第二章-3目的基因获得-915
高中生物选修3目的基因的获取教学设计
高中生物选修3目的基因的获取教学设计教学设计是根据课程标准的要求和教学对象的特点，将教学诸要素有序安排，确定合适的教学方案的设想和计划。
下面是店铺为大家整理的高中生物选修3《目的基因的获取》教学设计，欢迎参考!高中生物选修3《目的基因的获取》教学设计一、教材分析1、内容地位：本节课的内容在高考课标中要求较高。
学生已经学习了基因工程的基本工具，在此基础上转入学习如何利用这些工具完成基因工程的基本操作程序，可以说是承上启下的一节课，是让学生理解基因工程操作基本程序的开始。
2、前后联系：学生已经学习了基因工程的基本工具;后面要学习到基因工程操作的第二步骤构建表达载体。
3、重点难点：从基因文库中获取目的基因PCR技术扩增目的基因的过程二、学情分析本次上课的学生是海口市第四中学高二(5)班的学生，已具备了一定的探究能力、逻辑思维能力及推算能力。
通过对该班级学生的了解情况为学生两极分化情况比较严重，但是成绩好的学生还是比较优秀，听说上课比较活跃。
今天所讲解内容该班级学生已经学习过了!三、教学目标设计知识目标：理解从基因文库中获取目的基因描述PCR技术扩增目的基因的过程，了解其原理和条件。
了解用化学方法人工合成目的基因能力目标：(1)通过对书中插图、照片等的观察，学会科学的观察方法，培养观察能力。
(2)能利用课本以外的资料和信息解决课内学习中发现的问题，从而培养学生自主学习能力，为终身学习、后续学习打下坚实的基础。
(3)通过对基本概念、基本原理、科学方法的正确理解和掌握，逐步形成比较、判断、推理、分析、综合等思维能力，具备能运用学到的生物学知识评价和解决某些实际问题的能力。
(4)对于基因工程操作实例做到能理解、能介绍，从而培养学生对相关知识的理解能力及良好的语言组织表达能力。
情感目标：通过了解现代先进生物学技术，让学生了解到生物技术给人类带来的贡献，通过把现在所学知识与社会相联系让学生感受到学习生物的重要意义。
第七单元第二章第一节基因工程教学设计济南版八年级生物下册
5.适时评价，促进学习：
-设计课堂提问、课后作业和阶段测试等多种评价方式，检验学生对知识点的掌握程度。
-根据评价结果，教师及时调整教学策略，帮助学生弥补知识漏洞。
6.跨学科整合，提高综合素养：
-结合物理、化学等学科知识，帮助学生全面了解基因工程技术的原理和应用。
-引导学生关注基因工程技术的伦理、法律问题，培养他们的道德观念和社会责任感。
四、教学内容与过程
（一）导入新课（500字）
在导入新课阶段，我将采用生活实例和问题驱动的方式激发学生的兴趣和好奇心。首先，我会向学生展示一些基因工程在医学、农业等领域取得的重大成果，如转基因抗虫棉、基因治疗等，让学生初步感受到基因工程技术的神奇和实用价值。然后，提出以下问题：
6.结合所学知识，与家人或朋友进行一次关于基因工程技术的科普讲解，提高他们的科学素养，同时锻炼自己的表达和沟通能力。
作业布置要求：
1.请同学们认真完成作业，注重作业质量，提高自己的综合能力。
2.作业提交时，请注意格式规范，字迹清晰，便于教师批改。
3.作业完成后，及时进行自我检查，发现问题及时改正，确保作业正确率。
3.你认为基因工程技术的应用应该如何规范？
讨论过程中，我会巡回指导，引导学生积极思考、交流观点，培养他们的合作能力和批判性思维。
（四）课堂练习（500字）
课堂练习环节，我会设计以下类型的题目：
1.选择题：检验学生对基因工程基本概念、原理的掌握程度。
2.填空题：考查学生对基因工程技术要点的理解。
3.分析题：要求学生运用所学知识分析基因工程应用案例。
8.拓展延伸：鼓励学生关注基因工程领域的最新动态，培养他们的科学素养。
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第二章基因和染色体的关系知识系统构建规律方法整合整合一减数分裂与有丝分裂的比较1．列表比较法2.曲线图比较法3．分裂图像比较法(以二倍体动物细胞为例)例1如图是某种动物细胞进行有丝分裂和减数分裂的部分图像，据图回答下列问题：(1)按先后顺序把有关有丝分裂图像的号码排列起来：________________________；按先后顺序把有关减数分裂图像的号码排列起来：____________________________________________。
(2)此动物的正常体细胞中有________对同源染色体，细胞核中有________个DNA分子。
(3)在上述分裂图中，细胞中的染色体数比此动物正常体细胞中染色体数增加一倍的是图____________。
(4)在上述分裂图中，属于初级精母细胞的是图______________________________________。
(5)在上述分裂图中，每条染色体上只含有一个DNA分子的是图____________。
