亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：

一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：

A、实验步骤：

1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;

2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;

估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;

3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;

4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;

5、重复步骤4;

6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;

7、室温放置1~4小时

8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;

9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;

使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;

B、试剂：

Induction medium：

MES-KOH PH 10mM

MgCl210mM

AS 200uM

推荐提前配制母液

1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;

1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;

AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;

用高压灭菌的超纯水稀释;

C、关于表达时间：

烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;

D、关于侵染液浓度：

推荐每个菌株的浓度在~之间;过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎;