价值微藻转化系统的构建及集胞藻PCC 6803假定蛋白功能预测

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价值微藻转化系统的构建及集胞藻PCC 6803假定蛋白功能预测

价值微藻转化系统的构建及集胞藻PCC 6803假定蛋白功能预测雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是两种重要的价值微藻。

其中,雨生红球藻是天然虾青素(Astaxanthin)的重要来源,寇氏隐甲藻已被广泛应用于工业生产二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)。

为提高目标产物产率并降低生产成本,我们旨在开发基于同源重组与电击转化的遗传操作系统。

在本研究中:1)确定了多种抗生素对目的藻株的作用浓度。

在固体和液体培养基中20μg/m L草丁膦可抑制雨生红球藻的生长,在固体培养基中40μg/m L潮霉素B可对寇氏隐甲藻的生长产生抑制作用;2)PCR克隆目的基因片段。

采用融合PCR方法构建了两种类型的外源基因片段,一种包含18S 上游基因、抗性基因盒和18S下游基因三种基因片段,另一种包含18S上游基因、抗性基因和18S下游基因三种基因片段;3)优化了电击条件并进行真核微藻的电击转化。

结果表明,在2 mm电击杯、1.2 kV电压、25μF电容、200Ω条件下可将含草丁膦抗性基因盒(bar cassette)的外源基因片段转入雨生红球藻中。

以基因组DNA为模板进行PCR验证了bar基因整合到了染色体上。

然而,在潮霉素B抗性平板筛选转化子并未得到寇氏隐甲藻藻落。

假定蛋白功能推测已成为后基因组时代的重要研究内容,对其功能信息的缺失阻碍了对微生物生理遗传研究的深入。

本研究中,我们提出了一套基于组学数据和蛋白相互作用数据的假定蛋白功能网络预测方案。

该方案包括两个步骤:1)利用不同胁迫条件下的集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)蛋白组和转录组数据建立共表达网络,之后与蛋白相互作用网络整合构建双色网络;2)针对双色网络,应用全局传播算法进行假定蛋白功能推测。

该算法可将基因/蛋白与已知基因本体功能分类的联系进行排序,并认为每种功能分类下,首位假定蛋白可能与该功能有关。

集胞藻PCC6803铜离子诱导表达平台的构建

１材料与方法
１．１菌株（藻株）、质粒和培养集胞藻ＰＣＣ６８０３由
ｐｅｔＥ启动子调控ｈｅｔＲ的表达，随着铜离子浓度的增
加，异形胞发生频率也逐渐增加，导致成簇异形胞的形成，表明ｈｅｔＲ是启动异形胞分化的基因ｌ３Ｊ。ｐａｔＳ
究其基因功能已获得很大成功，但是对于某些涉及其基本生命活动的基因，往往很难直接通过基因敲除的方法得到完全分离的突变株。为此，我们利用集胞藻ｐｅｔＥ基因的启动子，在其基因组中构建了一个铜离子诱导表达的平台。以ｌａｃＺ作为报告基因，证明铜离子能有效诱导ｌａｃＺ表达，该平台将能够用于在集胞藻中研究某些必需基因的功能。
蓝藻是一类能进行放氧型光合作用的原核生物，广泛分布在地球上各类型水体和一些陆生环境，是海洋和内陆水体中最重要的原初生产者。越来越
多的研究表明，蓝藻适应外界环境的变化主要是通过调节基因表达来实现的。利用不同的启动子探测
基因调节异形胞图式的形成。用ｐｅｔＥ启动子调节ｐａｔＳ表达水平，随着铜离子浓度的逐渐增加，异形胞
蓝藻的基因组中。通过调节培养基中铜离子的浓度发现，ｌａｃＺ的表达能够人为控制。特别是当铜离子浓度在６ —

【国家自然科学基金】_集胞藻pcc6803_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140730

2014年序号 1 2 3 4 5
科研热词阿特拉津藻百草枯毒性 mda
推荐指数 1 1 1 1 1
推荐指数 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
2013年科研热词推荐指数集胞藻 2 转录调控 2 染色体 2 ssl2749-sll1411基因 2 集胞藻pcc6803 1 集胞藻6803 1 超氧化物歧化酶 1 藻蓝蛋白-β 亚基 1 色素裂合酶 1 缺失突变 1 纯化 1 第二位点蛋白酶(s2p) 1 穿孔素基因(124l) 1 漂白现象 1 水华蓝藻噬藻体pav-ld 1 底物 1 定点突变 1 同源重组 1 叶绿素a 1 原核表达 1 内肽酶基因(123l) 1 体内重组 1 主要衣壳蛋白基因(073r) 1 丙二醛 1 pb(no3)2 1 anti-σ 因子 1
推荐指数 3 1 1 1 1 1 1 1
2012年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
科研热词集胞藻pcc6803 sll0862 脂肪酸脂肪酶结构功能预测纯化热胁迫氧化胁迫对硝基苯丁酸酯原核表达克隆表达体外酶活鉴定 slr0643 sll1969 sll0853 s2p金属蛋白酶
2009年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
科研热词集胞藻pcc6803 集胞藻6803 集胞藻随机插入诱变蛋白酶egy1 膜蛋白突变株突变体同源基因光合自养生长 slr0643 sll0862 sll0260 ppete 77k荧光

集胞藻ＰＣＣ６８０３中基因ｓｌｒ０６８１功能初步研究

集胞藻ＰＣＣ６８０３中基因ｓｌｒ０６８１功能初步研究作者：崔晓艳钟轲耿耘宣宁孙秀芹牛旭东康佳陈高来源：《山东农业科学》2021年第12期摘要：类胡萝卜素是人体内维生素A的主要来源，具有抗氧化、免疫调节、抗癌等作用。

前期初步推测集胞藻PCC6803中slr0681基因在类胡萝卜素代谢中有重要作用。

本研究利用同源重组方法构建了slr0681基因敲除突变株Δslr0681，研究了突变株与野生型在高盐胁迫条件下叶绿素a和类胡萝卜素含量变化以及光系统Ⅰ（PSⅠ）和光系统Ⅱ（PSⅡ）相关基因表达情况。

结果表明，高盐胁迫下，突变株比野生型更具生命活力;高盐胁迫下Δslr0681中类胡萝卜素和叶绿素a含量高于野生型;PSⅠ中psaA、psaB、psaL和PSⅡ中psbB、psbD基因的相对表达量较野生型分别增加3.4、1.9、1.5倍和2.1、1.6倍。

以上结果表明，slr0681基因对于集胞藻类胡萝卜素代谢有重要作用，并且在高盐胁迫条件下影响更为突出。

本研究为后续利用合成生物学策略提高微藻类胡萝卜素代谢奠定了基础。

关键词：集胞藻PCC6803;slr0681基因;类胡萝卜素;高盐胁迫;光系统中图分类号：Q949.22：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2021）12-0001-07集胞藻PCC6803（以下简称集胞藻）是一种单细胞蓝藻，有天然的外源DNA转化系统，具有遗传背景清晰、表达外源产物不形成包含体等优点[1]，是理想的蓝藻基因工程受体。

类胡萝卜素在动物和人体中发挥着重要的作用，如预防疾病、提高机体免疫力、维持动物正常生长与繁殖等。

类胡萝卜素是一类脂溶性的类异戊二烯化合物，也是进行光合作用、由生物产生的亲脂性色素[2]，其可通过猝灭活性氧防止氧化，并且可在光合生物中收集光能[2，3]，在许多生物中起着核心作用。

近年来，类胡萝卜素在医药、食品、保健品、化妆品以及饲料行业中得到了广泛应用[4]。

集胞藻PCC6803光激活异养生长必需基因s110886的研究

刘朝莹，２徐旭东孔任秋
（．中国科学院水生生物研究所，汉１武４０７；．国科学院研究生院，京１０４）３０２２中北００９
摘要：胞藻ＰＣ８３能够在微弱、时光刺激的条件下利用葡萄糖进行异养生长，为光激活异养生长（ＡＧ。集Ｃ６０短称ＬＨ）
进行ＬＨ时，加５ｍｌＬ葡萄糖，暗盒中，ＡＧ补ｍｏ／置每天光照５ｉ。光异养生长除加５ｍｌＬ葡萄糖外，ｍｎｖｏ／还添加５ｍｌＬＣｖｏＤＭＵ抑制光合作用。使用／
ｐＷ１８质粒＿转化集胞藻６０Ｋ１８６Ｊ８３获得的Ｋ抗性ｍ
ｓ１８６对于ＬＨ是必需的＿。ｓ１８６的产物预１０８ＡＧ３１０８Ｊ
测含有３１Ｒ序列，个１Ｐ并且是一个膜蛋白。１Ｒ序列１Ｐ是一个含有３４个氨基酸残基具有ａ旋结构的保守螺序列，以串联排列的方式存在于各种不同的蛋白常中，目可以从３到１个甚至更多，数６可参与介导蛋白间相互作用和信号传导＿５。为探明ｓ１８６蛋白本４．Ｊ１０８身是否受光信号调控，研究对该蛋白进行了表达、本纯化和兔抗血清制备，以Ｗｅｔ印迹法检查了它并ｓｒｅｎ
１材料与方法１１藻株、养和转化集胞藻６０．培８３由北京大学

集胞藻pcc6803适应寒冷条件的遗传学基础

集胞藻pcc6803适应寒冷条件的遗传学基础伴随着全球变暖及气候变化，研究全球气候变化及其影响已成为时下紧迫的课题。

目前全球气候变化的影响及其产生的原因有待进一步探究，其中温度变化是全球气候变化中的一个重要组成部分。

在面对寒冷的冬季，对于温度敏感的微生物（如胞藻），适应并审时度势变化的驱动力是由遗传学进化真实反映的。

本文旨在研究集胞藻pcc6803适应寒冷条件的遗传学基础。

昆虫，鱼类和大多数人类有一个共同的策略来适应寒冷的环境，那就是表观遗传学。

它是一种快速有效的应对机制，采用的技术是将变异的基因组结合到更不稳定的水平上，从而影响未来的遗传进化。

集胞藻pcc6803是一种恒温藻类，也就是说它不适应冷热环境的变化，但是凭借某些表观遗传学机制，该藻类也可以适应冷冻条件。

在解决具有冷冻条件的恒温藻pcc6803如何适应寒冷环境的问题之前，首先需要弄清楚其调节策略。

首先，研究人员进行了表观遗传学实验，发现这种恒温藻有一种转录因子，它可以调节细胞中温度控制有关基因的表达。

该转录因子能够通过调节温度控制基因的表达水平来调节细胞的适应性，从而使恒温藻pcc6803能够适应寒冷的环境。

研究人员还发现，这种恒温藻的遗传变化能够通过遗传学随机突变进行响应，以改进细胞的适应性。

与自然突变不同，该藻类的基因组可以产生表观遗传学变异，从而影响蛋白质的结构及功能，改变蛋白质的表达水平，从而在逆境环境中保护细胞，使细胞能够适应寒冷条件。

研究表明，以上两种调节策略能够让集胞藻pcc6803适应寒冷条件，它们分别是：1.通过表观遗传学实验调节温度控制基因的表达水平；2.通过遗传学突变，改变蛋白质的表达水平，从而使细胞能够适应寒冷条件。

此外，该研究还发现，pcc6803细胞中存在多种抗逆性DNA复制机制，特别是在寒冷条件下，以及一种脂质调节机制，可以降低脂质体内温度，有助于细胞适应寒冷环境。

总而言之，通过表观遗传学和遗传学突变机制，pcc6803细胞可以适应寒冷环境，从而有助于细胞的生存和生物进化。

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803脂质组的分析

doi: 10.7541/2021.2019.254集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803脂质组的分析郭晓烨1, 2李艳华1韩丹翔1, 2(1. 中国科学院水生生物研究所, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)摘要: 以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803为研究对象, 研究建立了基于超高效液相色谱耦合串联质谱技术脂质组学分析方法。

鸟枪法脂质组学通过电喷雾离子化有效分离油脂粗提物中所含单个脂质分子, 在三重四极杆扫描碎片离子, 能够利用特征片段离子鉴定光合甘油酯的种类和酰基组成, 具有高效、灵敏度高和质量准确度高等优点。

对不同光强下生长的Synechocystis sp. PCC 6803细胞的各脂质组分进行了全定量分析, 发现单半乳糖甘油二酯 (Monogalactosyldiacylglycerol, MGDG)和磷脂酰甘油(Phosphatidyl glycerol, PG)在高光处理的第2小时即显著积累, 增长量分别为34.64%和68.49%, 其中以含有从头合成、高度饱和的脂肪酸的种类增长最为快速和显著, 而后高不饱和度的脂肪酸组成的种类逐渐积累。

双半乳糖甘油二脂(Digalactosyldiacy-lglycerol, DGDG)在各时间点都持续增长, 12h 后增长量达26.95%, 硫代异鼠李糖甘油二酯(Sulfoquinovosyl diacylglycerol, SQDG)的含量则呈现出不断下降的趋势。

研究所建立的脂质组学分析方法对进一步研究Synechocystis sp. PCC 6803的脂质代谢及生理功能提供了有力的分析工具。

关键词: 脂质组; 集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803; 高光适应; 甘油酯中图分类号: Q946.4 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2021)02-0376-11类囊体膜是光合作用的发生场所, 为光合作用相关的蛋白复合物提供了一个连续的封闭膜系统,使两个横向分离的光系统之间移动的电子传输元件得以扩散[1]。

集胞藻6803中一个未知基因的功能分析及其自然转化条件的优化的开题报告

集胞藻6803中一个未知基因的功能分析及其自然转
化条件的优化的开题报告
题目：集胞藻6803中一个未知基因的功能分析及其自然转化条件的优化
一、选题背景及意义
集胞藻（Synechococcus sp. PCC 6803）是一种广泛应用于光合作用、微生物学、光合材料等多个领域的典型双链藻类。

近年来，研究者
们对其中一些未知基因的功能进行研究，以期探究其在细胞代谢、生长、光合途径等方面的重要作用。

本项目旨在研究集胞藻6803中一个未知基因的功能，并探究该基因自然转化的优化条件，为其未来应用奠定基础。

二、研究设计及方法
1. 确定目标基因：通过基因芯片、PCR等技术手段，排除其他已知
基因对研究对象的影响，确定目标基因。

2. 获得重组菌株：通过PCR扩增目标基因并构建表达载体；转化到Escherichia coli进行表达，纯化载体酶，获得目标基因。

3. 基因功能分析：利用该基因的启动密码子进行表达，对不同培养
条件的细胞进行检测，观察细胞生长、代谢、光合特性等参数的变化，
探究基因在这些方面中的作用。

4. 自然转化条件优化：根据集胞藻6803的生长特性和基因转化条
件优化经验，分别尝试不同培养基、温度、光照强度、基因载体浓度等
因素对基因的转化效率进行优化。

5. 数据分析：利用生物信息学技术对实验数据进行分析，对比实验
结果得出结论。

三、预期结果
1. 确定集胞藻6803中一个未知基因的序列和功能。

2. 确定集胞藻6803中自然转化该基因的最佳条件。

3. 打下进一步探究该基因对细胞代谢、生长、光合特性等方面作用的基础。

集胞藻pcc6803适应寒冷条件的遗传学基础

集胞藻pcc6803适应寒冷条件的遗传学基础金黄色藻类PCC6803是一种重要的淡水藻类，能够在室温缓慢增长。

自20世纪以来，由于其全面可生物合成、强大的应激性和适应能力，一直是重要的模式生物。

因此，研究它的适应性过程，如何适应低温条件，尤其是其遗传学基础，是已有的研究趋势。

一、生物组学在PCC6803适应寒冷条件的研究中的作用(1)蛋白质组学蛋白质差异可提供细胞在逆境条件下的敏感变化的细节信息。

通过比较不同温度条件下的金黄色藻类PCC6803的蛋白质分子组成，可以探索其适应寒冷条件的可能机制。

(2)代谢组学通过代谢组学分析可以研究金黄藻289株PCC6803在不同温度条件下的代谢调整过程。

通过调查其代谢途径，可能提供关于藻类表观遗传调控机制的重要线索。

二、对于PCC6803适应寒冷条件的遗传学基础的研究(1) DNA分子组学研究大量全基因组DNA分子组学样本收集并分析，可以用于探索金黄藻PCC6803适应环境冷压的遗传变异状况，有利于深入理解其适应性增强的基础。

(2) 基因组选择研究基因组选择研究技术可以用来研究寒冷对金黄藻PCC6803基因组的影响，其结果有助于探究促进其环境适应性增强的分子机制，明确包括基因表达调控机制在内的调控网络。

三、基因工程技术在研究PCC6803适应寒冷条件的功能性基础中的应用(1) 基因敲除技术基因敲除技术可以被用来鉴定对金黄藻PCC6803有密切关系的寒冷应激基因，考察其编码基因调控细胞逆境应激调节机制的作用，以及在响应低温应激中起着关键作用的基因。

(2) 基因改造技术基因改造技术可以用来改变金黄藻PCC6803多种寒冷应激基因的表达水平，以提高对寒冷环境的适应能力，甚至可以构建拥有优异寒冷适应性的基因工程藻株。

四、结论金黄藻PCC6803适应寒冷条件的遗传学基础的研究，非常有必要的。

通过结合生物组学、代谢组学、核酸分子组学和基因工程技术，可以对其调节的表观遗传、分子机制及其功能性基础进行研究，有助于揭示它们在逆境条件下的调节机制，为提高大藻类寒耐性提供重要借鉴。

集胞藻PCC6803铜离子调控表达平台和新型插入突变方法的建立的开题报告

集胞藻PCC6803铜离子调控表达平台和新型插入突
变方法的建立的开题报告
本文的研究对象是一种名为集胞藻(PCC6803)的蓝藻，该藻类在微生物学中具有重要的研究价值。

本文旨在建立一种新的集胞藻PCC6803的铜离子调控表达平台，并且提出了一种新型的插入突变方法。

这两项技术的建立将为集胞藻在基因调控和基因工程方面的研究提供新的手段和平台。

具体地说，本文的研究包括以下几个方面：
1. 集胞藻PCC6803的铜离子响应元件的筛选和构建。

通过文献调研和实验验证，确定了适合在集胞藻中使用的铜离子响应元件，并将其与基因表达控制元件进行组合构建成铜离子调控表达平台。

2. 集胞藻PCC6803的新型插入突变方法的建立。

该方法基于转座子基因的原理，利用自行合成的转座体等元件，实现在集胞藻基因组中的特定位置进行插入突变。

3. 应用建立的铜离子调控表达平台和新型插入突变方法，对集胞藻中的多个基因进行了调控和突变，包括抗氧化酶、光合作用蛋白和代谢途径关键酶等。

通过对这些基因的调控和突变，本文验证了建立的铜离子调控表达平台和新型插入突变方法的可靠性和有效性。

这些结果不仅为集胞藻的基因调控和基因工程研究提供了新的手段和平台，也为微生物治理和工业应用开发提供了新的思路和借鉴。

集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶假定底物的体外诱导表达及纯化

集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶假定底物的体外诱导表达及纯化秦春燕;陈谷【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2013(034)009【摘要】金属蛋白酶S2P同源蛋白在行光合作用的蓝藻中广泛存在.S2P蛋白酶通过在膜切割转录调控因子(anti-σ因子),释放σ因子来参与胁迫响应是跨膜信号转导的保守机制.集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶参与胁迫响应的跨膜信号转导,但其作用机理及底物均未明确.经过深入考察分析,实验锁定了4对σ因子和anti-σ因子的组合:SigE-ChlH(Slr1055)、SigI(Sl10687)-Sl10688、SigG(Slr1545)-Slr1546及SigH(Slr0856)-Sl10857.以pET-30b(+)为载体,通过重组表达纯化,成功获得一系列S2P假定底物的重组蛋白:全长anti-σ因子及截去羧基端部分序列的截短片段,包括Slr1055、Slr1055△(1～232)、Sl10688、Sll0688△(1～152)、Slr1546、Slr1546△(1～174)、Sl10857、Sl10857△(1～101)和大肠杆菌的S2P 底物RseA(1～148).为下一步在体外重构S2P蛋白酶与底物的酶切体系、阐释蓝藻体内S2P介导的级联信号转导机制奠定了基础.【总页数】7页(P114-120)【作者】秦春燕;陈谷【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640【正文语种】中文【中图分类】Q816【相关文献】1.绿色荧光蛋白标记S2P在集胞藻6803中的表达 [J], 陈谷;闻盼盼;秦春燕;王玉玲2.集胞藻PCC6803高产精氨酸藻株的紫外诱变选育 [J], 戢水玲;高宏3.基于代谢组学分析Slr0643蛋白在调控集胞藻PCC6803葡萄糖混养适应中的重要性 [J], 许白雪;陈谷;刘秤利;周健4.集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析 [J], 白福美;李至敏;王小琴;胡紫微;鲍玲玲;李志敏5.集胞藻PCC6803中基因slr0681功能初步研究 [J], 崔晓艳;钟轲;耿耘;宣宁;孙秀芹;牛旭东;康佳;陈高因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

集胞藻PCC 6803 类铁氧还蛋白Slr1205 的功能研究

生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第１期㊀６９~７８ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２０￣０７￣１０ꎻ接受日期:２０２０￣０８￣０３㊀联系方式:董杰Ｅ￣ｍａｉｌ:１１７８７８０３５６＠ｑｑ.ｃｏｍꎻ∗通信作者张芃芃Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｐｅｎｇｐｅｎｇ＠ｃａａｓ.ｃｎ集胞藻ＰＣＣ６８０３类铁氧还蛋白Ｓｌｒ１２０５的功能研究董杰ꎬ㊀张昊ꎬ㊀张芃芃∗中国农业科学院生物技术研究所ꎬ北京１０００８１摘㊀要:类铁氧还蛋白(ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ)在高等植物中具有调控叶绿体发育等多种重要的生理功能ꎬ但在蓝藻中的生物功能尚未被发现ꎮ通过比较集胞藻ＰＣＣ６０８３编码Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白基因的敲除突变株Δｓｌｒ１２０５与野生型(ＷＴ)在不同碳源和光周期条件下的生理生化表型ꎬ分析Ｓｌｒ１２０５在集胞藻中的功能ꎮ结果显示ꎬ在高ＣＯ２浓度自养㊁混合营养和光异养时ꎬΔｓｌｒ１２０５的生长速率低于ＷＴꎬ而在空气中自养条件下并无差异ꎮ与此相对应ꎬ混合营养和光异养时Δｓｌｒ１２０５比ＷＴ的呼吸速率低ꎬ与呼吸作用密切相关的ＮＤＨ￣１Ｌ复合体的含量少ꎮΔｓｌｒ１２０５在所有测试的条件下有较高的类胡萝卜素以及偏黄的表型ꎮ这些数据表明ꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白Ｓｌｒ１２０５的缺失造成在碳源充足条件下的生长速率下降ꎬ这可能是由于呼吸作用下调导致供能不足ꎮ研究结果为今后深入研究蓝藻Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白奠定了基础ꎬ为开展光合作用和呼吸作用的调节机制研究探索了新方向ꎮ关键词:集胞藻ＰＣＣ６８０３ꎻ类铁氧还蛋白ꎻ光合作用ꎻ呼吸作用ꎻＮＤＨ￣１Ｌ复合体ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２０.００８１中图分类号:Ｑ９４９.２２㊀㊀㊀文献标识码:ＡＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＳｔｕｄｙｏｎＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅＰｒｏｔｅｉｎＳｌｒ１２０５ｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ＤＯＮＧＪｉｅꎬＺＨＡＮＧＨａｏꎬＺＨＡＮＧＰｅｎｇｐｅｎｇ∗ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅ(Ｆｄ￣ｌｉｋｅ)ｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍａｎｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｓꎬｓｕｃｈａｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｉｎｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｈａｖｅｎｏｔｒｅｖｅａｌｅｄ.ＩｎｔｈｉｓｗｏｒｋꎬｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓＦｄ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＳｌｒ１２０５ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴｇｒｏｗｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｏｆΔｓｌｒ１２０５ｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅＷＴｕｎｄｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｈｉｇｈＣＯ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｕｔｏｔｒｏｐｈｙꎬｍｉｘｏｔｒｏｐｈｙａｎｄｐｈｏｔｏｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｙꎬｗｈｉｌｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒａｉｒ￣ｌｅｖｅｌＣＯ２ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｕｒｅｓ.ＩｎａｇｒｅｅｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｓｅꎬΔｓｌｒ１２０５ｃｅｌｌｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｒａｔｅａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＮＤＨ￣１Ｌｃｏｍｐｌｅｘꎬａｎｅｎｚｙｍｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｉｎｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ.ＩｎａｌｌｏｕｒｔｅｓｔｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬΔｓｌｒ１２０５ｈａｄｈｉｇｈｅｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｙｅｌｌｏｗｉｓｈｐｈｅｎｏｔｙｐｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｏＷＴ.ＴｈｅｓｅｄａｔａｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｌａｃｋｏｆＦｄ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＳｌｒ１２０５ｌｅｄｔｏｌｏｗｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｔａｄｅｑｕａｔｅｃａｒｂｏｎｓｕｐｐｌｙꎬｗｈｉｃｈｗａｓｐｒｏｂａｂｌｙｄｕｅｔｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｅｎｅｒｇｙｃａｕｓｅｄｂｙｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ.ＴｈｅｗｏｒｋｐｒｏｖｉｄｅｄｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌＦｄ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｂｕｔａｌｓｏａｎｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ꎻｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎻｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎻｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎꎻＮＤＨ￣１Ｌｃｏｍｐｌｅｘ㊀㊀蓝藻是结构最简单的放氧光合生物ꎬ是真核藻类和植物叶绿体的祖先[１]ꎬ因而作为光合作用研究的模式物种之一ꎬ集胞藻ＰＣＣ６８０３(Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３)是最早完成测序的光合生物[２]ꎮ它不仅能够利用空气中的二氧化碳自养生长ꎬ而且可以在添加外源葡萄糖时进行混合营养和异养生长ꎮ除了光合作用以外ꎬ蓝藻还可以利用呼吸作用的氧化磷酸化产生能量用于. All Rights Reserved.生命活动ꎮ蓝藻的呼吸作用主要是在黑暗中发挥功能ꎬ在蓝藻中ꎬＮＡＤ(Ｐ)Ｈ脱氢酶(ＮＤＨ￣１复合体)具有不同亚基组成形式ꎬ并参与多种生物功能ꎮ其中的ＮＤＨ￣１Ｌ与细胞呼吸直接相关ꎬ对Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３利用葡萄糖光异养生长至关重要[３]ꎬＮＤＨ￣１Ｍ和ＮＤＨ￣１Ｓ参与ＣＯ２的浓缩吸收ꎬ有研究发现ꎬＮＤＨ￣２在Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中对光合作用和呼吸作用起调节作用[４]ꎻ琥珀酸脱氢酶(ＳＤＨ)ꎬ即复合体Ⅱꎬ对蓝藻呼吸电子传递非常重要[５]ꎮ铁氧还蛋白(ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎꎬＦｄ)是广泛分布于细菌㊁藻类和高等植物中的小分子可溶性铁硫蛋白ꎬ其分子量约为１１ｋＤꎮＦｄ的铁硫中心为[２Ｆｅ￣２Ｓ]㊁[３Ｆｅ￣４Ｓ]和[４Ｆｅ￣４Ｓ]ꎬ可作为电子载体传递电子ꎮＦｄ与光合作用关系密切ꎬ它不仅通过与Ｆｄ￣ＮＡＤＰ＋氧化还原酶(ＦＮＲ)作用形成ＮＡＤＰＨ参与线性光合电子传递链ꎬ而且通过ＰＧＲ５￣ＰＧＲＬ１和ＮＤＨ复合体参与循环电子传递[６]ꎮ在细菌中ꎬＦｄ是固氮酶[７]㊁氢酶㊁丙酮酸￣Ｆｄ￣氧化还原酶[８]的电子供体ꎬ参与氮代谢㊁氢代谢和呼吸作用ꎮＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中有９个ｆｄ基因ꎬ分别编码９个不同的铁氧还蛋白ꎬ这９个Ｆｄ蛋白在集胞藻属(Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ)㊁鱼腥藻属(Ａｎａｂａｅｎａ)㊁柱胞藻属(Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ)㊁念珠藻属(Ｎｏｓｔｏｃ)等蓝藻中都是保守的[９]ꎮ其中Ｆｄ１蛋白在植物和藻类中含量丰富ꎬ是光合作用所必需的铁氧还蛋白ꎮＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３的ｆｄ１基因在葡萄糖存在下对细胞的生长也是至关重要的ꎬ在没有光合作用的情况下ꎬＦｄ１吸收葡萄糖的碳源ꎬ为藻株的细胞生长提供能量[１０]ꎮ与ｆｄ１类似ꎬｆｄ２㊁ｆｄ３㊁ｆｄ６和ｆｄ８基因编码的Ｆｄ蛋白对Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３的光合自养生长也是必不可少的[９]ꎬ而Ｆｄ４[１１]㊁Ｆｄ５[１２]㊁Ｆｄ７[１３]和Ｆｄ９对Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３的自养生长不是必需的ꎮＦｄ４和Ｆｄ５缺失对藻株的生长情况没有太大的影响ꎬＦｄ７和Ｆｄ９在耐氧化和金属胁迫中起着重要作用ꎬＦｄ７的[２Ｆｅ￣２Ｓ]中心在抵抗缺铁胁迫过程中至关重要[９]ꎮＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅ蛋白是与Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ蛋白序列的同源蛋白ꎬ它们通常具有小亚基或β￣亚基的组合型呼吸系统复合物的功能ꎬ例如大肠杆菌中的硝酸还原酶(ＮａｒＨ蛋白)㊁氢氧化酶￣２(ＨｙｂＡ)[１４]ꎬ还有一些在大肠杆菌中已知的Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白是特定的呼吸酶产生活性所必需的[１５]ꎮ在植物中ꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白的表达可以增强光合作用中碳的积累ꎬ有研究发现ꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白的表达能通过调节光合作用效率提高转基因水稻的产量[１６]ꎮ虽然已有研究对细菌和高等植物中Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白的功能有了一定的认识ꎬ但蓝藻中Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白的功能还完全未知ꎮ因此本研究选择Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中的Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白开展生理功能研究ꎬ期望通过构建编码Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白基因敲除突变株Δｓｌｒ１２０５ꎬ探索不同条件下Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白在光合作用和呼吸作用中的功能ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料和试剂１.