花生青枯病内生拮抗细菌的鉴定、抗菌活性及其田间防效
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［#］ 花生青枯病是由青枯雷尔氏菌 !"#$%&’(" $&#"’")*"+,- 引起的一种以土壤传播为主的细菌性病害 ， 是世 界上危害最大、 分布最广、 造成损失最严重的植物病害之一， 被称为植物的 “癌症” 。目前对该病的防治主要 ［!］ 以化学手段为主， 但长期大量施用化学农药易产生抗药性和造成环境污染 ， 因此生物防治受到国内外研究 ［& c ’］ 者的广泛重视。以往用于青枯病防治的生防菌株大多是根际微生物 ， 易受环境的影响而防效不 稳 ［/， .］ 定 。许多研究已证明， 健康植物体内存在大量的内生细菌， 某些内生细菌可通过产生抗生素、 水解酶类
抗作用的内生菌株， 研究其抗菌活性以及田间防治效果， 旨在为花生青枯病的防治提供科依据。
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材料与方法
供试菌株及培养基 从中科院红壤生态实验站花生连作长期定位试验区采集健康花生植株， 并利用南京农业大学植保学院
植物病理实验室提供花生青枯雷尔氏菌作为筛选拮抗菌的指示菌。稻瘟病菌、 小麦纹枯病菌 8).,&6(&$." 6*: 小麦赤霉病菌 ;27"’.29 #’"9.$*"’29 、 小麦根腐病菌 <*09.$()&7%&’.29 7"(.=29 由扬州大学园艺与植保学 ’*"0.7 、 院植物病理实验室提供。 细菌培养基为 9,+: 培养基 （; ・ ：葡萄糖 25;， 蛋白胨 3;， 酵母提取物 3;， < = 2） >64?0。真菌培养基为 +@: 培养基。 !"# 内生细菌的分离与筛选 首先以自来水冲洗花生植株， 再用灭菌水冲洗后， 用无菌刀把植株的表皮除去， 切成 3AA B 3AA 的组织 块， 在 43C 酒精中浸泡 2A#D， 用 5?2C 升汞消毒 0A#D， 用灭菌水冲洗 E 次， 加入 25A< 无菌水于灭菌研钵中研 磨。静置 5?3" 左右， 取 5?2A< 浸出液涂抹 9,+: 培养基平板上， 培养 E5F 0G H 40"。以组织消毒后灭菌水第 如长菌落， 研磨液所长菌落为非内生菌， 弃去；若 IJ 中无菌落， 在研磨液中长出菌落则 E 次冲洗液为对照， 纯化后用 9,+: 斜面培养基 GF 是内生菌。根据菌落形态特征的不同挑取菌株， 分别转接到 9,+: 平板上， 保存。 将分离得到的菌株采用点接法筛选， 具体操作如下：将 5?2A< 青枯菌液 （浓度为 2 B 25. (KL ・A< = 2 ） 涂布 于 9,+: 平板上， 然后在每个平板上用无菌牙签均匀点接 G 个参试菌株， E 个重复， E5F 培养 0G" 后测定其拮 抗圈直径。 !"$ 菌株 %&’(! 抗菌活性的测定
摘要：从病区健康花生植株茎秆内分离到 # 株对花生青枯病菌 !"#$%&’(" $&#"’")*"+,- 有强拮抗作用的内生 细菌， 命名为 D,/$# 菌株。拮抗试验表明， 该菌具有较广抗菌谱， 对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。 形态观察和 #/E F+GH 同源性分析初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌 .")(##,$ "-/#&#(0,*1")(*’$ 。该菌的最佳培养基 组成为：糖蜜 #": ・ 蛋白胨 "B’: ・ 酵母膏 "B’: ・ 装液量 ’"2I L !’"2I、 温 I 0 #， I 0 #， I 0 # 。最适发酵条件为 JKCB’、 度 !’M 、 转速 !""F ・ 培养时间 !#N， 在此条件下拮抗圈直径达 &%B"22。田间试验结果表明 D,/$# 菌株 249 0 # 、 对花生青枯病防效达 /!B&O 。 关 键 词：花生青枯病；解淀粉芽孢杆菌；内生细菌；抗菌活性；田间防效 文献标识码：H 文章编号：#""’$-!/# （!"##） "#$""CC$"’
中图分类号：E%&’B/’!；E%./
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中国生物防治学报
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!"## 年 ! 月
花生青枯病内生拮抗细菌的鉴定、 抗菌活性及其田间防效
!， & !! 王小兵#， ，骆永明#， ，刘五星#，李振高#
（#B 中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室，南京土壤研究所，南京 !#"""C；!B 中国科学院研究生院，北京 #"""%-； & = 扬州大学环境科学与工程学院，扬州 !!’""-）
