《生物制药技术》实验五

《生物制药技术》实验指导

实验五、四环素生物效价测定（选作）

一、实验目的

1、了解杯碟法测定抗生素生物效价的基本原理。

2、掌握杯碟法测量抗生素效价的方法。

二、实验原理

衡量发酵液中抗生素的含量称效价(titer或titre)，效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。抗生素的生物测定方法有三大类：稀释法、比浊法以及扩散法。扩散法中杯碟法(cup and plate method)或称管碟法(tube and plate method) 一种是常用的方法。它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到牛津杯(Oxford cup，一种标准的不锈钢小管)中，置于含有敏感试验菌的琼脂平板上进行扩散渗透，一定时间后抗生素在菌层培养基形成浓度由高到低的自然梯度，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。在一定的浓度范围内，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，且在一定的试验条件下，可直接利用抑菌圈的直径近似地代替其平方，因而从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得样品的生物效价。将已知效价的金霉素标准液先制成标准曲线，根据被检品溶液的抑菌圈的大小，就可从标准曲线上查出效价的对数值，从中计算出相应效价，再乘以稀释倍数，即计算出待测样品中抗生素的效价。因杯碟法是利用抑制敏感细菌的直接测定方法，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度很高，不需要特殊的设备，故多被采用。但此法也有缺点，即操作步骤多，培养时间长，获得结果慢。尽管如此，由于它的独特优点，仍然被世界各国所公认，作为国际通用的方法被列入各国药典中。

三、实验材料及设备

（一）实验材料

1、菌种：

工程菌：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）。

检测效价的敏感指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌(Escherichia coli) 或藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。

2、四环素标准液用0.01mol／L盐酸溶解定容，配制成1mL含10000U母液，贮于4℃冰箱中。临用前再稀释至每mI含1000U。

（二）实验仪器

接种铲，牛津杯、50ml、100ml、500ml三角瓶，50ml、100ml、500ml烧杯，滴管，50ml容量瓶，100ml量筒，培养皿，50ml离心管，玻璃漏斗，滤纸，玻璃棒，精密pH试纸，移液枪，无菌枪头，酒精灯，水浴锅，摇床，剪刀，天平，台秤，分光光度计，台式离心机，超净工作台等。

四、实验流程与步骤

1、制备菌悬液：取敏感指示菌，接种至斜面培养基上，37℃过夜培养至对数增长期，100倍稀释, 约100个/ml (在波长650nm下用分光光度计测透光率为20%左右即可)。

2、制备生测平板：

（1）取无菌培养皿，分别加入约30mlLB培养基后，待凝固，作为底层。

（2）加入100 ul试验菌悬液，均匀涂布。

3、待菌液完全吸收后，在每个琼脂平板上轻轻放置牛津杯4个（对于浓度大的标准品可适当减少杯量），杯之间的距离要均匀。不同浓度的四环素标准溶液用移液枪加入，200ul/牛津杯。被测样品溶液以滴满牛津杯为度，每个被测样品用3套平皿进行测定。待测样品与四环素标准液(10单位/ml)间隔加入小管内，用以进行校正。

4、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养18～24h。

5、移去牛津杯。精确测定抑菌圈的直径大小。

6、在坐标纸上以四环素浓度为纵坐标，以抑菌圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线。

7、将四环素标准液(10单位/ml)的抑菌圈直径进行校正，取得校正值。将此校正值校正待测样品的抑菌圈直径，在标准曲线上根据校正后的抑菌圈直径查得待

测稀释液的四环素效价，根据稀释度得到发酵液的四环素效价。

五、实验结果与分析

1. 记录不同浓度四环素标品的抑菌圈直径实验结果，填入下表，绘制标准曲线。

不同浓度四环素标品的抑菌圈直径

2.据上面的标准曲线,计算出发酵液的四环素效价。

注：若实验过程中使用的是原液，稀释倍数为1