１.１㊀实验材料㊀Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３葡萄糖耐受性藻株(ＷＴ)来自本实验室ꎮ免疫缺陷型大肠杆菌菌株Ｔｒａｎｓ５α购自北京全式金生物技术有限公司ꎬ用于质粒载体构建克隆ꎮ１.１.２㊀实验试剂㊀ＴＵＲＢＯＤＮＡ￣ｆｒｅｅＴＭＫｉｔꎬＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎬＴｒａｎｓＳｔａｒｔＴｏｐＧｒｅｅｎｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ㊁ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自全式金公司ꎬＱ５高保真ＤＮＡ聚合酶㊁限制性内切酶㊁Ｔ４连接酶购自ＮＥＢ公司ꎬＤＮＡ片段回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司ꎮＡｔｐＢ抗体购自Ａｇｒｉｓｅｒａ公司ꎬＮｄｈＫ抗体由上海师范大学马为民教授赠送ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀藻株培养㊀本实验参照Ｚｈａｎｇ等[３]的培养条件对藻株进行培养ꎮＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５是用液体或固体ＢＧ￣１１培养基在４１００Ｋ色温的ＬＥＤ光源下培养ꎮ本研究的标准培养条件为自养:３０ħ㊁５０μｍｏｌｐｈｏｔｏｎｓｍ－２ｓ－１光强的连续光照㊁空气水平的二氧化碳(ＬＣ)ꎬ对比条件有:高碳自养(３％二氧化碳ꎬＨＣ)㊁混合营养(＋５ｍｍｏｌＬ－１葡萄糖)㊁光异养(＋５ｍｍｏｌＬ－１葡萄糖和１０μｍｏｌＬ－１ＤＣＭＵ)㊁周期光(２ｈ光照２ｈ黑暗)ꎮ１.２.２㊀突变株的构建和蓝藻的转化筛选㊀将卡那霉素抗性基因编码区序列插入ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ０７生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.位点ꎬ构建克隆载体ｐＵＣ￣Ｋｎꎮ以Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ＷＴ的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ分别用ｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｕｐ￣Ｒ￣ＢａｍＨⅠ㊁ｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｕｐ￣Ｆ和ｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｄｏｗｎ￣Ｒ￣ＫｐｎⅠ㊁ｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｄｏｗｎ￣Ｆ￣ＫｐｎⅠ引物扩增ｓｌｒ１２０５的上游和下游序列并包含部分ｓｌｒ１２０５编码区(表１)ꎬ分别连入ｐＵＣ￣Ｋｎ中卡那霉素抗性基因的两侧ꎮ利用自然转化将构建好的载体导入Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ＷＴ中ꎬ在含有卡那霉素抗性的ＢＧ￣１１平板上挑取阳性单克隆ꎬ划线培养３代以上ꎬ通过ＰＣＲ验证转化子的基因型ꎮ表１㊀本研究所用引物Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙ用途作用引物名称引物序列(５ᶄ➝３ᶄ)突变株构建构建Δｓｌｒ１２０５载体的上臂构建Δｓｌｒ１２０５载体的下臂ｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｕｐ￣Ｒ￣ＢａｍＨⅠ５ᶄ￣ＣＧｇｇａｔｃｃＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＧＧＧＣＧＡ￣３ᶄｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｕｐ￣Ｆ５ᶄ￣ＧＴＣＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＴＣ￣３ᶄｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｄｏｗｎ￣Ｒ￣ＫｐｎⅠ５ᶄ￣ＧＧｇｇｔａｃｃＴＣＧＡＣＴＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧＴＣＴ￣３ᶄｐＵＣ￣ｓｌｒ１２０５￣ｄｏｗｎ￣Ｆ￣ＫｐｎⅠ５ᶄ￣ＧＧｇｇｔａｃｃＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＧＧＣＧＣ￣３ᶄ突变株整合验证检测Δｓｌｒ１２０５载体是否整合到ＷＴ中荧光定量Δｓｌｒ１２０５￣Ｒ５ᶄ￣ＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣ￣３ᶄΔｓｌｒ１２０５￣Ｆ５ᶄ￣ＧＧＧＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＣ￣３ᶄｒｎｐＢ￣Ｆ５ᶄ￣ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴ￣３ᶄｒｎｐＢ￣Ｒ５ᶄ￣ＧＧＣＧＴＴＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＴＴ￣３ᶄｓｓｌ００２０(ｆｄ１)￣ｑＲＴ￣ＰＣＲ￣Ｒ５ᶄ￣ＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＧＧＡＧＧ￣３ᶄｓｓｌ００２０(ｆｄ１)￣ｑＲＴ￣ＰＣＲ￣Ｆ５ᶄ￣ＣＴＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＡＴＴＣＣＴＧＣ￣３ᶄｓｌｒ１２０５￣ｑＲＴ￣ＰＣＲ￣Ｒ５ᶄ￣ＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＣＧＣＡＣＡＧ￣３ᶄｓｌｒ１２０５￣ｑＲＴ￣ＰＣＲ￣Ｆ５ᶄ￣ＡＧＴＣＧＴＣＡＡＧＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴ￣３ᶄ１.２.３㊀蓝藻总ＲＮＡ的提取和ｑ￣ＲＴ￣ＰＣＲ㊀收集２０ｍＬＯＤ７５０＝０.８~１时的藻细胞ꎬ利用Ｔｒｉｚｏｌ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)法提取总ＲＮＡꎬ经ＤＮａｓｅ(ＡｍｂｉｏｎＴｕｒｂｏＤＮａｓｅｋｉｔ)消化去除基因组ＤＮＡ[１７]ꎮ从纯化的２μｇ总ＲＮＡ合成首条单链ｃＤＮＡ(ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ)ꎮ特异扩增ｆｄ１和ｓｌｒ１２０５引物(表１)用于定量分析基因的转录水平ꎮ编码ＲＮＡ酶Ｐ的基因ｒｎｐＢ作为持家基因用于定量分析的内参ꎬ所有的扩增产物为１５０~２００ｂｐꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ使用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光定量试剂盒在ＡＢＩｌｉｆｅ荧光定量ＰＣＲ仪上进行ꎮ采用２－ΔＣｔ的算法计算基因的相对表达含量ꎮ１.２.４㊀光合和呼吸活性检测㊀用ＨａｎｓａｔｅｃｈＣｌｏｒｏｌａｂ２液相氧测定系统检测自养㊁混合营养和光异养的Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ藻细胞的饱和净光合活性和黑暗下的呼吸活性[１８]ꎮ藻细胞以叶绿素浓度１０μｇｍＬ－１重悬于新鲜的培养液中ꎬ在样品池中加入１ｍＬ细胞悬液进行测定ꎬ每个样品做３次生物学重复ꎮ１.２.５㊀叶绿素及类胡萝卜素含量测定㊀使用１００％的甲醇在黑暗中萃取Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ藻细胞或者类囊体膜中的脂溶性色素ꎬ离心去除碎片的上清在分光光度计中测定特定波长的吸光值ꎬ通过如下公式计算叶绿素ａ和类胡萝卜素浓度[１９]ꎮＣｈｌａ＝１２.６１ˑ(Ａ６６５－Ａ７５０)ˑｎＣａｒ＝[(Ａ４７０－Ａ７５０)ˑ１０００－２０.５６ˑ(Ａ６６５－Ａ７５０)]/２２１ˑｎ其中ꎬＣｈｌａ为叶绿素ａ的浓度ꎬＣａｒ为类胡萝卜素的浓度ꎬ单位为μｇｍＬ－１ꎻＡ６６５为６６５ｎｍ处的吸光值ꎬＡ７５０为７５０ｎｍ处的吸光值ꎬＡ４７０为４７０ｎｍ处的吸光值ꎮ１.２.６㊀膜蛋白分离㊀类囊体膜蛋白样品的分离方法参照Ｚｈａｎｇ等[３]的方法ꎮ所有步骤均在４ħ下避光进行ꎮ简要的过程为:收集ＯＤ７５０为０.５~１.０的藻细胞ꎬ采用玻璃珠法进行细胞破碎ꎬ低速离心去除玻璃珠和细胞碎片ꎬ上清液经过高速离心沉淀类囊体膜ꎮ对重悬的膜蛋白样品测定蛋白质浓度和叶绿素浓度ꎮ１.２.７㊀蛋白电泳与免疫印迹㊀实验步骤参考Ｔｙｙｓｔｊäｒｖｉ等[２０]的方法ꎬ变性蛋白样品(５μｇ蛋白)采用含有６ｍｏｌＬ－１尿素的浓度为１２％的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分离ꎬ并通过银染显色[２１]或者通过ＮｄｈＫ和ＡｔｐＢ特异性抗体免疫检测ꎮ膜蛋白复１７董杰ꎬ等:集胞藻ＰＣＣ６８０３类铁氧还蛋白Ｓｌｒ１２０５的功能研究. All Rights Reserved.合体通过４.５％~１２％的蓝绿胶电泳(ＢＮ￣ＰＡＧＥ)分离ꎬ上样量为２μｇ叶绿素ꎬ通过ＮｄｈＫ特异性抗体免疫检测ꎮ１.２.８㊀生物信息学分析㊀在ＵｎｉＰｒｏｔ网站(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)检索Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中编码Ｆｄ蛋白的基因并获取氨基酸序列ꎬ通过ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)的比对工具ＢＬＡＳＴ(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)查找Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中与Ｆｄ１氨基酸序列同源的蛋白序列ꎬ并用ＭＥＧＡ６构建Ｆｄ１￣９和与Ｆｄ１同源性高的蛋白序列的进化树ꎬ在ＣｙａｎｏＥｘｐｒｅｓｓ网站(ｈｔｔｐ://ｃｙａｎｏｅｘｐｒｅｓｓ.ｓｙｓｂｉｏｌａｂ.ｅｕ/)提供的Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３基因表达数据库中检索ｓｌｒ１２０５和ｆｄ１基因在不同实验条件下的转录情况ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀集胞藻编码Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白基因的确定通过ＵｎｉＰｒｏｔ网站检索和序列比对ꎬ我们确定了Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中的ｓｌｒ１２０５基因编码Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白ꎮ除此之外ꎬ序列比对结果显示Ｓｓｌ３０４４和Ｓｓｒ１０４１与Ｆｄ１的同源性较高ꎬ从进化树结果来看ꎬＳｌｒ１２０５与Ｆｄ８和Ｆｄ９的序列相似性较高ꎬＳｓｒ１０４１和Ｓｓｌ３０４４与Ｆｄ５的序列相似程度最高(图１)ꎬＳｓｌ３０４４和Ｓｓｒ１０４１注释显示与氢化酶有关ꎬ而氢化酶与呼吸作用密切相关ꎬ因此猜测注:集胞藻６８０３Ｆｄ家族蛋白的进化树通过ＭＥＧＡ６.１进行构建ꎬＲｕｂａ为集胞藻６８０３红素氧还蛋白(Ｓｌｒ２０３３)ꎬ这里作为外群ꎮＦｌｄａ为集胞藻６８０３黄素氧还蛋白(Ｓｌｒ０２４８)ꎮ图１㊀集胞藻ＰＣＣ６８０３Ｆｄ家族蛋白的进化树分析Ｆｉｇ.１㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓＰＣＣ６８０３ＦｄｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白可能参与Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３的氢代谢和呼吸作用ꎬ本文将探索Ｓｌｒ１２０５在Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中的生物功能ꎮ２.２㊀突变株鉴定通过ＰＣＲ对突变藻株的基因型进行鉴定ꎬ用Δｓｌｒ１２０５对应的鉴定引物Δｓｌｒ１２０５￣Ｒ和Δｓｌｒ１２０５￣Ｆ分别扩增Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ的总ＤＮＡꎬ结果显示ꎬΔｓｌｒ１２０５只扩增出１条约为１.９ｋｂ的条带ꎬ对应的ＷＴ条带约为１.３ｋｂ(图２)ꎬ说明突变株的ｓｌｒ１２０５基因已被敲除ꎮ注:Ｍ为ＤＮＡ分子量标准ꎬ左侧数值显示各条带的大小ꎮ图２㊀突变株的鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｎｔ２.３㊀突变株和ＷＴ中ｆｄ１、ｓｌｒ１２０５基因的转录水平通过ｑＰＣＲ检测ｆｄ１㊁ｓｌｒ１２０５基因在ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５中的转录本ꎬ它们相对于内参基因ｒｎｐＢ的表达量见图３Ａꎮ在ＷＴ中ꎬｆｄ１转录本的含量比ｓｌｒ１２０５高很多ꎬ约是后者的１１倍ꎮ而且ꎬＫｎ基因在Δｓｌｒ１２０５中的表达量比ｓｌｒ１２０５基因在ＷＴ中的表达量低(图３Ｂ㊁Ｄ)ꎬ所以Ｋｎ基因对突变株生长无显著影响ꎬ我们认为突变株的表型变化与Ｋｎ基因无关ꎮｆｄ１的转录本在Δｓｌｒ１２０５中的含量比在ＷＴ中低(图３Ｃ)ꎮｓｌｒ１２０５的转录本在Δｓｌｒ１２０５中几乎检测不到(图３Ｄ)ꎬ这也说明突变株已完全敲除了ｓｌｒ１２０５基因ꎮ２.４㊀突变株表型的探索为了确定初步摸索测试的条件ꎬ在ＣｙａｎｏＥｘｐｒｅｓｓ网站(ｈｔｔｐ://ｃｙａｎｏｅｘｐｒｅｓｓ.ｓｙｓｂｉｏｌａｂ.ｅｕ/)对ｓｌｒ１２０５基因表达情况进行了分析ꎮ由于ｆｄ１基因在Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中是必不可２７生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｆｄ１㊁ｓｌｒ１２０５在ＷＴ中相对于内参基因ｒｎｐＢ的表达量ꎻＢ:Ｋｎ基因在ＷＴ㊁Δｓｌｒ１２０５中的相对表达量ꎻＣ:ｆｄ１基因在ＷＴ㊁Δｓｌｒ１２０５中的相对表达量ꎻＤ:ｓｌｒ１２０５基因在ＷＴ㊁Δｓｌｒ１２０５中的相对表达量ꎮ图３㊀Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ中ｆｄ１、ｓｌｒ１２０５基因的转录水平Ｆｉｇ.３㊀Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｆｄ１ａｎｄｓｌｒ１２０５ｇｅｎｅｓｉｎΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴ少的ꎬ所以我们以ｆｄ１基因做对照ꎬ引入表达分析(表２)ꎮ数据显示了不同条件下集胞藻ＰＣＣ６８０３ＷＴ中基因在ＲＮＡ水平的表达变化ꎬ数据库中包括了ＲＮＡ￣Ｓｅｑ和基因芯片的测试结果ꎮ相对于ｆｄ１㊁ｓｌｒ１２０５在低温㊁缺铁以及缺少无机元素碳㊁氮㊁磷时表达上调ꎬ根据实验室条件首先选择了不同浓度二氧化碳条件进行测试ꎬ观察突变株的生长表型ꎮ表２㊀基因在不同胁迫条件下的表达情况Ｔａｂｌｅ２㊀Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ胁迫条件ｆｄ１ｓｌｒ１２０５ｓｌｒ１２０５/ｆｄ１低温胁迫(１５ħ)－１.４７８３８９０.５９１３２１２.０６９７１铁限制－１.５９１１１７０.０７２８２２１.６６３９３９强光０.４１３５７１－０.０４６５３５－０.４６０１１黑暗－８.２８３７６７－１１.６６４－３.３８０２３热胁迫(４２ħ)－４.０７７９５８－４.６０８７２－０.５３０７６静止期－２.９７５３６８－２.４７１７１０.５０３６５８缺Ｃ－３.０６１６３３－１.０１０２６２２.０５１３７１缺Ｐ－０.９０５３７１－０.３４０９４８０.５６４４２３缺Ｎ－１.６０９４－０.０８９９１.５１９５㊀注:数字表示ＲＮＡ水平表达的变化倍数ꎬ以ｌｏｇ２表示ꎮ３７董杰ꎬ等:集胞藻ＰＣＣ６８０３类铁氧还蛋白Ｓｌｒ１２０５的功能研究. All Rights Reserved.２.５㊀不同二氧化碳浓度条件下突变株和ＷＴ的自养生长情况分别在空气水平ＣＯ２(ＬＣ)浓度和高ＣＯ２(ＨＣ)浓度的培养箱中培养ＷＴ和突变株ꎬ温度㊁光照强度㊁光照时间等其他条件均为正常培养条件ꎮ通过藻液的光密度生长曲线发现:在ＨＣ条件下培养时ꎬΔｓｌｒ１２０５比ＷＴ生长缓慢ꎻ而ＬＣ条件下培养时ꎬＷＴ和Δｓｌｒ１２０５生长速度基本没有区别ꎮ两种条件下Δｓｌｒ１２０５的藻液颜色比ＷＴ的偏黄(图４)ꎬ实验重复３次ꎬ趋势相同ꎮ２.６㊀不同营养条件下突变株和ＷＴ的生长情况如图５所示ꎬ先采用连续光照ꎬ分别用无添加(自养)㊁添加葡萄糖(＋Ｇꎬ混合营养)㊁添加葡萄糖和ＤＣＭＵ(＋Ｇ＋ＤＣＭＵꎬ光异养)的ＢＧ￣１１培养基培养ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５ꎬ对比生长情况发现:混合营养和光异养条件下Δｓｌｒ１２０５生长速率比ＷＴ慢ꎬ特别是光异养条件下的表型更明显ꎮ如图６所示ꎬ在周期光条件下突变株和ＷＴ在３种营养状态下的生长表型与连续光照下相似ꎬ只是突变株与ＷＴ的差异更大ꎮ所有培养条件下ꎬ突变株藻液均比ＷＴ偏黄ꎮ实验重复了３次ꎬ趋势相同ꎮ２.７㊀突变株的光合作用和呼吸作用活性由于突变株的生长速率发生了变化ꎬ我们测定了自养㊁混合营养和光异养条件下培养的藻细胞的净光合作用和呼吸作用活性(表３)ꎬ结果表明:自养条件下Δｓｌｒ１２０５的净光合和呼吸活性与ＷＴ相差不多ꎬ而混合营养条件下突变株的相应速率都明显低于ＷＴꎻ光异养条件下Δｓｌｒ１２０５的呼吸活性也低于ＷＴꎮ图４㊀Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ在不同浓度二氧化碳条件下的生长情况Ｆｉｇ.４㊀ＧｒｏｗｔｈｏｆΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴｃｕｌｔｕｒｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣＯ２ｌｅｖｅｌ图５㊀连续光照下Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ在补充有机碳源条件下的生长情况Ｆｉｇ.５㊀ＧｒｏｗｔｈｏｆΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｓｕｐｐｌｙｕｎｄｅｒｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｉｇｈｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ４７生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀周期光下Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ在补充有机碳源条件下的生长情况Ｆｉｇ.６㊀ＧｒｏｗｔｈｏｆΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｓｕｐｐｌｙｕｎｄｅｒｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ２.８㊀突变株类胡萝卜素和叶绿素的含量由于在各种培养条件下Δｓｌｒ１２０５藻液的颜色均比ＷＴ偏黄ꎬ我们测定了自养㊁混合营养和光异养生长的ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５藻细胞中类胡萝卜素和叶绿素的浓度ꎬ并计算类胡萝卜素与叶绿素浓度的比值(表４)ꎮ结果显示ꎬ３种营养条件生长的Δｓｌｒ１２０５的类胡萝卜素的相对含量均比ＷＴ有明显升高ꎮ２.９㊀突变株类囊体膜上主要光合蛋白的积累情况由于突变株Δｓｌｒ１２０５的光合和呼吸活性发表３㊀Δｓｌｒ１２０５和ＷＴ细胞的净光合和呼吸活性Ｔａｂｌｅ３㊀ＮｅｔｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆΔｓｌｒ１２０５ａｎｄＷＴｃｅｌｌｓ/(μｍｏｌＯ２ｍｇ－１Ｃｈｌｈ－１)培养条件ＷＴΔｓｌｒ１２０５净光合作用自养４２８ʃ８３８４ʃ５混合营养４２７ʃ１２２９４ʃ１０呼吸作用自养１５ʃ２１６ʃ２混合营养８７ʃ２７４ʃ４异养７８ʃ１６８ʃ２表４㊀不同条件下培养的藻细胞类胡萝卜素/叶绿素的相对含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ/ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｇｒｏｗｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ藻株－Ｇ＋Ｇ＋Ｇ＋ＤＣＭＵＷＴ０.３３０.３８０.５８Δｓｌｒ１２０５０.３８０.４９０.７０生了明显变化ꎬ我们通过ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等生物化学方法对突变株和ＷＴ在自养㊁混合营养和光异养条件下类囊体膜蛋白的积累情况进行分析ꎮ从银染的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ胶图(图７)来看ꎬ分别比较３种营养条件下培养的突变株和ＷＴꎬ高丰度膜蛋白的表达并无明显差异ꎮ利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＮＤＨ￣１复合体的表达情况发现:在自养条件下ꎬ突变株中ＮｄｈＫ的含量与ＷＴ基本相同ꎬ而在混合营养和光异养条件下的含量则明显少于ＷＴ(图７)ꎬ这与Δｓｌｒ１２０５的呼吸活性(表３)和生长速率(图５)都低于ＷＴ是一致的ꎮＡＴＰ合成酶蛋白亚基ＡｔｐＢ作为Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的内参ꎬ突变株和ＷＴ之间无明显差异ꎮ２.１０㊀突变株和ＷＴ不同类型ＮＤＨ￣１复合体的积累情况图７显示ꎬΔｓｌｒ１２０５在混合营养和光异养条件下的ＮｄｈＫ蛋白明显减少ꎮ由于蓝藻具有多种不同形式和功能的ＮＤＨ￣１复合体ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ无法区分它们ꎬ因此ꎬ我们采用ＢＮ￣ＰＡＧＥ结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ进一步分析不同形式的ＮＤＨ￣１复合体在ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５中的积累情况ꎮ结果表明ꎬ在自养条件下ꎬ参与ＣＯ２吸收的ＮＤＨ￣１Ｍ含量较多ꎬＮＤＨ￣１Ｌ较少ꎬ突变株与ＷＴ之间并没有明显差异ꎮ在光异养条件下(＋Ｇ＋ＤＣＭＵ)ꎬＮＤＨ￣１Ｌ是主要的ＮＤＨ￣１复合体形式ꎬ二氧化碳的吸收被抑制ꎬＮＤＨ￣１Ｍ仅有极少量ꎮ混合营养条件下这两种ＮＤＨ￣１复合体的含量介于自养和光异养之间ꎮ在含有葡萄糖时ꎬΔｓｌｒ１２０５中的ＮＤＨ￣１Ｌ复５７董杰ꎬ等:集胞藻ＰＣＣ６８０３类铁氧还蛋白Ｓｌｒ１２０５的功能研究. All Rights Reserved.合体的含量明显比ＷＴ少(图８)ꎬ这与ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ的Ｗｅｓｔｅｒｎ￣ｂｌｏｔ(图７)结果是一致的ꎮＮＤＨ￣１Ｌ注:采用１２％含有６ｍｏｌＬ－１尿素的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分离类囊体膜蛋白样品ꎬ每条泳道的上样量为５μｇ蛋白ꎬ图片自上而下分别为银染的ＰＡＧＥ胶㊁ＡｔｐＢ和ＮｄｈＫ特异性抗体的免疫印迹ꎮ图７㊀ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５在自养㊁混合营养和光异养条件下类囊体膜蛋白的积累Ｆｉｇ.７㊀ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅＷＴａｎｄΔｓｌｒ１２０５ｇｒｏｗｎｕｎｄｅｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃꎬｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃａｎｄｐｈｏｔｏｈｅｒｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ参与蓝藻的呼吸作用ꎬ这也解释了为何在含Ｇ条件下Δｓｌｒ１２０５的呼吸活性比ＷＴ低ꎮ较低的呼吸活性很可能是Δｓｌｒ１２０５的生长速率比ＷＴ慢的主要原因之一ꎮ３㊀讨论通过观察在多种培养条件下的ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５的生长情况ꎬ我们发现在添加Ｇ和Ｇ＋ＤＣＭＵ的ＢＧ￣１１培养基和高二氧化碳条件下培养的Δｓｌｒ１２０５的生长速率均比ＷＴ慢ꎬ二氧化碳是蓝藻光合自养的无机碳源ꎬ而葡萄糖是有机碳源ꎮ在碳源充足时ꎬ蓝藻的生长速率也会随之增加ꎬ但突变株的增幅却小于ＷＴꎬ我们将对产生这一现象的可能原因进行分析ꎮ３.１㊀Ｓｌｒ１２０５蛋白影响藻株的生长速率在本研究构建的Δｓｌｒ１２０５中几乎检测不到ｓｌｒ１２０５基因的ｍＲＮＡꎬ说明该藻株是完全敲除突变株ꎬ适宜用于Ｓｌｒ１２０５蛋白功能的研究ꎮ从ＷＴ中ｆｄ１和ｓｌｒ１２０５的转录情况发现ꎬｓｌｒ１２０５基因的转录水平比ｆｄ１低ꎬ约是ｆｄ１的１４％ꎮ通过ｑＰＣＲ的鉴定ꎬ我们发现ｆｄ１基因在Δｓｌｒ１２０５中的转录水平有所下降ꎬＦｄ１蛋白是蓝藻进行光合作用所必需的蛋白ꎬ参与光合线性电子传递最后一步还原力ＮＡＤＰＨ的产生ꎮ它的表达量降低ꎬ可能直接影响了Δｓｌｒ１２０５中ＮＡＤＰＨ的合成ꎬ进而影响藻株的合成代谢速率ꎮΔｓｌｒ１２０５中ｆｄ１基因下调可能是其生长速率降低的直接原因ꎮ类胡萝卜素具有抗氧化作用ꎬ参与光合系统的保护功能[２２]ꎮＡ:ＢＮ胶ꎻＢ:ＮｄｈＫ抗体的免疫印迹ꎮ类囊体膜蛋白样品采用ＢＮ￣ＰＡＧＥ分离ꎬ每条泳道的上样量为２μｇ叶绿素ꎮ图８㊀ＷＴ和Δｓｌｒ１２０５在不同营养条件下的类囊体膜蛋白复合体Ｆｉｇ.８㊀ＴｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓｏｆＷＴａｎｄΔｓｌｒ１２０５ｇｒｏｗｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ６７生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.突变株中的类胡萝卜素上升可能是其应对光合活性改变的一种补偿机制ꎮ３.２㊀Ｓｌｒ１２０５蛋白影响藻株对碳元素的利用本研究数据表明ꎬ无论是添加无机碳源ＣＯ２(ＨＣ自养)还是添加有机碳源葡萄糖(混合营养和光异养)ꎬΔｓｌｒ１２０５均比ＷＴ生长慢ꎮ无机碳源是光合作用的底物ꎬ有机碳源葡萄糖是呼吸作用的底物ꎮΔｓｌｒ１２０５在混合营养条件下的净光合速率和呼吸速率都明显低于ＷＴꎬ说明敲除ｓｌｒ１２０５同时改变了藻株的光合作用和呼吸作用活性ꎬ这可能是突变株不能有效地利用碳源的原因之一ꎮ３.３㊀Ｓｌｒ１２０５蛋白与藻株的呼吸作用有关光合作用的光合磷酸化和呼吸作用的氧化磷酸化是光合生物两大重要产能途径ꎮ在光异养条件下ꎬ产能途径只有光合循环电子传递和呼吸作用ꎬΔｓｌｒ１２０５的生长速率仍然比ＷＴ慢ꎬ这说明光合线性电子传递不是影响突变株生长的主要因素ꎮ在培养条件中进一步加入黑暗周期ꎬΔｓｌｒ１２０５与ＷＴ生长速率差异加大ꎮ由于黑暗下的产能途径仅有呼吸作用ꎬ因此我们认为呼吸作用可能是导致Δｓｌｒ１２０５生长缓慢的主要原因ꎮ蓝藻的ＮＤＨ￣１复合体参与细胞呼吸ꎬ其中的ＮＤＨ￣１Ｌ复合体对于Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３以葡萄糖为碳源的光异养生长至关重要[３]ꎮ在混合营养和光异养条件下ꎬΔｓｌｒ１２０５中的ＮＤＨ￣１Ｌ复合体含量明显减少ꎬ这与Δｓｌｒ１２０５的呼吸速率更低是一致的ꎬ说明Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白Ｓｌｒ１２０５对呼吸作用活性具有正调控作用ꎮ有些非光合细菌的Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白直接参与了呼吸作用[１５]ꎬ本研究结果证明ꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白的这方面功能在蓝藻中也是保守的ꎮ综上研究ꎬ我们发现Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３中的Ｆｄ￣ｌｉｋｅ蛋白Ｓｌｒ１２０５通过调控Ｆｄ１的表达量ꎬ保证了蓝藻中ＮＡＤＰＨ正常合成ꎬ从而使得光合作用线性电子传递链正常进行和生物合成代谢所需还原力的积累ꎮ同时ꎬ通过调节呼吸电子传递链中的重要复合体ＮＤＨ￣１Ｌ参与呼吸作用ꎬ从而平衡蓝藻中的能量代谢ꎮ总之ꎬＦｄ￣ｌｉｋｅ蛋白Ｓｌｒ１２０５主要通过调控呼吸作用维持Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３能量代谢平衡ꎬ同时也通过调节Ｆｄ１和类胡萝卜素含量影响藻株的光合作用和抗胁迫能力ꎬ起到优化光合作用的功能ꎬ具体的作用机理还需要进一步深入研究ꎮ本研究的发现表明ꎬ平衡光合作用和呼吸作用活性有望作为光合生物增产抗逆的途径之一ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＳＣＨＯＰＦＪＷꎬＷＡＬＴＥＲＭＲ.ＯｒｉｇｉｎａｎｄＥａｒｌｙＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ:ｔｈｅＧｅｏｌｏｇｉｃａｌＥｖｉｄｅｎｃｅ.ＩｎＴｈｅＢｉｏｌｏｇｙｏｆＣｙａ￣ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ[Ｍ].ＯｘｆｏｒｄꎬＵＫ:ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒꎬ１９８２ꎬ５４３－５６４.[２]㊀ＴＡＫＡＫＡＺＵＫꎬＳＨＵＳＥＩＳꎬＨＩＲＯＫＡＺＵＫꎬｅｔａｌ..ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅｎｎｉｃｅｌｌｕｌａｒｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＳｙｎｅ￣ｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ｓｔｒａｉｎＰＣＣ６８０３.ＩＩ.Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅｇｅｎｏｍｅａｎｄａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｏｆｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ(Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ)[Ｊ].ＤＮＡＲｅｓ.ꎬ１９９６ꎬ３(３):１８５－２０９.[３]㊀ＺＨＡＮＧＰꎬＢＡＴＴＣＨＩＫＯＶＡＮꎬＪＡＮＳＥＮＴꎬｅｔａｌ..ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔＮＤＨ￣１ｃｏｍ￣ｐｌｅｘｅｓａｎｄｔｈｅｃａｒｂｏｎａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘＮｄｈＤ３/ＮｄｈＦ３/Ｃｕ￣ｐＡ/Ｓｌｌ１７３５ｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００４ꎬ１６(１２):３３２６－３３４０.[４]㊀ＨＯＷＩＴＴＣＡꎬＵＤＡＬＬＰＫꎬＶＥＲＭＡＡＳＷＦＪ.Ｔｙｐｅ２ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｉｎｔｈｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ｓｔｒａｉｎＰＣＣ６８０３ａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｒａｔｈｅｒｔｈａｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.ꎬ１９９９ꎬ１８１(１３):３９９４－４００３. [５]㊀ＣＯＯＬＥＹＪＷꎬＶＥＲＭＡＡＳＷＦ.ＳｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｏｔｈｅｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｓｉｎｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｏｆＳｙｎｅｃｈｏ￣ｃｙｓｔｉｓｓｐ.ｓｔｒａｉｎＰＣＣ６８０３:ｃａｐａｃｉｔｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓａｎｄｐｈｙｓｉｏ￣ｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.ꎬ２００１ꎬ１８３(１４):４２５１－４２５８.[６]㊀ＮＯＭＭＥＪꎬＦＡＮＮＩＮＧＡＳꎬＣＡＦＦＲＥＹＭꎬｅｔａｌ..ＴｈｅＳｒｃｈｏ￣ｍｏｌｏｇｙ３ｄｏｍａｉｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｊｕｎｃｔｉｏｎａｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｔｈｉｒｄＰＤＺｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＺＯ￣１[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１１ꎬ２８６(５０):４３３５２－４３３６０. [７]㊀ＳＣＨＲＡＵＴＥＭＥＩＥＲＢꎬＢÖＨＭＥＨ.ＡｄｉｓｔｉｎｃｔｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｆｏｒｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｈｅｔｅｒｏｃｙｓｔｓｏｆｔｈｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＡｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ[Ｊ].ＦＥＢＳＬｅｔｔ.ꎬ１９８５ꎬ１８４(２):３０４－３０８.[８]㊀ＶＯＲＰＨＡＬＡꎬＭＡＲÍＡＡꎬＢＲＵＮＡＣꎬｅｔａｌ..ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎＮＡＤＰ(Ｈ)ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃ￣ｔａｓｅｆｒｏｍＧｒａｃｉｌａｒｉａｃｈｉｌｅｎｓｉｓａｎｄｉｔｓｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ[Ｊ/ＯＬ].Ｂｉｏｌ.Ｒｅｓ.ꎬ２０１７ꎬ５０(１):３９[２０２１－０１－０６].ｈｔ￣ｔｐ://ｏｒｇ.ｄｏｉ/１０.１１１１/ｊ.１３６５－３１３Ｘ.２００４.０２３０２.ｘ. [９]㊀ＣＡＳＳＩＥＲ￣ＣＨＡＵＶＡＴＣꎬＣＨＡＵＶＡＴＦ.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｓｉｎｔｈｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍꎬＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓＰＣＣ６８０３:ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓ[Ｊ].Ｌｉｆｅ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０１４ꎬ４(４):６６６－６８０.[１０]㊀ＰＯＮＣＥＬＥＴＭꎬＣＡＳＳＩＥＲ￣ＣＨＡＵＶＡＴＣꎬＬＥＳＣＨＥＬＬＥＸꎬｅｔａｌ..Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌ(２Ｆｅ￣２Ｓ)ｐｌａｎｔ￣ｌｉｋｅｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓＰＣＣ６８０３ｂｙｐｌａｓｍｉｄｓｈｕｆｆｌｉｎｇ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ１９９８ꎬ２８(４):８１３－８２１.[１１]㊀ＧＵＴＥＫＵＮＳＴＫꎬＣＨＥＮＸꎬＳＣＨＲＥＩＢＥＲＫꎬｅｔａｌ..ＴｈｅＢｉｄｉ￣ｒｅｃｔｉｏｎａｌＮｉＦｅ￣ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３ｉｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙｆｌａｖｏｄｏｘｉｎａｎｄｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎａｎｄｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｕｎｄｅｒ７７董杰ꎬ等:集胞藻ＰＣＣ６８０３类铁氧还蛋白Ｓｌｒ１２０５的功能研究. All Rights Reserved.ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃꎬｎｉｔｒａｔｅ￣ｌｉｍｉｔｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１４ꎬ２８９(４):１９３０－１９３７.[１２]㊀ＭＵＳＴＩＬＡＨꎬＡＬＬＡＨＶＥＲＤＩＹＥＶＡＹꎬＩＳＯＪÄＲＶＩＪꎬｅｔａｌ..Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌ￣ｔｙｐｅ[４Ｆｅ￣４Ｓ]ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ７ｈａｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎｕｎｄｅｒｐｈｏｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３[Ｊ].ＢＢＡ￣Ｂｉｏｅｎ￣ｅｒｇ.ꎬ２０１４ꎬ１８３７(８):１２９３－１３０４.[１３]㊀ＭＡＲＴＥＹＮＢꎬＤＯＭＡＩＮＦꎬＬＥＧＲＡＩＮＰꎬｅｔａｌ..Ｔｈｅｔｈｉｏｒｅ￣ｄｏｘｉｎｒｅｄｕｃｔａｓｅ￣ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎｓ￣ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｃｒｏｓｓｒｏａｄｐａｔｈｗａｙｆｏｒｓｅｌｅｎａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓＰＣＣ６８０３[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｍｉｃｒｏ￣ｂｉｏｌ.ꎬ２００９ꎬ７１(２):５２０－５３２.[１４]㊀ＭＡＩＥＲＴꎬＢＩＮＤＥＲＵꎬＢÖＣＫＡ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｈｙｄＡｌｏｃｕｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ:ｔｗｏｇｅｎｅｓ(ｈｙｄＮａｎｄｈｙｐＦ)ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｆｏｒｍａｔｅａｎｄｈｙｄｒｏｇｅｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].Ａｒｃｈ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ１９９６ꎬ１６５(５):３３３－３４１.[１５]㊀ＮＩＬＡＶＯＮＧＳＥＡꎬＢＲＯＮＤＩＪＫＴＨＣꎬＯＶＥＲＴＯＮＴＷꎬｅｔａｌ..ＴｈｅＮａｐＦｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｎｉ￣ｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｓｙｓｔｅｍ:ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｏｆａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔꎬＮａｐＡ[Ｊ].Ｍｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ１５２(１１):３２２７－３２３７.[１６]㊀ＣＨＡＮＧＨꎬＨＵＡＮＧＨＥꎬＣＨＥＮＧＣＦꎬｅｔａｌ..Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｌａｎｔｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ(ｐｆｌｐ)ｅｎｈａｎｃｅｓｃａｐａｃｉｔｙｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃａｒｂｏｎａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)[Ｊ].Ｔｒａｎｓｇ.Ｒｅｓ.ꎬ２０１７ꎬ２６(２):２７９－２８９. [１７]㊀ＺＨＡＮＧＰꎬＳＩＣＯＲＡＣＩꎬＶＯＲＯＮＴＳＯＶＡＮꎬｅｔａｌ..ＦｔｓＨｐｒｏ￣ｔｅａｓｅｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２００７ꎬ６５(３):７２８－７４０.[１８]㊀ＪＩＡＸＨꎬＺＨＡＮＧＰＰꎬＳＨＩＤＪꎬｅｔａｌ..ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｐｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＡｎａｂａｅｎａｓｐ.ＰＣＣ７１２０ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｙｃｌｉｃｅｌｅｃｔｒｏｎｆｌｏｗａｒｏｕｎｄｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｓｔｏｅｎ￣ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｉｎｔｅｇｒ.ＰｌａｎｔＢｉｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ５７(５):４６８－４７６.[１９]㊀ＬＩＣＨＴＥＮＴＨＡＬＥＲＨＫ.Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｓａｎｄｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ:ｐｉｇｍｅｎｔｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙ￣ｍｏｌ.ꎬ１９８７ꎬ１４８:３５０－３８２.[２０]㊀ＴＹＹＳＴＪÄＲＶＩＴꎬＴＵＯＭＩＮＥＮＩꎬＨＥＲＲＡＮＥＮＭꎬｅｔａｌ..ＡｃｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｐｓｂＡｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｐｈｏｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｎＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ.ＰＣＣ６８０３[Ｊ].ＦＥＢＳＬｅｔｔ.ꎬ２００２ꎬ５１６(１－３):１６７－１７１.[２１]㊀ＢＬＵＭＨꎬＢＥＩＥＲＨꎬＧＲＯＳＳＪＨ.ＩｍｐｒｏｖｅｄｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＲＮＡａｎｄＤＮＡｉｎｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｓ[Ｊ].Ｅ￣ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬ１９８７ꎬ８:９３－９９.[２２]㊀ＤＥＭＭＩＧＢꎬＡＤＡＭＳＺＷ.Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｃｙｃｌｅｃａｒｏｔ￣ｅｎｏｉｄｓｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ.ꎬ１９９６ꎬ１(１):２１－２６.８７生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

S2P蛋白酶在集胞藻PCC6803胁迫响应中的功能

S2P蛋白酶在集胞藻PCC6803胁迫响应中的功能集胞藻作为地球上最古老的能进行光合自养的原核生物，在长期遗传和进化过程中，对外界环境产生了广泛的适应性，因此近年来成为研究胁迫响应的模式生物。

过去的研究表明，集胞藻响应变化的环境条件是通过上调或下调一系列功能基因的表达来实现的，但这些功能基因是如何被激活而引发调控的，至今还有很多谜团。

因此鉴定转录调控元件和响应胁迫的信号转导通路是揭示胁迫响应机制的关键。

之前的研究表明，二位蛋白酶(site-2-protease, S2P)介导的受控的膜内蛋白水解机制被认为是细菌逆境胁迫响应的重要信号转导途径。

集胞藻PCC6803中有四个S2P同源蛋白：Slr0643,Sll0862，Sll0528，Slr1821，但其功能未知。

为了揭示S2P蛋白酶在集胞藻PCC6803胁迫响应中的功能，本文开展了如下研究：1.通过基因组重测序，总结了集胞藻PCC6803野生型和△slr0643突变体与参考序列相同和差异的突变位点，分析了突变与表型之间的联系，探讨了不同种集胞藻的进化关系，证实了△slr0643突变体敲除成功。

2.通过表型分析，发现在光合自养条件下△slr0643突变体可以正常生长，但在2.5mM葡萄糖混合营养胁迫时突变体生长停滞。

进一步详尽的生理学分析发现，△slr0643突变体的各项生理生化指标与野生型相比均有明显差异。

以上结果提示slr0643在葡萄糖混养胁迫下具有重要功能。

3.利用转录组测序分析野生型和△slr0643突变体在光合自养和2.5mM葡萄糖混养胁迫下表达谱的变化，发现50%胁迫诱导的基因和67.9%胁迫抑制的基因是依赖于slr0643，这说明slr0643基因对于调节葡萄糖混养胁迫下基因的表达十分重要。

另外，△slr0643突变体中光合作用和呼吸作用下调，细胞分裂减少，胞内毒性增加可能是导致突变体在葡萄糖混养下生长停滞的主要原因。

4.为了进一步分析S2P在逆境胁迫响应中的功能，系统地考察了集胞藻PCC6803中4个S2P和细胞质外功能σ因子(Extracytoplasmic Function sigma factor，ECF σ因子)在各种胁迫条件下随时间推进的表达谱变化。

集胞藻pcc6803染色体上irelnes（issr1114slr0664i）ita系统的反馈..

孙亮华，刘帅兵，赵卫飞．集胞藻ＰＣＣ６８０３染色体上ｒｅｌＮＥｓ（ｓｓｒ１１１４／ｓｌｒ０６６４）ＴＡ系统的反馈调控作用［Ｊ］．江苏农业科学，２０１４，４２（９）：４０－４２．集胞藻ＰＣＣ６８０３染色体上ｒｅｌＮＥｓ（ｓｓｒ１１１４／ｓｌｒ０６６４）ＴＡ系统的反馈调控作用孙亮华，刘帅兵，赵卫飞（江苏大学环境与安全工程学院，江苏镇江２１２０１３）摘要：细菌染色体上的毒素－抗毒素（ｔｏｘｉｎ－ａｎｔｉｔｏｘｉｎ，ＴＡ）系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性，从而控制细胞的生长速度和死亡，使细菌适应各种环境胁迫。

为了证明集胞藻ＰＣＣ６８０３染色体上ｒｅｌＮＥｓＴＡ系统的转录调控，构建了以无启动子的β－半乳糖苷酶（ｌａｃＺ）基因为报告基因的重组质粒，并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β－半乳糖苷酶活性。

结果表明，抗毒素ＲｅｌＮ能显著抑制ｒｅｌＮＥｓ启动子的转录活性，而毒素ＲｅｌＥｓ能部分减弱这种抑制作用，提示ｒｅｌＮＥｓ系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。

关键词：集胞藻；染色体；毒素－抗毒素系统；ｒｅｌＮＥｓ；转录调控；转录融合重组质粒；β－半乳糖苷酶活性中图分类号：Ｑ７５６文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０１４）０９－００４０－０３收稿日期：２０１３－１２－０９基金项目：国家自然科学基金（编号：３０７７１１７６）。

作者简介：孙亮华（１９８７—），男，河南信阳人，硕士研究生，主要从事环境微生物（蓝藻）方面的研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｌｈｙｓｐａ＠１６３．ｃｏｍ。

通信作者：刘朝莹，博士，主要从事环境微生物学的教学研究工作。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｅｌｉｎｋａ＠１６３．ｃｏｍ。

毒素－抗毒素系统（ｔｏｘｉｎ－ａｎｔｉｔｏｘｉｎｓｙｓｔｅｍ，ＴＡ）由位于同一操纵子中的抗毒素基因和毒素基因构成，二者共同表达［１］。

其中抗毒素基因编码不稳定的抗毒素蛋白，毒素基因编码稳定的毒素蛋白；抗毒素基因编码的毒素蛋白可被依赖ＡＴＰ的蛋白酶降解成不稳定的抗毒素蛋白，与毒素蛋白相互作用形成ＴＡ复合体，可抑制毒素的细胞毒性。

集胞藻PCC6803高产精氨酸藻株的紫外诱变选育

集胞藻PCC6803高产精氨酸藻株的紫外诱变选育戢水玲;高宏【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2018(42)3【摘要】精氨酸在医药和食品工业上具有广泛用途.集胞藻PCC 6803是单细胞蓝藻, 能利用工业废气(主要成分是氮氧化物NOx)与水反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐合成氨基酸等化合物, 因而选育高产精氨酸藻株, 不仅能提高精氨酸产量, 而且能去除工业废气中的NOx, 具有潜在的应用前景.研究在集胞藻PCC 6803中利用紫外诱变, 筛选抗0.8 g/L D-精氨酸和抗0.2 g/L 6-氮尿嘧啶的突变株, 选育到了一株精氨酸产量显著提高的突变株#13807-111-55, 它每OD730值细胞的胞外精氨酸产量相比出发株提高了62.3倍, 达到(0.76±0.1) mg/(L·OD730),总精氨酸产量相比出发株提高了6.0倍, 达到(0.82±0.08) mg/(L·OD730).该突变株每OD730值细胞的胞外精氨酸产量明显高于胞内, 表明该突变藻株是精氨酸分泌型, 因而具有潜在的应用前景.%Arginine has been widely used in medicine and food industry.Synechocystis sp.PCC 6803,a unicellular cya-nobacterium, synthesize amino acids and other compounds using nitrate or nitrite as the nitrogen source. In flue gases released by industrial production,NOx(nitrogen oxides) can react with water to form nitrate and nitrite, which can be utilized by cyanobacteria.Hence,creating high arginine producing strain of Synechocystis sp.PCC 6803 has a strong application prospects, in denitrification of industrial flue gases. This study reported the successful creation of a high ar-ginine producing strain#13807-111-55 ofSynechocystis sp.PCC 6803 by 0.8 g/L D-arginine and 0.2 g/L 6-azaruacil resistant mutants with UV mutagenesis. Compared with the parent strain #13807, extracellular arginine production per OD730of #13807-111-55 increased 62.3-fold, reaching (0.76±0.1) mg/(L·OD730). Total arginine production per OD730 of #13807-111-55 increased about 6.0-fold, reaching (0.82±0.08) mg/(L·OD730). Extracellular arginine production per OD730of the mutant was significantly higher than that of intracellular, showing that the strain was the arginine-secret-ing mutant with strong production potential.【总页数】6页(P635-640)【作者】戢水玲;高宏【作者单位】中国科学院水生生物研究所, 中国科学院藻类生物学重点实验室, 武汉 430072;中国科学院大学, 北京 100049;中国科学院水生生物研究所, 中国科学院藻类生物学重点实验室, 武汉 430072【正文语种】中文【中图分类】S968.4【相关文献】1.集胞藻PCC6803基因ssl1690缺失突变株的构建 [J], 陈思礼;镇慧2.钝顶节旋藻高产藻株的诱变选育 [J], 刘奇;臧晓南;张学成3.12C6+离子束诱变选育温度耐受螺旋藻高产藻株及其培养条件的优化 [J], 王丽娟; 郑天翔; 杨宋琪; 李欣; 罗光宏4.利用UV和EMS诱变选育高产油微藻藻株的研究 [J], 沈丹丹;杨芳芳;万凌琳;李爱芬;张成武5.集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析 [J], 白福美;李至敏;王小琴;胡紫微;鲍玲玲;李志敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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价值微藻转化系统的构建及集胞藻PCC 6803假定蛋白功能预测雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是两种重要的价值微藻。

其中,雨生红球藻是天然虾青素(Astaxanthin)的重要来源,寇氏隐甲藻已被广泛应用于工业生产二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)。

为提高目标产物产率并降低生产成本,我们旨在开发基于同源重组与电击转化的遗传操作系统。

在本研究中:1)确定了多种抗生素对目的藻株的作用浓度。

在固体和液体培养基中20μg/m L草丁膦可抑制雨生红球藻的生长,在固体培养基中40μg/m L 潮霉素B可对寇氏隐甲藻的生长产生抑制作用;2)PCR克隆目的基因片段。

采用融合PCR方法构建了两种类型的外源基因片段,一种包含18S上游基因、抗性基因盒和18S下游基因三种基因片段,另一种包含18S上游基因、抗性基因和18S 下游基因三种基因片段;3)优化了电击条件并进行真核微藻的电击转化。