实验：细胞化学染色POX

2. 单核细胞系 阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则 。原单核细胞为阴性。 3．红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应 4．尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性
反应。
5．苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相 似，主要用于急性白血病类型的鉴别。 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感， 但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急 性淋巴细胞白血病可为阳性）。
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)
偶氮偶联法
NAP积分法
计数100个成熟中性粒细胞，按其反应强度分级，各
级百分率与其级数乘积的总和，即为积分。
例如： NAP反应结果（%） （ -） （+） （++） （+++） （++++）
20
40
20
15
5
积分=（0×20）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145 参考值：正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞（杆 状核及分叶核）可见阳性外，其他血细胞均为阴性。 中性粒细胞NAP活性积分值一般为10～50分，但有时可高 达162分。
【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。 （－） 无颗粒沉着；
（±）
（+）
颗粒细小 ，分布稀疏；
颗粒较粗，局灶分布；
（++）
颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/2~2/3；
（+++） 颗粒粗大，呈团块分布； （++++） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。
骨髓片POX染色
【临床意义】
（1）粒系：
【试剂】 1. 10%甲醛液。 2. 苏丹黑B乙醇溶液
【操作】 1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。 2．自来水冲洗。 3．放人染色液中，37 ℃染色30~60min。 4．用70%乙醇脱色1~2min，水洗lmin。. 5．瑞氏染液复染20~30min。
【结果】
（++）
（+++）
有较粗红色颗粒
有粗大红色颗粒
（++++） 颗粒粗大并有红色块状
（3）红细胞系： 幼红细胞和红细胞呈阴性反应 红细胞系列糖原含量程度参考标准 （ -） （ +） 胞质无颗粒 有少数红色颗粒
（++）
有较粗红色颗粒或弥漫红色
（+++） 有粗大红色颗粒或深红色
（++++）有粗大红色块状或紫红色
粒、单核 细胞胞浆
新生态氧 [O]↑
联苯胺蓝（蓝色）
自我脱氢氧化
亚硝基铁氰化钠
蓝色颗粒
（浆内酶部位）
四甲基苯醌二胺 (棕色)
【试剂】 1%TMB 亚硝基铁氰化钠饱和溶液
1%过氧化氢溶液
稀过氧化氢溶液
瑞氏染色液
【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰 化钠饱和溶液10μl，混合溶液呈淡棕黄色。 2. 在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml, 放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml， 染色6min 。 3. 瑞氏染液复染15～20min 。 4. 油镜镜检。
【结果】 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒， 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。 “一”阴性反应，胞浆中无阳性染色颗粒。 “＋”胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色（或 弥散紫色）。 “2＋”胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色。 “3＋”胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色，胞核 清晰。 “4＋”有极丰富的粗大颗粒，充满胞浆，或弥 散深色，胞核不清晰。
ALL-L1
L1
PAS(+)
AML-M5
M5 PAS(+)
AML-M6
AML-M6
PAS(+)
AML-M7
M7
PAS(+)
（3）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别
巨核细胞PAS强阳性，Sternberg细胞为阴
性或弱阳性。
（4）戈谢氏细胞强阳性，尼曼-皮克细胞阴
性或弱阳性。
（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖
（4）巨核细胞：
巨核细胞和血小板染色反应均为阳性
巨核细胞糖原含量程度参考标准
（ -） 胞质无颗粒
（+）
少量糖原包涵体
（++） 中等量糖原包涵体，定位于核膜 出或分散胞质中，占胞质1/3 （+++）大量糖原包涵体分散于胞质的1/2
（++++）糖原包涵体充满整个胞质
PAS
巨核细胞
巨核细胞包涵体
（5）单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小， 往往位于胞质边缘； 浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性； 组织细胞为阴性反应；
血细胞化学染色的基本要求是在原位
显示细胞成分和结构，反应产物应是 有色沉淀物，具有一定的稳定性。
血细胞化学染色可显示糖原、脂类、
酶、蛋白质等。
血细胞化学染色流程
（一）固定 固定有物理法与化学法， 物理法为干燥和火焰固定，
化学法最常用的是甲醛、乙醇、 丙酮和醋酸等。
（二）显示
脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的 1/4有致密的颗粒。
（++）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。
（+++）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。
（++++） 颗粒极密，颗粒间无间隙。
【临床意义】 1. 粒细胞系 早幼粒及以下阶段随着细胞成熟，阳性颗 粒逐渐增加。 早期原粒细胞一般为阴性，少数细小点状 颗粒代表线粒体被染色 晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限 于胞浆的某一区域。
（含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）
【结果】
（1）细胞外铁的观察 ： 细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小株状或团块状。 以油镜观察定级标准 （ -） 无铁粒可见。 （+） 少数铁粒或铁小珠。 （++） 较多铁粒和铁小珠。 （+++） 很多铁粒、铁小珠和少数小块。 （++++）极多铁粒、铁小珠并有很多小块，密 集成堆。 正常范围：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3 。
POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随 着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分 叶核粒细胞为强阳性。 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒 比中性粒细胞粗大，有折光。 碱性粒细胞为阴性。
（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性
反应，颗粒细小，弥散分布。
一、过氧化物酶染色（POX）
（一）四甲基联苯胺法(TMB) 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的 髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧 化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧 化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色 化合物沉着于细胞质内。
【原理】
四甲基联苯胺TMB （无色）
过氧化氢
（基质中）
POX
巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。
【临床意义】
（1）M6与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明 显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴 性。 （2）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性， AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单 核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高， 阳性颗粒小而多，呈弥散分布。
瘤、癌转移、MM、真红、骨髓纤维化等。
减低：PNH、CML、恶性组织细胞病、
MDS。
（3）疾病鉴别诊断
慢粒与类白的鉴别：CML减低，类白增高。
急性白血病的鉴别：AML减低，ALL增高。
PNH与AA鉴别：PNH减低，AA增高。
病原微生物的鉴别：病毒感染减低，细菌感 染增高。
NAP (++++)
CML-NAP(-)
五、骨髓铁染色
【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓
小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚 铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚 铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，从而反映骨髓 中铁的储存量。化学反应过程为：
4 Fe3+ ＋ 3 K4［Fe（CN）6］→ Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12 K+
（三）细胞化学定量
粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅 ，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受 色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将等级估量与 百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低 ，又反映了细胞受色的强弱。
下面介绍几种常用的细胞化学染色 方法 这些方法学在白血病的鉴别诊断上 具有重要意义。
无效。
4. 染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结果。 5. 试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。
6. 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则
同一片子上细胞染色情况不一致。
AML-M1
M1 - POX(+)
×
二、苏丹黑B染色
【原理】
苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能 溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的 中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞 内微细结构的脂类物质也能显示出来。

【结果】 （1）粒细胞系： 原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。 自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度， 阳性反应逐渐增强。 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色，但颗粒间的 胞质呈弥漫性阳性反应； 嗜碱粒细胞为阳性反应，颗粒紫红色，大 小不一。