答案(1)⑫②⑤⑥⑦①③⑧⑩④⑨⑪(2)2 4(3)⑤⑥(4)①③⑧(5)⑤⑥⑦⑨⑪解析①图中含4条染色体且两两配对，属于减数第一次分裂前期(四分体)；②中含4条染色体，都排列在赤道板上，没有出现两两配对现象，为有丝分裂中期；③中含4条染色体，排列在赤道板上，同源染色体两两配对，为减数第一次分裂中期；④中含2条染色体，排列在赤道板上，为减数第二次分裂中期；⑤⑥都含8条染色体，染色体移向两极，为有丝分裂后期；⑦中细胞的每一极都含4条染色体，细胞膜正把细胞缢裂为两个，为有丝分裂末期；⑧表示同源染色体分开移向两极，为减数第一次分裂后期；⑨中姐妹染色单体分开移向两极，变成4条染色体，为减数第二次分裂后期；⑩中无同源染色体，含2条已复制的染色体，为减数第一次分裂后得到的细胞——次级性母细胞；⑪为减数第二次分裂后得到的细胞——成熟生殖细胞；⑫中染色体散乱分布，中心粒正移向两极，为有丝分裂前期细胞。
基因编辑技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的基因编辑技术是近年来生物科学领域的一项重大突破，它能够精确地修改生物体的基因组，为生物学研究和应用提供了前所未有的可能性。
本实验旨在了解基因编辑技术的原理和操作流程，掌握CRISPR/Cas9技术的基本操作，并通过实验验证该技术的可靠性和有效性。
二、实验原理基因编辑技术是通过人工核酸酶对基因组进行精确修饰的一种基因工程技术。
CRISPR/Cas9技术是目前最常用的基因编辑技术之一，其原理是利用细菌内源性的CRISPR系统中的Cas9核酸酶，结合一段与目标基因序列互补的sgRNA（single-guide RNA），实现对目标基因的定点敲除、插入或替换。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、培养箱、恒温振荡器等。
2. 实验试剂：CRISPR/Cas9试剂盒、dNTPs、Taq酶、限制性内切酶、连接酶、DNA 标记物、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒等。
3. 实验菌株：大肠杆菌DH5α、CRISPR/Cas9菌株等。
四、实验方法1. 设计实验方案：根据实验目的，设计CRISPR/Cas9基因编辑实验方案，包括靶基因序列、sgRNA设计、靶位点验证等。
2. 构建CRISPR/Cas9表达载体：根据实验方案，设计sgRNA序列，并将其克隆到CRISPR/Cas9表达载体中。
3. 转化CRISPR/Cas9表达载体：将构建好的CRISPR/Cas9表达载体转化到大肠杆菌DH5α中。
4. 验证CRISPR/Cas9表达载体：通过PCR和测序验证CRISPR/Cas9表达载体的构建。
5. 转化CRISPR/Cas9表达载体到CRISPR/Cas9菌株：将验证好的CRISPR/Cas9表达载体转化到CRISPR/Cas9菌株中。
6. 实验操作：将CRISPR/Cas9菌株接种到含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
取适量菌株接种到含有靶基因的细胞培养基中，进行基因编辑实验。
3.2基因工程的基本操作程序(教师版)
《第3章基因工程》第2节基因工程的基本操作程序必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一目的基因的筛选与获取1．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
2．获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②基因文库的种类：基因组文库：包含一种生物所有的基因；部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大无有基因中启动子(具有启动作用的DNA片段)无有基因中内含子(位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段)基因数量某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。
基因文库中变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链，这一片段即含有所需的目的基因。
(2)利用PCR获得和扩增目的基因①含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
需要具备的条件有模板、原料、引物、酶、控制温度等。
②原理：利用DNA半保留复制原理，在体外将目的基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量成指数形式扩增(约为2n，其中为扩增循环的次数)。
③前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
④PCR的反应及其作用条件作用在一定的缓冲液提供相对稳定的pH环境；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都第一步：将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至90℃以上，使双链DNA两条链之间的氢键打开，变成单链，分别作为聚合反应的模板。
提取目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握从细胞中提取目的基因的方法。
2. 了解目的基因提取过程中的原理和操作步骤。
3. 通过电泳检测目的基因的提取效果。
二、实验原理目的基因提取实验主要利用DNA的碱基互补配对特性和分子生物学技术，通过以下步骤实现目的基因的提取：1. 细胞裂解：利用去垢剂（如SDS）和蛋白酶K等试剂，破坏细胞膜，使细胞内的DNA释放出来。
2. 去除蛋白质：通过酚/氯仿抽提法，去除细胞裂解液中蛋白质等杂质。
3. DNA沉淀：通过乙醇或异丙醇等试剂，使DNA沉淀，从而纯化DNA。
4. DNA溶解：将沉淀的DNA溶解于适量的水中，以便后续实验使用。
三、实验材料1. 细胞样本：大肠杆菌或其他细胞株。
2. 试剂：SDS、蛋白酶K、酚/氯仿、乙醇、异丙醇、NaCl、Tris-HCl、EDTA等。
3. 仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计等。
四、实验步骤1. 细胞裂解：- 将细胞样本加入含有SDS和蛋白酶K的裂解液中，混匀，室温放置30分钟。
- 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。
2. 去除蛋白质：- 将上清液与等体积的酚/氯仿混合，混匀，12,000 rpm离心10分钟。
- 取上清液（即酚/氯仿相）转移至新管中。
3. DNA沉淀：- 向酚/氯仿相中加入1/10体积的3M NaCl和2.5倍体积的乙醇，混匀。
- -20℃放置1小时或过夜。
- 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。
4. DNA溶解：- 将沉淀溶于适量的Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液中，即为提取的目的基因。
5. DNA浓度测定：- 利用紫外分光光度计测定DNA的浓度。
6. 电泳检测：- 将提取的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带。
五、实验结果1. DNA浓度测定：利用紫外分光光度计测定DNA的浓度为50 ng/μl。
2. 电泳检测：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到一条清晰的DNA条带，与目的基因大小相符。
六、实验讨论1. 本实验成功提取了目的基因，说明实验操作步骤正确。
高中生物第二章第四节教案
高中生物第二章第四节教案
教学目标：
1. 了解遗传的基本概念和规律；
2. 掌握基因的概念，了解基因的结构和功能；
3. 理解遗传物质的传递和表达方式。
教学重点：
1. 遗传的基本概念和规律；
2. 基因的结构和功能；
3. 遗传物质的传递和表达方式。
教学难点：
1. 遗传的规律和机理；
2. 基因的结构和功能。
教学准备：
1. 教材《高中生物》第二章第四节相关知识点；
2. 讲义、教案、学案等教学资料。
教学过程：
一、导入
通过展示一张遗传的家谱图或者一个遗传实例，引出遗传的概念和重要性。
二、讲解
1. 遗传的基本概念和规律
介绍遗传的概念和遗传规律，包括孟德尔遗传规律的三法则。
2. 基因的概念、结构和功能
讲解基因的概念、结构和功能，强调基因对遗传的重要性。
3. 遗传物质的传递和表达方式
介绍DNA和RNA的结构，以及他们在遗传物质传递和表达中的作用。
三、示范
通过实例演示遗传物质的传递和表达方式，让学生理解遗传的基本规律。
四、练习
设计一些练习题，让学生运用所学知识解决问题，加深对遗传规律的理解。
五、归纳总结
让学生总结当天所学内容，强化遗传的规律和基因的作用。
六、作业布置
布置相关作业，如复习遗传的基本概念和规律，了解更多关于基因的知识等。
七、课堂反馈
了解学生对当天所学内容的掌握情况，并对不懂的问题进行解答。
教学结束。
目的基因的获取实验报告
目的基因的获取实验报告一、引言目的基因的获取是基因工程研究中的重要环节之一。
通过获取目的基因，可以进一步研究其功能、调控机制以及在遗传学和生物学研究中的应用。
本实验旨在通过一系列操作，成功获取目的基因。
二、材料与方法1. 材料（详细列出所使用的试剂、培养基、细胞系等）2. 方法（详细描述实验步骤，包括PCR扩增、酶切、连接等操作）三、结果与讨论1. PCR扩增结果（描述PCR扩增的结果，包括目的基因的大小、扩增程度等信息）2. 酶切结果（描述酶切实验的结果，包括目的基因的酶切位点、酶切效果等信息）3. 连接结果（描述连接实验的结果，包括连接产物的大小、连接效率等信息）4. 目的基因获取结果（总结目的基因获取的结果，包括成功获取的目的基因序列、纯度等信息）根据实验结果，我们成功获取了目的基因，并进行了相关分析。
通过PCR扩增，我们获得了目的基因的特异性扩增产物，表明PCR 反应选择性良好。
酶切实验结果显示，目的基因的酶切位点在我们设计的限制酶中存在，并成功切割出预期大小的片段。
连接实验结果显示，连接产物的大小与预期一致，说明连接反应成功进行。
最终，我们通过测序确认了目的基因的获取，并分析了其纯度。
四、结论通过本实验的操作，我们成功获取了目的基因。
该实验结果为进一步研究目的基因的功能、调控机制以及应用奠定了基础。
同时，本实验的操作方法和结果也为其他研究者提供了参考和借鉴。
五、致谢感谢实验室的师兄师姐对本实验的指导和支持。
六、参考文献（列出相关的参考文献，便于读者进一步了解相关知识）以上为目的基因的获取实验报告的内容，通过PCR扩增、酶切和连接等操作，我们成功获取了目的基因，并对其进行了相关分析。
这一实验结果为进一步研究目的基因的功能和应用提供了基础，并为其他研究者提供了参考。
第三章3-2 目的基因的获得
第三章 目的基因的获得 第三章 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆及其方法二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNA differential display PCR (DDRT PCR)差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增 mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6％－8 ％）同步分离显示扩增产物以进行比较。
首先要以5’－T（n）MN—3‘ (3’固定引物．3’anchoredPrimer，其中n＝10一20，M＝dA／dC／dG，N＝dA／dC/dT／ dG）作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．若引物 合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段，而 不会在B的PCR产物中发现该片段。
5’端引物较短，特异性较低．能以相对较高的机率 与cDNA 5‘端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适 当数量的DNA片段(约50－150条)。
若片段数过少，要对 全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量 PCR；若片段数过多，又会增加分离纯化的难度。
当每次PCR扩增50—150个片段时，通过对12个3’引 物和25个5’引物的不同组合，可以在95％的情况下分析 15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全 部基因数。
cDNA，由于该引物具有poly(dT），故可与mRNA的3’poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在 poly(A)5‘端．并使它只介导约1／12的mRNA的逆转 录。
逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行 PCR，3’端引物就是上述3‘固定引物，5’瑞引物是10－ 13个碱基的随机引物.1P.Liang等人设计合成了全部12种 不同的引物，用以反转录 mRNA，合成第一链cDNA。
这种 引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷 酸引物，并用5'-T11MN或5'T12MN通式表示。
精品2019学年高中生物第二章章末整合提升教学案新人教版必修7
第二章基因和染色体的关系知识系统构建规律方法整合整合一减数分裂与有丝分裂的比较1．列表比较法2.曲线图比较法3．分裂图像比较法(以二倍体动物细胞为例)例1如图是某种动物细胞进行有丝分裂和减数分裂的部分图像，据图回答下列问题：(1)按先后顺序把有关有丝分裂图像的号码排列起来：________________________；按先后顺序把有关减数分裂图像的号码排列起来：____________________________________________。
(2)此动物的正常体细胞中有________对同源染色体，细胞核中有________个DNA分子。
(3)在上述分裂图中，细胞中的染色体数比此动物正常体细胞中染色体数增加一倍的是图____________。
(4)在上述分裂图中，属于初级精母细胞的是图______________________________________。
(5)在上述分裂图中，每条染色体上只含有一个DNA分子的是图____________。
答案(1)⑫②⑤⑥⑦①③⑧⑩④⑨⑪(2)2 4(3)⑤⑥(4)①③⑧(5)⑤⑥⑦⑨⑪解析①图中含4条染色体且两两配对，属于减数第一次分裂前期(四分体)；②中含4条染色体，都排列在赤道板上，没有出现两两配对现象，为有丝分裂中期；③中含4条染色体，排列在赤道板上，同源染色体两两配对，为减数第一次分裂中期；④中含2条染色体，排列在赤道板上，为减数第二次分裂中期；⑤⑥都含8条染色体，染色体移向两极，为有丝分裂后期；⑦中细胞的每一极都含4条染色体，细胞膜正把细胞缢裂为两个，为有丝分裂末期；⑧表示同源染色体分开移向两极，为减数第一次分裂后期；⑨中姐妹染色单体分开移向两极，变成4条染色体，为减数第二次分裂后期；⑩中无同源染色体，含2条已复制的染色体，为减数第一次分裂后得到的细胞——次级性母细胞；⑪为减数第二次分裂后得到的细胞——成熟生殖细胞；⑫中染色体散乱分布，中心粒正移向两极，为有丝分裂前期细胞。
基因编辑探究实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因编辑技术作为一种精准的基因操作工具，近年来在生物学研究和应用中取得了显著的进展。
本实验旨在探究基因编辑技术在生物学研究和应用中的潜力，通过实验验证该技术的可靠性和有效性。
二、实验目的1. 了解基因组编辑技术的操作流程和原理；2. 掌握CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用；3. 分析基因编辑技术在生物学研究和应用中的优势；4. 评估基因编辑技术的可靠性和有效性。
三、实验材料1. 实验试剂：CRISPR-Cas9系统、DNA模板、荧光标记的DNA序列、荧光素酶、荧光素酶报告基因、细胞培养试剂等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、细胞培养箱、荧光显微镜等。
四、实验方法1. 设计实验方案：根据实验目的，设计CRISPR-Cas9基因编辑实验方案，包括靶基因的选择、引物设计、载体构建等；2. 载体构建：利用PCR技术扩增靶基因序列，通过重组酶将靶基因序列插入荧光素酶报告基因载体中；3. 细胞培养：将构建好的载体转染到细胞中，进行细胞培养；4. 基因编辑：利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行基因编辑，检测编辑效果；5. 数据分析：通过荧光素酶活性检测、PCR扩增、测序等方法分析基因编辑效果。
五、实验结果1. 载体构建：成功构建了荧光素酶报告基因载体，载体中含有靶基因序列；2. 细胞培养：细胞生长良好，可用于后续实验；3. 基因编辑：通过CRISPR-Cas9系统对细胞进行基因编辑，成功实现了靶基因的敲除；4. 数据分析：通过荧光素酶活性检测、PCR扩增、测序等方法，证实了基因编辑效果。
六、实验结论1. 基因编辑技术在生物学研究和应用中具有广阔的应用前景；2. CRISPR-Cas9系统是一种高效、可靠的基因编辑技术；3. 本实验成功实现了靶基因的敲除，验证了基因编辑技术的可靠性和有效性。
七、实验讨论1. 基因编辑技术在生物学研究和应用中的优势：（1）精准编辑：基因编辑技术可以对特定基因进行定点编辑，避免对其他基因的影响；（2）高效性：基因编辑技术具有快速、高效的优点，可短时间内完成基因编辑；（3）可重复性：基因编辑技术具有较高的可重复性，有利于实验结果的稳定性和可靠性。
17-18版：1.2 基因工程的基本操作程序（创新设计）
1.2 基因工程的基本操作程序【目标导航】 1.结合教材图1－6，整体把握并说出基因工程的基本操作程序。
2.理解获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。
3.理解目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。
一、目的基因的获取(阅读P 8－11) 1．基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的获取。
(2)基因表达载体的构建。
(3)将目的基因导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
2．目的基因的获取 (1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)常见方法 ①从基因文库中获取基因文库的种类⎩⎪⎨⎪⎧基因组文库部分基因文库(如cDNA 文库)②利用PCR 技术扩增目的基因 a ．原理：DNA 双链复制。
b ．条件：引物、DNA 模板、Taq 酶、四种脱氧核苷酸。
c ．过程：目的基因DNA 受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA 聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。
d ．结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n ，n 为扩增循环的次数)。
③人工合成法：如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可借助DNA 合成仪用化学方法直接人工合成。
二、基因表达载体的构建(阅读P 11) 1．基因表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的构成3．基因表达载体的构建过程一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
三、将目的基因导入受体细胞(阅读P11－13)1．转化的概念目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．转化的方法(1)导入植物细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
③花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。
(2)导入动物细胞①方法：显微注射技术。
分子生物学研究技术第三章+3-2+目的基因的获得
Filter hybridization (continued)
compare films and pinpoint unique hybridization signals
localize differentially expressed cDNA clones on plate
identify by DNA isolation and sequencing
逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR， 3’端引物就是上述3‘固定引物，5’端引物是10－13个碱 基的随机引物。
3
在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．若引物 合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段， 而不会在B的PCR产物中发现该片段。
5’端引物较短，特异性较低．能以相对较高的机率 与cDNA 5‘端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适 当数量的DNA片段(约50－150条)。若片段数过少，要 对全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量 PCR；若片段数过多，又会增加分离纯化的难度。
第三章 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆及其方法
第三章 目的基因的获得
二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNA differential display PCR (DDRT PCR)
2
差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增 mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6％－8 ％）同步分离显示扩增产物以进行比较。
AAAAAA
* TTTTTT
AAAAAA AAAAAA
* TTTTTT
AAAAAA
AAAAAA AAAAAA
AAAAAA AAAAAA
25
cDNA subtraction (continued)
高中生物选修三课件：1.2 基因工程的基本操作程序(一)
• 2、一切真理要由学生自己获得，或由他们重新发现，至少由他们重建。
• 3、教育始于母亲膝下，孩童耳听一言一语，均影响其性格的形成。
• 4、好的教师是让学生发现真理，而不只是传授知识。
• 8、教育技巧的全部诀窍就在于抓住儿童的这种上进心，这种道德上的自勉。要是儿童自己不求上进，不知自勉，任何教育者就都 不能在他的身上培养出好的品质。可是只有在集体和教师首先看到儿童优点的那些地方，儿童才会产生上进心。上午11时26分26 秒上午11时26分11:26:2621.11.19
1.2 基因工程的基本操作程序
Taq聚合酶
模板DNA
3` 5`
引物1
引物2 原料
目的基因
5`
3`℃Βιβλιοθήκη 92 75 55℃
92 75 55
3`
5`
5`
3`
变性
℃ 92 75 55
退火
℃ 92 75 55
延伸
℃ 92 75 55
变性
℃ 92 75 55
退火
℃ 92 75 55
延伸
℃ 92 75 55
变性
℃ 92 75 55
1.2 基因工程的基本操作程序 （一）
1.2 基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取
目的基因：能够编码特定蛋白质的基因。
1.2 基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取 1、从基因中获取目的基因 （1）基因的概念 将含有某种生物不同基因的DNA片段，导入受体菌的群体中储 存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
1.2 基因工程的基本操作程序
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1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
从反应机理上来讲，DNA化学合成有 磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯 法；具体操作过程又有液相合成和固相合 成两种形式。
DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯 法原理设计的。
基因合成一般都是自己设计序列，交给 商业公司合成。
DNA合成仪
DNA化学合成的用途： 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 合成测序或PCR引物 制备寡核苷酸探针 制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker)
将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切， 可产生粘性末端。
（四）化学合成法
1976年，H.G. Khorana提出用化学方法合成 基因的设想；
1979年，成功合成E.coli酪氨酸tRNA基因。 ---Science
化学合成法的前提： 已知目的基因的DNA序列。
化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。 战略： 小片段粘接法 补钉延长法 大片段酶促法
注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。
5’ GTCG 3’ CAGCTTAA
AATTCGAC 3’ GCTG 5’
T4 DNA ligase
5’ GTCGAATTCGAC 3’ 3’ CAGCTTAAGCTG 5’
措施：
CIP去除adapter的5’-P，使5’-P成为5’-OH。
5’ P-GTCG-OH 3’ 3’ OH-CAGCTTAA-P 5’
CIP
5’ OH-GTCG-OH 3’ 3’ OH-CAGCTTAA-OH 5’
加装衔接物(linker):
linker是人工合成的一段由10-12个核苷 酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列 的平末端双链寡核苷酸短片段。
5’ TGGAATTCCA 3’ 3’ ACCTTAAGGT 5’
EcoR I linker
HIS4
5’ AOX1
Bgl II
Ampr
pPIC9K
9.3 Kb
ColE1 Bgl II
3’ AOX1
Kanr
HIS4
ColE1
Bgl II 3’AOX1 Kanr
（二）PCR法扩增目的基因
PCR(polymerase chain reaction)： 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通
过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅 速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。
三种方法各有利弊：
小片段粘接法： 化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高； 化学合成的份额较大，成本较高。
大片段酶促法： 化学合成的份额较小，成本较低； 大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的 DNA单链大片段的总收率仅7.7%。
化学合成DNA的实质是按照序列要求 将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一 个单体就是一个循环反应，包括：基团保 护、分离、缩合、分离、去保护五大操作 单元。
问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。
原因：Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅 读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30 次循环Taq酶错配率约0.25％。
措施：选择高保真Taq酶，如Pfu。
由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有 一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎 总是A，因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。
可用T载体克隆。
5’
A
A
5’
PCR扩增产物
T7 lacZ MCS ori Ampr
5’
T
T
5’
T载体
（三）从mRNA合成cDNA
以目的基因的mRNA为模板，在逆 转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在 Klenow酶作用下合成双链cDNA。
此 法 适 用 于 mRNA 丰 度 极 高 的 目 的 基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。
PCR技术的发明--DNA操作技术的革命 发明人：美国生化学家Kary B. Mullis
1990.04 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5.
变性：双链DNA解链为单 链DNA；
变性
退火：引 物 与 模 板 单 链
退火
DNA的特定互补部 位配对、结合；
延伸
延伸：以目的基因为模板， 合成互补的新DNA 链。
由于每一循环所产生的DNA片段均能成为 下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增 加，即Y=2n (n为循环次数)。
30th cycle？ 230(109)copies
CCCCCC GGGGGG
GGGGGG
加装人工接头(adapter)
1978年，康奈尔大学吴瑞发明。 adapter是人工合成的一头具有某种限制 酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链 寡核苷酸短片断。
5’ GTCG 3’ CAGCTTAA
EcoR I adapter
将adapter连接到双链cDNA的两端，直接 成为人工粘端。
合成天然基因：
有些组织特异性mRNA含量很低，很难用 cDNA法克隆。 有些基因比较短，化学合成费用较低。
如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡 肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。
合成寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)：
根 据 已 知 核 酸 序 列 ， 用 DNA 合 成 仪 合 成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。
维 oligo(dT) 素 柱 oligo(dT)
oligo(dT)
纤 oligo(dT)
维 oligo(dT) 素 柱 oligo(dT)
oligo(dT)
总mRNA
与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上， 非mRNA(tRNA、rRNA）流走。
2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合 到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。
1）小片段粘接法：
分别合成12-15bp的单链DNA小片段。 片断之间有互补区，混合退火形成有断点的 双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双链。
混合退火
T4 DNA ligase
2）补钉延长法：
分 别 合 成 1 2 - 1 5 bp 的 单 链 DNA 小 片 段 及 2 0 30bp的单链DNA中片段。
总mRNA
纤 探针DNA
维 探针DNA
素 柱
探针DNA
探针DNA
纤 探针DNA
维 探针DNA
素 柱
探针DNA
探针DNA
特定mRNA
与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其 它mRNA流走。
克隆平端双链cDNA的方法： 平端直接与载体连接； 平端接同聚尾； 加装人工接头(adapter)； 加装衔接物(linker)。
片断之间有局部互补区，可相互作为另一个 片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。
混合退火
Klenow T4 DNA ligase
3）大片段酶促法：
分别合成40-50bp的单链DNA大片段。 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片 断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。
混合退火
Klenow T4 DNA ligase
哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白 mRNA的比例占总mRNA的90%以上。
高丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的50-90%。
低丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的0.5%以下。
步骤：
钓取目的基因的mRNA
逆转录酶催化合成cDNA第一链
逆转录酶去除mRNA-cDNA 杂交链中的mRNA链
1989
Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首， 比喻1989年为PCR爆炸年。
1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司
Eppendorf
Bio-rad
ABI
PCR法扩增目的基因的前提： 已知目的基因全序列或其两侧序列，
化学合成与模板互补的上、下游引物。
若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基 酸序列倒推出核酸序列，但需考虑 密码子的 简并性。
大多数氨基酸拥有简并密码子。
某段连续的氨基酸序列: Cys Met Asp Glu Met Lys
可能的DNA序列: 设计系列探针:
TGTATGGACGAAATGAAA
C
TG
G
TGTATGGACGAAATGAAA TGTATGGACGAGATGAAA TGTATGGATGAAATGAAA TGTATGGATGAGATGAAA TGTATGGACGAAATGAAG TGTATGGACGAGATGAAG TGTATGGATGAAATGAAG TGTATGGATGAGATGAAG
目的基因内部不能有该限制酶的切点， 否则目的基因会被切成碎片！
Ampr
f1ori lacZ
pGEM-T/hVEGF165 hVEGF165 3.5 Kb
SnaB I EcoR I Avr II Not I
EcoR I Not I
5’AOX1 hVEGF165
Bgl II Ampr
pPIC9K/hVEGF165 9.8 Kb
加装同聚物尾：
1972年，斯坦福大学P. Labban和P. Kaiser发明。 利用TdT，在双链cDNA和载体3’端加互补的同 聚物尾，退火连接成重组分子。