枯草杆菌蛋白酶活力测定

教学目的、要求（例如识记、理解、简单应用、综合应用等层次）：

在了解酶反应的基本条件、比色法测定物质含量的基础上，将这些知识运用到本实验中。掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应的环境条件。

教学内容（包括基本内容、重点、难点）：

一原理

1，枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它能将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。

2，所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质，此物质蓝色的深浅与酪氨酸的含量成比

3，用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算枯草杆菌蛋白酶的活力。

二，操作：

标准曲线的制作。

设定不同标准浓度的酪氨酸，与酚试剂反应，来衡量生成颜色的深浅与酪氨酸浓度的关系。标准酪氨酸的浓度为0μg/ml，10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml,60μg/ml等，反应温度是30℃，反应时间为15分钟，然后测定OD680nm

根据浓度和OD680做出浓度曲线

酶活力测定

样品管，按照酶的反应条件配制反应试剂，让蛋白酶充分的作用，然后取生成物的滤液与酚试剂反应，测定OD680

样品对照管，操作和样品管的操作大致一样，仅仅是在酶反应前将酶用三氯乙酸处理

空白对照管，将以上两种的滤液用蒸馏水代替，让它与酚试剂反应

酶的活力的计算

酶活力单位：在30℃、pH7.5条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶的活力单位。

样品管含量，要减去样品对照管和空白管，然后再利用标准曲线，查出相应的酪氨酸的量根据酪氨酸的量，即可以计算出枯草杆菌蛋白酶活力

重点：1，测定酶的活力

2，不同类型对照的设置

难点：1，蓝色物质与酶活力的关系

2，几个类型的对照实验

教学过程设计（要求阐明对教学基本内容的展开及教学方法与手段的应用、讨论、作业布置）：

从酶的性质、底物的性质以及反应条件出发，引出生成物——酪氨酸，然后酪氨酸与酚试剂反应可以生成蓝色物质，而蓝物质的深浅与酪氨酸含量成正比，所以可以用比色法测定酪氨酸的含量。再一次讲述比色法测定物质含量的原理以及注意事项。讲述不同类型的对照管的设置要求。引导学生谈论为什么要设置对照管以及它们对实验的影响。

参考资料（含参考书、文献等）：

王镜岩等，生物化学，高等教育出版社，2001

李建武等，生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，2002

赵赣等，生物化学实验指导，江西和学技术出版社，2000

（参考：）生物秀：

一、实验目的

1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理

酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂

仪器:

恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料

枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂

1. Folin-酚试剂：

在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液

3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液

4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液

5. 10%三氯乙酸溶液

6. 0.02mol/LpH

7.5磷酸缓冲液：

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。

7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。

8. 酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。

四、操作步骤

(一)酪氨酸标准曲线的制作

取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00mL，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

(二)酶活力测定

1.酶反应：取一支试管，加入

2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。

以上两过程，应各做一次平行实验。

2.滤液中酪氨酸含量的测定

取3支试管，分别加入1.0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。

五、计算

A 样品—样品液的吸光度值

A 对照—对照液的吸光度值

K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数

V—酶促反应液的体积(本实验为5mL)