2细胞化学染色--PPT资料129页

• 3、瑞氏－姬姆萨染色液复染5～10分 钟，流水冲洗，待干后鏡检。
• 结果判断
• 阳性反应呈棕黑色至蓝黑色颗粒状，定 位于细胞浆中。
• 注意事项
• 1. 稀双氧水易失效，最好临用时现配，一次配制的稀 H弱2或O2呈最阴多性能、用或1～染2色周时。若血发膜现上成不熟产粒生细气胞泡M，P则O表反明应较稀 H2O2可能失效，需重新配制。
• 4.甲基绿溶液：1g甲基绿溶于50ml蒸馏水中。
• 染色步骤：
• 1. 新鲜干燥涂片甲醛蒸气固定5～10min，流水冲洗 5min，待干。
• 2. 入工作液37℃孵育2～3h，流水冲洗数次。 • 3. 稀硫化铵溶液浸泡2～3min，流水冲洗。 • 4. 甲基绿溶液复染10min，流水冲洗，干后镜检。
• 结果判断：
• 阳性反应呈棕黄色至棕黑色定位于胞浆中。
• 注意事项： • 1. 固定剂以甲醛蒸气为最佳。 • 2. 涂片应薄而干燥，否则固定后易脱落。 • 3. 此法稳定性、重复性好，染色效果最
为理想。
• 正常分布
• 1. 巨噬细胞、部分网状细胞呈较强阳性反应。 • 2. 单核细胞、T淋巴细胞、浆细胞呈中等强度
液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚 钠水解，生成a-萘酚和磷酸钠，再以稳定的重 氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀， 定位于细胞浆中。
试剂：
• 1.固定剂：1∶9福尔马林乙醇液，即40％甲醛溶液（福 尔马林）10ml加无水乙醇90ml混合即得。
• 2 . a- 磷 酸 萘 酚 钠 溶 液 ： 1 0 0 mg a- 磷 酸 萘 酚 钠 溶 于 100ml0.2mol/L（pH9.1～9.7）Tris缓冲溶液中，混匀后 4℃保存。
• 1. 固定剂 1∶9福尔马林乙醇液，即40％ 甲醛溶液（福尔马林）10ml加无水乙醇 90ml混合即得。
• 2. 苏丹黑B溶液（ 5g/L ） 0.5g苏丹黑B 粉剂溶于100ml 70%乙醇中，可用1月。
• 染色步骤
• 1. 涂片用1∶9福尔马林乙醇液固定5s， 流水冲洗，待干。
• 2. 入苏丹黑B溶液37℃孵育1h，流水 冲洗，待干或滤纸吸干。
• 细胞化学染色一般包括固定、显示、复染等步 骤。
• 主要用于：
• 显示细胞或组织的酶、蛋白质、糖类、脂类、 无机盐（如铁）等化学成分的含量及分布状况；
• 研究细胞组织来源及分化程度；为疾病的诊断、 鉴别诊断及治疗提供重要的依据。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （NAP）
• ㈠.原理： • 方法一（偶氮偶联法）：在PH9.2~9.8的碱性溶
• 染色步骤：
• 1、干燥涂片（观察片及阳性对照片），滴加固定剂
布满血膜固定5秒钟，流水冲洗，待干或滤纸吸干。 • 2、滴加作用液室温下（或37oC）染色15～20分钟，
流水冲洗，待干。 • 3、中性红溶液复染3分钟，流水冲洗，干后鏡检。
• 结果判断：
• 阳性反应呈蓝黑色颗粒状，定位于细胞浆中。
• 计数方法：
Ⅳ级 ++++ 胞浆充满深黑色致密的 团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中 到大颗粒占胞浆面积的l00%。
• 注意事项：
• 1. 重氮盐以坚固篮BB盐为最佳，其次为坚固篮B盐及 坚固篮RR盐。
• 2. 也可用新鲜配制的六偶氮副品红为重氮盐，配方为： 10ml a-磷酸萘酚钠溶液中加六偶氮副品红50μl，其 NAP阳性反应呈红色颗粒状。六偶氮副品红：4%副品 红（2N盐酸）溶液与4%亚硝酸钠溶液1∶1混合，静置 1min。
• 2. 稀双氧水（新鲜配制） 50ml蒸馏水 中加30% H2O2 50μl。
• 3. 瑞氏－姬姆萨染色液 瑞氏粉1g、姬 姆萨粉0.5g、甘油10ml溶于500ml甲醇中。
• 染色步骤
• 1、 干燥涂片，滴加联苯胺溶液1ml布满 血膜作用1分钟，保留。
• 2、 加等量稀双氧水，混匀，染色4～5 分钟，流水充分冲洗。
• 5 工作液（临用时现配）：取磷酸盐缓冲溶液 1ml，加KI溶液150μ l、氧化亚甲蓝溶液300μ l （边滴边摇），2小时内使用。
• 染色步骤：
• 1 干燥的骨髓涂片或外周血涂片，滴加 固定剂布满血膜固定30~60s，流水冲洗， 晾干或滤纸吸干。
• 2 滴加工作液于涂片上，染色40~60s后 倾去（不用水冲洗），滤纸吸干，镜检。
阳性。
• 3. 粒细胞、巨核细胞、血小板为阴性或弱阳性。 • 4. 红细胞系统、B淋巴细胞呈阴性反应。 • 5. 大多数组织的细胞含有酸性磷酸酶，前列腺
细胞中此酶活性最强。
• 临床意义
• 1. 单核细胞性白血病、真性组织细胞性淋巴瘤、 T细胞白血病及淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细 胞白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤细胞均呈 较强阳性反应。
• 3.Tris缓冲溶液（0.2 mol/L pH9.2）：Tris粉（三羟甲基 氨基甲烷）2.43g溶于100ml蒸馏水中，加浓盐酸0.2ml （0.167ml）。
• 4.工作液配制（临用时现配）：取a-磷酸萘酚钠溶液 1.5ml于试管内37oC水温箱中预热5分钟，加坚固篮BB 盐1.5mg，混匀即可。
• 3. 瑞氏染色液复染，流水冲洗，干后 镜检。
• 结果判断 阳性反应呈棕黑色颗粒状定位 于胞浆中。
• 注意事项
• 1. 涂片可不固定，直接入苏丹黑B溶液 孵育。
• 2. 苏丹黑B溶液的温度升至37℃后开始 计时。
• 3. 通常苏丹黑B溶液使用1月后， 染色效 果会有所减弱；此时加入1g聚乙烯吡咯 啉酮K30（吡咯烷酮）于100ml苏丹黑B 溶液中，可延长使用时间。
• 3. 重氮盐应适量，过量会导致染色失败，出现假阴性； 量不足，则阳性反应较弱。
• 4. 工作液配好后应立即使用（5min以内）。
• 需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照。
• ㈡.正常分布： • 阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶粒
细胞）中，反应结果以阳性率和积分值报告。
• 正常参考值：成人NAP阳性率28.7％（20%－40%）， 积分32.1（20－80）。
• 4. 若出现因细胞太多，MPO反应较弱或着色不理想， 可用工作液对涂片进行再次染色，以增强染色效果。 KI的量对MPO的反应强度也有一定的调节作用。
• 5.碘化钾法MPO染色阳性颗粒易溶于水，应避免用水 冲洗。
积的l00%，甚至遮盖胞核。
• 每例的血片，均计数100个中性粒细胞（杆状核及分叶核 粒细胞），求出NAP阳性细胞的百分比(阳性率)，并按 酶活性的强弱不同，求得阳性指数(积分)。
0级 0 胞浆呈原色，无颗粒。
Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝 黑色颗粒占胞浆面积的25%～ 50%。
Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝 黑色颗粒占胞浆面积的X）
• 方法一 Washurn联苯胺法 • 原理：当细胞中存在具有活性的髓过氧
化物酶时，能分解底物H2O2释放新生态 氧，将联苯胺氧化成联苯胺蓝，后者与 亚硝基铁氢化钠形成稳定的蓝色颗粒定 位于胞浆中。
• 试剂：
• 1. 联苯胺溶液 0.3g联苯胺溶于99ml 88%～95%的乙醇溶液中，加360g/L亚硝 基铁氰化钠饱和溶液1ml，储存于棕色瓶 中，可保存8个月。
• 试剂：
• 1.固定剂：40%甲醛溶液（福尔马林）。
• 2. 工作液配制：
• 蒸馏水
37ml
• 0.2mol/L pH4.7醋酸缓冲溶液 6ml
• 0.15mol/L（5%）硝酸铅
1ml
• 0.1mol/L（3.2%）β－甘油磷酸钠 2ml
• 3.稀硫化铵溶液（临用时现配）：取硫化铵水 剂0.75ml加蒸馏水至50ml。
• ⒋真性红细胞增多症、骨髓纤维化、再生障碍性贫血 时增高，PNH时常减低。
• 5.某些肿瘤的鉴别诊断，如骨肿瘤、消化道肿瘤的肿瘤 细胞碱性磷酸酶常为较强阳性反应。
酸性磷酸酶染色（ACP）
• 方法一：Gomori硫化铅法 • 原理：
• 在酸性条件下（pH4.7）酸性磷酸酶能将底物（甘油磷 酸钠）水解，产生－PO43-，与Pb2+作用生成磷酸铅沉 淀，定位于胞浆中酶活性存在处，再与硫化铵作用， 生成棕黑色的硫化铅沉淀。
• ㈢.临床意义：
• ⒈类白血病反应与慢性粒细胞白血病的鉴别诊断：前 者显著增高，阳性率常达90%以上，积分常高于200分； 后者显著减低，积分可为0。
• ⒉细菌性化脓性感染时，积分显著增高；病毒性感染 时多为正常或稍低。
• ⒊淋巴细胞白血病时常增高；单核细胞白血病时正常 或增高；慢性中性粒细胞白血病时增高，其它各型粒 细胞白血病时减低；白血病伴感染时增高。
• 1. 固定剂：1∶9甲醛乙醇液，即40%甲醛溶液 10ml加无水乙醇90ml混合即得。
• 2 . 磷酸盐缓冲溶液：0.067mol/L pH5.8。
• 3. KI溶液：500mg碘化钾溶于50ml 蒸馏水中。
• 4. 氧化MB溶液：500mg亚甲蓝（Methylene blue）溶于100ml 50%甲醇中，待完全溶解后， 加30% H2O2 50μl。
• 2. 高雪细胞为强阳性；尼曼－匹克细胞为阴性。
• 3. 某些白血病，成熟中性粒细胞酸性磷酸酶活 性增强，可呈弱阳性至中等强度阳性。
• 4. 用于某些肿瘤细胞的鉴别诊断。
苏丹黑B染色（SBB）
• 原理 苏丹黑B是一种脂溶性染料，能将 细胞内的脂类显示出来，呈棕黑色颗粒 状定位于胞浆中。
• 试剂
• 2M. PO的稀H活2性O2。的若最适涂浓片度中为成0熟.0红5m细ol胞/L,呈浓棕度色过或高蓝，绿会色抑制颗 粒状阳性反应，而成熟中性粒细胞阳性较弱或无阳性 颗粒，则表明H2O2过浓。
• 3. 阳性细胞较多的增生极度活跃的骨髓涂片，部分细 胞的MPO阳性颗粒可呈棕黄色。