（#B WV@ I37?F3X?F@ ?Y E?45 19Z4F?92V9X 39[ \?55AX4?9 ]V2V[43X4?9，U9<X4XAXV ?Y E?45 E>4V9>V，(N49V<V H>3[V2@ ?Y E>4V9>V<，G39^49: !#"""C； !B QF3[A3XV E>N??5 ?Y XNV (N49V<V H>3[V2@ ?Y E>4V9>V<，DV4^49: #"""%-；&B (?55V:V ?Y 19Z4F?92V9X35 E>4V9>V< 39[ 19:49VVF49:， T39:_N?A R94ZVF<4X@，T39:_N?A !!’""-，(N493）
等抗菌活性物质在植株体内长期发挥生防作用；相对于腐生细菌、 植物根际促生菌 （ J539X :F?8XN$JF?2?X49:
收稿日期：!"#"$"%$"# 基金项目：国家自然科学基金重点项目 （%"%&!""’） ；中国科学院知识创新工程重要方向项目 （ ()*+$,!""’$%） 作者简介：王小兵 （#-./ 0 ） ， 男， 博士研究生；1$2345：67839:65; <493= >?2= >9；!通讯作者， 博导， 1$2345：@25A?; 4<<3<= 3>= >9。
中国生物防治学报
第 BX 卷
经 &’()*+’, -./ 软件排序后， 采用 012# 3.- 软件中 456789:(;<=:6>6>7 法构建系统发育树。 !"#$% 分析， !"# -.?.菌株 $%&’! 发酵条件的优化 培养时间对菌株 !@A<- 生长和抗菌活性的影响 将 BC" !@A<- 菌液 （浓度为 - D -E/ FG( ・ 接种至 C" H - ）
［/］ 从水稻茎和根内分离到对稻瘟病菌 !"#$"%&’()* &’+,"* 和稻 病或诱导抗病作用的内生细菌， 例如陈夕军等 恶苗病菌 -.//*’*00" 123.42’&. 具有较强抑制作用的 0 株枯草芽孢杆菌 5"6.0027 72/(.0.7 菌株 1023 和 ,.4；陈敏 ［25］ 等 从黄瓜体内分离到 2 株内生拮抗菌株 6782 对黄瓜青枯菌 8"07(&$." 7&0"$"6*"’29 有较好的抗菌效果。 然而对花生青枯病内生拮抗细菌的筛选却未见报道。本研究拟从花生植株体内筛选对花生青枯病有较强拮
CC
第2期
王小兵等： 花生青枯病内生拮抗细菌的鉴定、 抗菌活性及其田间防效
等生防菌而言， 内生细菌不易受环境的影响， 可在植株体内定殖和传导， 更有利于发挥生 !"#$%&’()*!#’， +,+-） ［.］ 防作用， 它们已成为植物病害生物防治的潜在资源菌 。目前已在多种作物体内筛选到对植物病菌具有防
度为 2 B 25. (KL ・ ， A< = 2） E5F 培养 G." 后测定拮抗圈直径， E 次重复。 2?E?0 菌株 MNO82 对植物病原真菌的抗菌活性 分别将待测植物病原真菌接种于 +@: 平板中央， 0.F 培养 （ P Q OAA） ， 将拮抗菌培养液注入孔内， 每孔 5?0A<， 用未接菌的 9,+: 液体培养基 0G" 后在新生菌丝周围打孔 作空白对照， 0.F 培养 3R 后测定其拮抗圈直径， E 次重复。 !") 菌株 %&’(! 的鉴定 2?G?2 形态学观察 将菌株 MNO82 接种在 9,+: 平板上， 观察菌体形态和菌落特征。 2." 内革兰氏染色， ・A#D = 2 培养 2."。镜检确 2?G?0 2OS !@T: 分析 菌株 MNO82 自斜面接种到 9,+: 液体培养基中， E5F 、 055! 定无杂菌后 25555! ・A#D = 2 离心 23A#D 收集菌体。菌体 @T: 的分离纯化使用 U’V)@T: （ !） 试剂盒。以菌株 用细菌 2OS !@T: 通用引物 U04 W -2300 进行 +I- 扩增， MNO82基因组 @T: 为模板， U04：3’ 8:,:,XX9,:XI8 ；-2300：3’ 。反应体系为：25 B +I- 缓冲液 3 IX,,IXI:,8E’ 8::,,:,,X,:XII:,II,I:8E’ <， 0?3AA%Y・ ! 模板 @T: （约 35;・< = 2 ） < = 2 RTX+V G <， 5?3 ! A%Y・< = 2 引物 U04 W -2300 各 0 <， 2 <， 3Z・ < = 2 >"? 酶 5?3 <， ! ! ! ! ! RR60 [ 至终体积 35 <。扩增程序：/GF 3A#D；/GF 3A#D， 33F 2A#D， 40F 0A#D， E5 个循环；20F 冷却恒定。 ! 序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果与 ,*DM’D\ 中的相关属种的 2OS !@T: 序列进行 ./
［22］ （双层营养琼脂） ， 将平板底层 2?E?2 菌株 MNO82 对花生青枯病原菌的抗菌活性 采用牛津杯平板扩散法 倒一薄层 9,+: 固体培养基凝固后， 每平板放 E 个灭菌牛津杯， 然后将培养 G." 的青枯菌液 （浓度为 2 B . =2 ・ 采用混菌法加入 9,+: 培养基， 凝固后将牛津杯取出， 然后在每孔中加入 5?0A< MNO82 菌液 （浓 25 (KL A< ）
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摘要：从病区健康花生植株茎秆内分离到 # 株对花生青枯病菌 !"#$%&’(" $&#"’")*"+,- 有强拮抗作用的内生 细菌， 命名为 D,/$# 菌株。拮抗试验表明， 该菌具有较广抗菌谱， 对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。 形态观察和 #/E F+GH 同源性分析初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌 .")(##,$ "-/#&#(0,*1")(*’$ 。该菌的最佳培养基 组成为：糖蜜 #": ・ 蛋白胨 "B’: ・ 酵母膏 "B’: ・ 装液量 ’"2I L !’"2I、 温 I 0 #， I 0 #， I 0 # 。最适发酵条件为 JKCB’、 度 !’M 、 转速 !""F ・ 培养时间 !#N， 在此条件下拮抗圈直径达 &%B"22。田间试验结果表明 D,/$# 菌株 249 0 # 、 对花生青枯病防效达 /!B&O 。 关 键 词：花生青枯病；解淀粉芽孢杆菌；内生细菌；抗菌活性；田间防效 文献标识码：H 文章编号：#""’$-!/# （!"##） "#$""CC$"’
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［/］ 从水稻茎和根内分离到对稻瘟病菌 !"#$"%&’()* &’+,"* 和稻 病或诱导抗病作用的内生细菌， 例如陈夕军等 恶苗病菌 -.//*’*00" 123.42’&. 具有较强抑制作用的 0 株枯草芽孢杆菌 5"6.0027 72/(.0.7 菌株 1023 和 ,.4；陈敏 ［25］ 等 从黄瓜体内分离到 2 株内生拮抗菌株 6782 对黄瓜青枯菌 8"07(&$." 7&0"$"6*"’29 有较好的抗菌效果。 然而对花生青枯病内生拮抗细菌的筛选却未见报道。本研究拟从花生植株体内筛选对花生青枯病有较强拮
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王小兵等： 花生青枯病内生拮抗细菌的鉴定、 抗菌活性及其田间防效
等生防菌而言， 内生细菌不易受环境的影响， 可在植株体内定殖和传导， 更有利于发挥生 !"#$%&’()*!#’， +,+-） ［.］ 防作用， 它们已成为植物病害生物防治的潜在资源菌 。目前已在多种作物体内筛选到对植物病菌具有防
度为 2 B 25. (KL ・ ， A< = 2） E5F 培养 G." 后测定拮抗圈直径， E 次重复。 2?E?0 菌株 MNO82 对植物病原真菌的抗菌活性 分别将待测植物病原真菌接种于 +@: 平板中央， 0.F 培养 （ P Q OAA） ， 将拮抗菌培养液注入孔内， 每孔 5?0A<， 用未接菌的 9,+: 液体培养基 0G" 后在新生菌丝周围打孔 作空白对照， 0.F 培养 3R 后测定其拮抗圈直径， E 次重复。 !") 菌株 %&’(! 的鉴定 2?G?2 形态学观察 将菌株 MNO82 接种在 9,+: 平板上， 观察菌体形态和菌落特征。 2." 内革兰氏染色， ・A#D = 2 培养 2."。镜检确 2?G?0 2OS !@T: 分析 菌株 MNO82 自斜面接种到 9,+: 液体培养基中， E5F 、 055! 定无杂菌后 25555! ・A#D = 2 离心 23A#D 收集菌体。菌体 @T: 的分离纯化使用 U’V)@T: （ !） 试剂盒。以菌株 用细菌 2OS !@T: 通用引物 U04 W -2300 进行 +I- 扩增， MNO82基因组 @T: 为模板， U04：3’ 8:,:,XX9,:XI8 ；-2300：3’ 。反应体系为：25 B +I- 缓冲液 3 IX,,IXI:,8E’ 8::,,:,,X,:XII:,II,I:8E’ <， 0?3AA%Y・ ! 模板 @T: （约 35;・< = 2 ） < = 2 RTX+V G <， 5?3 ! A%Y・< = 2 引物 U04 W -2300 各 0 <， 2 <， 3Z・ < = 2 >"? 酶 5?3 <， ! ! ! ! ! RR60 [ 至终体积 35 <。扩增程序：/GF 3A#D；/GF 3A#D， 33F 2A#D， 40F 0A#D， E5 个循环；20F 冷却恒定。 ! 序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果与 ,*DM’D\ 中的相关属种的 2OS !@T: 序列进行 ./
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