烟草瞬时表达步骤电子版

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烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究

烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇;朱鸿亮【期刊名称】《植物学研究》【年(卷),期】2015(004)002【摘要】本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染,探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响,建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。

结果表明,β-葡萄糖苷酶(GUS β-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。

农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效,结果准确可靠,从种子播种到收获蛋白只需25天左右。

该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。

【总页数】7页(P25-31)【作者】文莉薇;朱鸿亮【作者单位】[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京;;[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 [J], 常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉3.烟草基因组计划进展篇：6.烟草全基因组过量表达和RNA干涉体系的建立与应用 [J], 路铁刚4.棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 [J], 李妮娜;丁林云;张志远;郭旺珍5.杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶基因DsLYCE表达载体构建及其在烟草中瞬时表达分析 [J], 王计平; 安茜; 段露露; 赵熙宁; 岳敏; 崔红利; 李润植因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)

利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)雒丽娜;王盛【摘要】构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA (Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.%Tobacco Mosaic Virus RNA-based transient expression vectors containing the truncated Human Tissue Plasminogen Activator (Reteplase) was constructed and transformed into Agrobacterium GV3101. The recombinant Agrobacteria were delivered into tobacco plants (Nicotiana benthamiana) by means of an Agrobacterium-mediated transient transformation assay. The efficiency was evaluated by SDS-PAGE, western blotting and Fibrin-agarose plate assay (FAPA). Those results showed that bio-active rPA was successfully expressed in the tobacco leaves and proposed that the plant virus RNA-based expression system will be a useful tool for expressing Reteplase in plants for production purposes.【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】4页(P58-61)【关键词】人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase);烟草花叶病毒;瞬时表达载体【作者】雒丽娜;王盛【作者单位】宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】S432.41急性心肌梗死、脑梗死等血栓、栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，严重威胁着人类健康及生命［1］.临床上，以溶血栓为主的溶栓药物疗法是治疗血栓疾病的主要方法，其作用机理是通过激活无活性的纤溶酶原转变成纤溶酶，催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血管再通［2］.重组的rPA（Reteplase）是临床上治疗血栓性疾病的常用药物［3］，是在人组织纤溶酶原激活剂（human tissue type plasminogen activator，t－PA）基因基础上，通过人工缺失获得基因后，再进行表达的基因工程产品，具有半衰期长、溶栓作用强、对纤维蛋白选择性高、副作用小等优点［4］.商品化的rPA药物是经由大肠杆菌表达系统获得的，非糖基化，产量较低，后续复性纯化的收率不高，价格昂贵（一个疗程需要8 000～10 000美元）.因此，探索和研究新型、高效的表达系统，是提高产量、降低成本的关键.近年来，研究人员先后在CHO细胞（chinese hamster ovary cell）［5］、酵母［6］、转基因动物乳腺［7］、昆虫细胞［8］、转基因植物［9—11］、利什曼原虫［12］和海藻［13］等表达体系中表达t－PA获得成功.但这些表达体系仍存在表达效率低、费用高、生产工艺繁琐和周期长等问题［14］.利用植物RNA病毒瞬时表达载体表达外源蛋白是近年发展起来的，具有表达量大、速度快和廉价等优势的一种新型外源蛋白表达方式［15］.与其他表达系统相比，植物病毒载体表达体系在短时间内、不影响环境的条件下，可以生产大量成本低廉、安全的目的蛋白，这是目前其他任何一个表达系统都不可能实现的，而且这些特点也恰好符合低成本rPA生产的需求.基于此，笔者构建了重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的烟草花叶病毒表达载体PJL TRBO－rPA，并在烟草中进行了表达研究和初步分析.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株和试剂大肠杆菌（Escherich coli）DH5α菌株（保存于宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室）；质粒小提试剂盒、Protein Marker、1Kb Plus DNA Ladder Marker、DL2 000Marker、DL15 000Marker、Pfu DNA Polymerase Mix（天根生化科技（北京）有限公司）；预染Protein Marker、平末端克隆载体pEASYBlunt Simple Cloning Kit（全式金（北京）有限公司）；限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ（纽英伦（NEB）生物技术北京有限公司）；T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）；卡那霉素（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；NC膜（宝生物工程（大连）有限公司）；rPA标准样（爱德药业（北京）有限公司）；ε－氨基己酸（EACA）（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；rPA抗体（英国abcam公司）；羊抗兔Ig G－HRP、HRP－DAB底物显色试剂盒（博士德（武汉）有限公司）；牛纤维蛋白原（牛血）、纤维蛋白溶酶原（牛血）和凝血酶（中国药品生物制品鉴定所）；其他试剂均为进口或国产分析纯.1.1.2 质粒和载体 rPA－C9质粒（宁夏大学李敏教授提供）；PJL TRBO－G载体（美国俄亥俄州立大学John A.Lindbo博士惠赠）.1.1.3 植物材料烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）种子（中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所张永江博士提供）.1.2 方法1.2.1 引物设计根据GenBank（M15518.1）报道的t－PA序列，利用DNAMAN 5.0软件设计引物.上、下游引物分别带有PacⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点.上游引物Prpaf：5’－GGCGCCTTAATTAAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGAC－3’，下游引物Prpar：5’－ATAGTTTAGCGGCCGCCCTAGGTTACGGTCGCATGTTGTC－3’（下划线为相应的酶切位点）.引物由生工生物工程（上海）有限公司合成.1.2.2 质粒的提取及目的基因的扩增按质粒小提试剂盒说明书提供的方法提取质粒rPA－C9并做模板，以引物Prpaf和Prpar扩增rPA基因片段.PCR扩增体系为25μL，其中含：0.25μL的Pfu DNA polymerase（2.5U／μL）、引物（20mol／L）各1μL、12.5μL的Pfu Mix（2.5mmol／L）、1.0μL模板DNA、9.25μL的去离子H2O.扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环.取5.0μL的PCR扩增产物以w＝1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定.1.2.3 目的基因的pEASY－Blunt克隆大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化均按参考文献［16］中的方法进行.利用DNA回收试剂盒，对剩余的20μL PCR扩增产物进行回收、纯化.目的条带用平末端克隆载体pEASY－Blunt Simple进行15min快速连接，连接产物以氯化钙法转化感受态DH5α大肠杆菌.取100μL菌液涂布于含ρ＝50μg／mL卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养.挑取白色菌落，利用菌落PCR技术进行筛选并送生工生物工程（上海）有限公司对目的片段序列进行序列测定.1.2.4 烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建以限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA的质粒DNA，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T4DNA连接酶于4℃连接过夜.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.小提质粒后用限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定.1.2.5 农杆菌的转化参照文献［16］的方法进行电转化.1.2.6 烟草的接种方法将含目的载体的重组农杆菌菌株于LB液体培养基（含有50mg／L Kan、50mg／L Gent、50mg／L Rif）中28℃、200r／min，暗处振荡培养16～18h；将V（菌）∶V（液）＝1∶25转接入IM培养基中28℃振荡培养至A600约为1.0，离心收集农杆菌；等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES），再次离心收集菌体，等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES，200mmol／L AS），室温暗处静止2～3h后即可接种.用无针头的1mL无菌注射器将含目标载体农杆菌悬浮液压入叶片背面.1.2.7 烟草叶片蛋白的提取接种后第6天摘取植物叶片，以渗滤接种点为中心打孔取样并称鲜质量.叶片样品经液氮充分研碎后，用提取缓冲液（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，100mmol／L Nacl，20%甘油，0.1%Tween－20，pH＝8.8）浸提、12 000r／min离心后吸取上层清液进行以下相关测定.1.2.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献［16］的方法进行，w（分离胶）＝12%.1.2.9 免疫印迹检测按文献［16］中的方法进行.一抗按1∶5 000稀释，二抗按1∶500稀释.1.2.10 体外纤溶活性的检测按《中国药典》（2010版）中的方法进行.平板每孔加样2μL，同时以加入纤溶酶抑制剂ε－氨基己酸（EACA）的平板作为阴性对照.37℃湿盒放置反应24h后，用考马斯亮蓝对平板进行染色和脱色并观察记录结果.2 结果与分析2.1 目的基因的扩增与序列测定以质粒rPA－C9做模板，以Prpaf和Prpar为引物进行PCR反应，得到约1.0kb 的特异性扩增带，与预期相大小相符（图1）.将此PCR产物回收纯化后，连接到克隆载体pEASY－Blunt Simple上得到重组质粒，命名为pEASY－rPA.以上、下游引物进行PCR扩增，进一步证实了目的基因rPA已经插入到pEASYBlunt克隆载体中（图2）.测序结果经序列拼接和载体序列去除后，获得长度为1 173bp的序列，且序列比对结果与GenBank（M15518.1）中报道的一致.图1 PCR扩增rPA基因的电泳图谱M—DL 2 000Marker；1—PCR扩增获得的rPA基因；2—阳性对照；3—阴性对照图2 rPA基因pEASY－Blunt克隆的PCR菌落鉴定的电泳图谱M—DL 2000Marker；1—阳性对照；2—阴性对照；3～5—PCR扩增产物2.2 TMV病毒表达载体PJL TRBO－rPA的构建烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA用限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切（图3），电泳后分别回收酶切片段.通过连接反应将目的片段插入烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，替代PJL TRBO －G中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因.连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.抽提质粒后用PacⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳显示两条带，分别为10.6kb及1.0kb（图4），与预期的大小相符，说明rPA基因已成功插入到烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，重组质粒命名为PJL TRBO－rPA.图3 PJL TRBO－G和pEASY－rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切电泳图谱M1—DL15 000Marker；M2—DL2 000Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—PJLTRBO－G质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；3—pEASY－rPA质粒；4—pEASY －rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；5—pEASY空质粒；6—rPA质粒PCR产物图4 PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ单、双酶切鉴定电泳图谱M—1kb Plus DNA Ladder Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—rPA质粒PCR产物；3—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ单酶切产物；4—PJL TRBO－rPA重组质粒NotⅠ单酶切产物；5—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；6—PJL TRBO－rPA重组质粒2.3 rPA在烟草中的表达分析取健康烟草叶片及接种PJL TRBO－rPA载体6d的烟草叶片，分别用蛋白提取缓冲液提取蛋白.所得样品与rPA标准样同步进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS －PAGE）（图5）.结果表明，与健康烟草相比，接种PJL TRBO－rPA载体的烟草叶片总蛋白提取物在40kDa处未见明显的差异条带（图5中的H，1泳道）；在33，28，24kDa处存在3条明显的差异条带.已知rPA在其氨基酸序列的第275／276和423／424间存在2个蛋白酶切割位点，因此推测rPA在烟草中获得了表达，但是表达产物发生了部分降解.图5 rPA在烟草中表达的SDS－PAGE电泳分析M—Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品为了进一步验证上述推测，对上述样品做了免疫印迹（western blotting）检测分析（图6）.结果表明，表达样品在39，33，28，24kDa处存在杂交条带（图6中1泳道），而健康对照样品在相应位置不存在条带（图6中，H泳道条带为上样量较大时Rubisco大亚基形成的非特异性条带）；同时标准样品在相应的位置也有杂交条带产生.说明rPA在烟草中获得了表达且由于表达产物的不稳定，发生了部分降解.图6 rPA在烟草中表达的western blotting检测结果M—预染Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品2.4 rPA活性的纤维蛋白琼脂平板（FAPA）检测在处理好的纤维蛋白平板上加样，各孔均上样2μL，37℃培养24h.活性检测表明，表达样品与标准样品具有体外溶栓活性，而空白对照和健康对照均未发现有活性（图7中EACA（－））.同时，含纤溶酶抑制剂的纤维蛋白平板各样品为没有活性反应（图7中EACA（＋））.该结果进一步证明rPA基因在烟草中获得了表达，且表达产物具有生物学活性.图7 体外纤溶活性的检测Mock—阴性对照；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品3 讨论目前，利用植物生产的药用蛋白或多肽正在逐年增加，该实验也利用烟草花叶病毒表达载体在植物中对rPA（Reteplase）进行了表达研究.结果表明，在烟草中获得了有纤溶活性的rPA重组蛋白，证明了利用植物作为生物反应器生产rPA的可行性.研究中发现，利用植物表达的重组rPA与大肠杆菌表达系统表达的rPA标准样品在相对分子质量上略有差异（图6中1，2泳道），但FAPA验证了二者均具有体外纤溶活性（图7）.分析相对分子质量差异的原因，可能是由于天然的组织型纤溶酶原激活剂自身具有2个糖基化位点，在利用植物体系表达的rPA表达后进行了糖基化的修饰而原核表达的rPA不存在这种修饰，因此造成两者之间在相对分子质量和电泳行为上的差异.此外，利用植物表达的重组rPA中大部分表达产物发生了降解，严重地影响了表达的最终产量.如何进一步避免表达产物的降解，提高系统的表达效率就成为下一步需要重点解决的问题.该研究初步建立了利用烟草花叶病毒表达载体在烟草中瞬时表达重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的体系，为在植物中生产rPA提供了一条可能的途径，同时对深入了解植物RNA病毒载体表达系统和指导其他具有商业价值的外源基因表达奠定了基础.参考文献：［1］ LLOYD－JONGES D，ADAMS R J，BROWN T M，et al.Heart disease and stroke statistics－2010update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121（7）：46－215.［2］ ALBRIGHR K，MARTIN－SCHILD S，MORALES M，et ment on US geographic distribution of recombinant tissue plasminogen activator use by hospitals for acute ischemic stroke［J］.Stroke，2009，40（11）：3580－3584.［3］刘晓宇，王憬惺.Reteplase－第3代基因重组纤溶酶原激活物［J］.中国输血杂志，2000，13（2）：1287－130.［4］ GRUNWALD I Q，WAKHLOO A 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plasminogen activator（t－pa）gene in tobacco plants［J］.Scientific Research and Essays，2010，5（9）：917－922.［12］ NAZARI R，DAVOUDI N.Cloning and expression of truncated form of tissue plasminogen activator in Leishmania tarentolae［J］.Biotechnol Lett，2011，33（3）：503－508.［13］ ZHANG Yichen，JIANG Peng，GAO Jiangtao，et al.Recombinant expression of rt－PA gene（encoding Reteplase）in gametophytes of the seaweed Laminariajaponica（Laminariales，Phaeophyta）［J］.Science in China Series C：Life Sciences，2008，51（12）：1116－1120.［14］ COLLEN D，LIJNEN H R.The tissue－type plasminogen activator story［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（8）：1151－1155. ［15］ GLEDA Y，KLIMYUK V，MARILLONNET S.Viral vectors for theexpression of proteins in plants［J］.Current Opinion in Biotechnology，2007，18（2）：134－141.［16］萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南［M］.3版.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002：96－99.。

烟草转化方案

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。

同时，还可以检测蛋白的表达量。

这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。

通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。

2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。

3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。

4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。

5. 室温放置2-3h后注射烟草。

6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。

注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。

8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。

同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。

配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。

2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。

3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。

5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。

烟草瞬时表达步骤电子版

亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。

3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。

6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。

7.观察。

GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。

4、0.2M Na2CO3 buffer。

Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。

烟草瞬时转化

烟草瞬时转化本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。

2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。

*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。

3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。

4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。

5、重复步骤4。

6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。

7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。

9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。

*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。

B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl2 10mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。

1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。

0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。

用高压灭菌的超纯水稀释。

C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。

严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。

D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。

过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。

烟草瞬时表达

烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。

（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。

（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。

调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。

（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。

（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。

（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，扩增PPP3启动子。

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星【摘要】通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tume aciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持.利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件.研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3～0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液0D600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高.测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6～8周的烟草适合分析.通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)001【总页数】5页(P161-165)【关键词】烟草;基因瞬时表达;注射渗透法【作者】孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星【作者单位】西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S432.2在植物组织中可通过2种方法表达异源基因：稳定表达和瞬时表达[1]。

瞬时表达较前者具有简单、快速、周期短、准确等优点，表达效率稳定，转化率高，并且不产生可遗传的子代，生物安全性高[2]。

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因

利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。

可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。

二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。

但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。

用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。

为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。

三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。

使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。

2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。

在烟草叶片中瞬时表达具有生物活性的重组人纤溶酶原激活剂

摘要：目的探索在植物中瞬时高效表达重组人纤溶酶原激活剂（rhPA）的可行性，探寻低成本 rhPA 表达新途径。方法构建表达 rhPA 的烟草花叶病毒（TMV）表达载体 pTMV rhPA-NSK 和 Zera 融合标签植物表达载体 pJ Zera-rhPA；农杆菌渗滤接种受体植物 Nicotiana benthamiana 和 N. excelsiana 叶片；观察叶片接种部位表型变化；Western blot 和 ELISA 测定和分析 rhPA 在受体烟草中的表达情况及表达产物特点；纤维蛋白琼脂糖平板法评价 rhPA 的体外生物活性。结果病毒载体实验结果显示，pTMV rhPA-NSK 病毒载体在 N. benthamiana 和 N. excelsiana 叶片接种部位产生不同程度的坏死症状；在坏死组织中依然存在完整的 rhPA 蛋白；N. benthamiana 中 rhPA 的表达量略高于 N. excelsiana（P<0.05），约占接种叶片可溶性总蛋白的 0.6%；表达的 rhPA 具有体外溶栓活性。Zera 融合标签实验结果显示，pJ Zera-rhPA 表达载体在烟草叶片接种部位未造成坏死；Zera 标签与其融合蛋白 rhPA 之间可能存在着易断裂位点；Zera 标签蛋白微粒的形成是一种逐步积累聚集的过程；在微粒形成过程中，部分可溶性多肽可能被包裹进了微粒。结论在烟草中可以快速地表达具有生物学活性的 rhPA，植物病毒表达系统为低成本 rhPA 的生产提供一种富有潜力的新平台。关键词：烟草花叶病毒；Zera 标签；重组人纤溶酶原激活剂；表达；烟草
Abstract: Objective To assess the potential of transient expression of recombinant human plasminogen activator (rhPA) in plants as a cost-effective approach for recombinant rhPA production. Methods Tobacco mosaic virus-based expression vector pTMV rhPA-NSK and plant binary expression vector pJ Zera-rhPA were constructed by in vitro sequence synthesis and subcloning. The two vectors were inoculated on either Nicotiana benthamiana or N. excelsiana leaves via agroinfiltration. The expression of recombinant rhPA in Nicotiana leaves was examined using Western blotting and ELISA, and the in vitro fibrinolysis activity of plant-produced rhPA was assessed by fibrin agarose plate assay (FAPA). Results Five to nine days after infiltration with an Agrobacterium inoculum containing pTMV rhPA-NSK, necrosis appeared in the infiltrated area on the leaves of both Nicotiana plants, but intact recombinant rhPA was still present in the necrotic leaf tissues. The accumulation level of recombinant rhPA in infiltrated N. benthamiana leaves was significantly higher than that in N. excelsiana leaves (P<0.05). The yield of recombinant rhPA was up to 0.6% of the total soluble protein (or about 60.0 μg per gram) in the fresh leaf biomass at 7 days post-inoculation. The plant-derived rhPA was bioactive to convert inactive plasminogen to active plasmin. No necrosis occurred in pJ Zera-rhPA-infiltrated leaves. The Zera-rhPA protein was partially cleaved between the site of Zera tag and rhPA sequence in both Nicotiana leaves. We speculated that the formation of Zera tags-induced particles in the plant cells was a dynamic process of progressive aggregation in which some of the soluble polypeptides were encapsulated in these particles. Conclusion Enzymatically active recombinant rhPA can be rapidly expressed in tobacco plants using the plant viral ampliconbased system, which offers a promising alternative for cost-effective production of recombinant rhPA. Keywords: tobacco mosaic virus; Zera Tags; recombinant human plasminogen activator; expression; tobacco

烟草瞬时表达人表皮细胞生长因子(hEGF)

烟草瞬时表达人表皮细胞生长因子(hEGF)薛萍;柳月英;付宏岐;于欣;董健伟;刘秀明;官丽莉【摘要】构建人表皮细胞生长因子(hEGF)病毒表达载体,为实现hEGF在烟草中瞬时表达提供理论和实验依据.PCR扩增获得hEGF基因,将其连接到马铃薯病毒表达载体pGR107上,利用农杆菌介导法感染烟草叶片,对其进行转录水平和翻译水平检测.根据GFP的表达确定收获hEGF时间为病毒侵染叶片后第7天;RT-PCR检测的结果表明hEGF基因在转录水平有表达;Western blotting、ELISA和MTT结果表明感染烟草叶片中有hEGF蛋白表达,表达量为总可溶蛋白的0.0103%,且具有生物活性.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2016(062)002【总页数】5页(P20-24)【关键词】烟草;瞬时表达;人表皮生长因子(hEGF)【作者】薛萍;柳月英;付宏岐;于欣;董健伟;刘秀明;官丽莉【作者单位】渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;东北师范大学附属中学,吉林长春 130028;渭南职业技术学院食品检测中心,陕西渭南 714000;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118;吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,吉林长春 130118【正文语种】中文表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)于1962年首次在小鼠的颌下腺中发现的一种小分子多肽[1]，在人体内广泛存在，由53个氨基酸残基组成，相对分子量为6.045Da，它具有促进多种上皮细胞的分裂增殖和血管生成的生物活性，临床上用于创伤、溃疡、神经损伤、新生儿呼吸窘迫综合症[2]等治疗。

烟草瞬时表达原理

烟草瞬时表达原理烟草瞬时表达原理是指烟草植株在生长发育过程中，通过信号传导途径，调控基因表达和代谢途径，从而快速响应外界环境变化，实现瞬时适应和生存优势的一种生理机制。

烟草植株在面对环境胁迫、病虫害和营养物质供应等外界压力时，能够快速调整生长发育和代谢途径，以适应环境变化，保证植株的生存和繁衍。

烟草瞬时表达原理的核心是信号传导途径。

烟草植株通过感知外界环境信号，如光照、温度、湿度、营养物质浓度等，启动内部信号传导途径，进而调控基因表达和代谢途径。

这一过程涉及多种信号分子和信号通路的参与，包括激素信号、离子信号、氧化还原信号等。

这些信号分子在植物体内形成复杂的信号网络，通过相互作用和调控，最终影响基因表达和代谢途径的调控。

烟草瞬时表达原理的实现依赖于基因表达和代谢途径的调控。

烟草植株在面对外界环境变化时，会启动特定的基因表达途径，调控相关基因的表达水平，以实现对环境的快速适应。

同时，烟草植株还会调整代谢途径，重新分配营养物质和能量，以满足生长发育和抵御外界压力的需要。

这些调控过程涉及到多种基因和代谢产物的参与，形成复杂的调控网络。

烟草瞬时表达原理的研究对于揭示植物生理机制、改良烟草品种、提高烟草产量和质量具有重要意义。

通过深入研究烟草瞬时表达原理，可以发掘植物在面对环境胁迫时的生理适应机制，为培育抗逆烟草品种提供理论依据和实践指导。

同时，还可以通过调控烟草瞬时表达原理，提高烟草产量和品质，促进烟草产业的可持续发展。

总之，烟草瞬时表达原理是烟草植株在面对外界环境变化时的一种生理适应机制，涉及信号传导途径、基因表达和代谢途径的调控。

通过深入研究和理解烟草瞬时表达原理，可以为烟草品种改良和产业发展提供重要的理论和实践支持。

在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究

在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究梁童瑶;邢丙聪;张治海;麻鹏达;梁宗锁;韩蕊莲【摘要】遗传转化一直以来都是研究药用植物次生代谢物调控的重要手段,虽然具有重现性好的优势,但获得稳定转化的毛状根体系或转基因植株往往费时费力,该方法无法满足大批量药用植物次生代谢调控相关基因的研究需求.农杆菌介导的瞬时转化以其易操作、低成本、短周期的优势,已被广泛应用于植物功能基因的研究中.然而目前药用植物的功能基因研究还常使用稳定遗传转化,或一些高成本、高难度的瞬时转化方法(如基因枪、原生质体转化等).因此,本研究利用pEAQ载体在本氏烟草叶片中高效表达了一个或多个外源基因,这将为外源基因在烟草中快速有效的表达提供新途径,也为进一步探究其功能提供了一条思路.多个外源基因的高效共表达也为在本氏烟草中异源构建次生代谢途径提供了可能.【期刊名称】《西北林学院学报》【年(卷),期】2017(032)001【总页数】5页(P179-183)【关键词】瞬时转化;烟草;pEAQ;异源代谢;迷迭香酸【作者】梁童瑶;邢丙聪;张治海;麻鹏达;梁宗锁;韩蕊莲【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100;陕西省安塞县果业发展局,陕西安塞717499;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨陵712100;中国科学院水利部水土保持研究所,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】S572瞬时转化系统已经成为可以替代稳定转化的一种手段[1]。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)是植物遗传转化的常用工具，因其具有低成本、易操作、成功率高的优点，已应用于包括基因表达检测、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作分析、抑制子功能鉴定等多种研究当中[2]。

烟草基因相互作用实验步骤

瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。

1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。

注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。

需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。

2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。

挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。

3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。

乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。

注射缓冲液需要现配现用。

4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。

注射缓冲液重悬。

5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。

利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。

注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。

瞬时表达

三、研究需要
• 随着通过分析基因组规模数据集获得许多新的候选基因，例如微阵列转录模式或蛋白质-蛋白质的互作研究，并且只有少量的能够用于转基因研究。因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功能和鉴定新基因。
• 瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网络调控是很有用的。
如何构建载体
• 1、利用PCR技术扩增目的基因 • 2、利用Gateway技术创建入门克隆载体 • 3、进一步构建表达载体
Gateway™技术
总结与讨论
• 1、基因组学研究方法在某种程度上依赖于克隆序列技能的有效性。并且，开发这些技能的障碍在于创造上千的转基因个体非常困难，实验设计了自动化的瞬时表达分析过程，提高了实验的精确性和效率。对研究信号或生化途径中的特异片段是至关重要的。 • 2、利用Gateway技术创建入门克隆载体，这种载体为相关的实验研究提供了足够的质粒。并且验证了载体的大小和使用量。 • 3、通过设置内部调控基因，对TEAs进行了标准化分析，进一步提高了实验的准确性。
尼古丁生物合成调控功能因子的筛选
• 1、查阅文献，了解相关研究后，通过代谢物分析和cDNA-AFLP技术，研究茉莉酸甲酯处理烟草BY-2细胞后基因的变化情况。 • 结果是：茉莉酸甲酯处理几个小时，细胞新陈代谢系统完全改变，许多生物碱，尼古丁，新烟碱，新烟草碱迅速积累，许多基因的表达模式改变，多数为上调。
结果图
二次筛选
• 通过超过十次的二次转染，统计数据与GUS 比较，分析结果表明， NtORC1 和NtJAP1 分别是对照的2.9-10.3倍和1.4-2.9倍。而 MC307则未被证实。如下图（P值为差异值）

烟草瞬时表达步骤 电子版

烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究

利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)

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在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究

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瞬时表达

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