛙的染色体核型模式图（组型）
3 讨论 3.1 失败原因分析
虎纹蛙骨髓细胞染色体标本中，染色体虽然很多，但是却没有发现中期分裂相。依据实验原理 和步骤可知，主要是秋水仙素处理和低渗处理这两个关键步骤导致本次染色体标本制备实验的失败。
1) 秋水仙素处理时间用量不足。本次实验中，秋水仙素处理的剂量约为 3μg/g，在参考教材
按 Levan（1964）的划分标准：臂指数在 1.0～1.7 之间称中部着丝粒染色体（m）；臂指数在 1.7～ 3.0 之间称亚中部着丝粒染色体（sm）；臂指数在 3.0～7.0 之间称亚端部着丝粒染色体（st）；臂指 数 ＞ 7.0 者为端部着丝粒染色体（t）。着丝粒指数在 50.0%～37.5%之间称中部着丝粒染色体（m）； 着丝粒指数在 37.5%～25.0%之间称亚中部着丝粒染色体（sm）；着丝粒指数在 25.0%～12.5%之间称 亚端部着丝粒染色体（st）；着丝粒指数在 12.5%～0.0%之间称端部着丝粒染色体（t）。 1.4.2.1 用 Photoshop 对照片中的染色体进行剪切、分离、配对。 1.4.2.2 用 Photoshop 的测量工具，测量每条染色体短臂和长臂长度，计算出各条染色体的相对长 度、着丝粒指数、臂指数，并记录原始数据。 1.4.2.3 根据测量数据校正目测配对排列的结果，进行调整排列，最后制成一张完整的染色体核型 图。 1.4.2.4 用 Excel 进行数据分析和处理，得出青蛙染色体组型公式。 2 结果分析 2.1 核型
含有 100μg 秋水仙素）； 1.2.3 0.65%生理盐水 1.2.4 1/15mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）； 1.2.5 Giemasa 染液； 1.3 器材
天平、离心机、温箱、显微镜、注射器、解剖盘、解剖剪、刀片、试管架、10ml 离心管、吸管、 烧杯、量筒、酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸。 1.4 方法 1.4.1 青蛙骨髓细胞染色体标本的制备 1.4.1.1 秋水仙素处理：实验前 4h，体重为 36.51g 的青蛙，腹腔注射 100ug 秋水仙素； 1.4.1.2 取股骨：毁髓法处死青蛙后，立即取出股骨，用刀片剃掉肌肉；
的建议范围（2-4μg/g）之内。但是《广东韶关地区虎纹蛙 ·黑斑蛙染色体核型分析 》
文献中，秋水仙素处理的剂量高达 15μg/g，6-8h，并得到很好的实验结果。然而秋水仙素的 浓度过高，处理时间过长，也会使染色体过分收缩，不利于形态观察。 2) 低渗处理不足。低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。如果 低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。本次实验在“镜检”时发现， 几乎全部的骨髓细胞内染色体聚集一起，可推断是低渗时间不足。 3) 离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离 心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 实验过程中的离 心操作都是参考教材规范操作，几乎没有细胞破裂，细胞数量也充足，因此可排除离心的影响。 3.2 改进方案探讨 虽然本次实验制备骨髓细胞染色体标本无法得到有效的结果，但经过一番深刻的思考和总结， 我们更加领会到实验中材料准备、秋水仙素处理、低渗，离心和固定操作、滴片和染色的每一个步 骤的精髓，对取得良好的染色体标本也更加有信心和希望。 参考文献 [1] 王金发, 何炎明. 细胞生物学实验教程. 科学出版社, 2010, 91. [2] 罗琛, and 刘楚吾. "虎纹蛙人工养殖的研究初报." 湖南师范大学自然科学学报 15.002 (1992):
号
（mm） (mm)
1
0.52 0.69
总长 (mm)
1.21
2
0.44 0.71 1.15
3
0.38 0.59 0.97
4
0.26 0.65 0.90
5
0.34 0.41 0.75
6
0.19 0.35 0.54
7
0.18 0.33 0.52
8
0.18 0.31 0.49
9
0.21 0.24 0.44
长之比，以百分率表示。
相对长度
=
每个染色体的长度 单倍染色体 + X染色体总长度
×100%
臂指数（am index）：指长臂与短臂的比率，即臂指数＝长臂的长度/短臂的长度。
臂指数=
长臂长度 短臂长度
着丝粒指数（centromere index）指短臂占该染色体长度的比率。 着丝粒指数 = 短臂长度 ×100% 该染色体总长
关键词：虎纹蛙；骨髓细胞；核型；组型
[2,4,5]虎纹蛙是隶属于两栖纲无尾目蛙科蛙属的动物，是中国南方最常见的两栖动物。虎纹蛙 在 90 年代已经实现人工养殖，是动物学实验教学和研究的常用材料。[1,4]在高等学校细胞生物学 或遗传学实验课中，虎纹蛙骨髓细胞具有染色体大，染色体数目少（2n=26）等独特优点，是动物染 色体标本制备和染色体核型分析的常用实验材料之一。