烟草瞬时表达步骤 电子版

亚细胞定位准备(用烟草ck)

MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）

1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇

床20h至第四天早上；

2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床

培养至OD=0.6-0.8，约5h。

3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；

4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，

室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；

5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。

6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。

7.观察。

GUS定量分析

所用试剂：

1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）

1M Na2PO4 11.54ml

1M NaH2PO4 8.46ml

Add ddH2O TO 200ml

2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)

0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml

10% SDS 2ml

0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml

Tritonx-100 200ul

β-巯基乙醇 200ul

add ddH2O TO 200ml

121℃灭菌室温保存

3、gus蛋白分析buffer

每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。

4、0.2M Na2CO3 buffer。

Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）

•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀

•4℃，13000prm离心15min.

•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）

Gus活性测定

•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。

•20min,30min,40min,50min各取50ul加入950uL的0.2M Na2CO3 buffer中终止反应（注意设置重复）

•样品转入酶标板上，使用酶标仪检测荧光强度（x 365nm/455nm）

180ul x

蛋白标准曲线 y=0.0022x+0.3620(R2=0.9966)

标准蛋白 BSA（牛血清蛋白）0.22mg/ml 中科瑞泰，考马斯亮蓝G-250

gus 蛋白提取方法（全过程于冰上操作）

1、取圆叶3片，加液氮研磨成粉末，装入1.5ml离心管中（4个重复）

2、预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，置冰上

3、4℃ 1300rpm离心15Min

4、吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）

gus活性测定

1、取20ul蛋白加入37℃预热的180ul gus 蛋白分析buffer中，37℃温预

2、20min,30min,40min(郭东老师建议),50min 各取20ul（200ul）加入950ul(800ul)的0.2M Na2CO3 buffer终止反应（注意设置重复）

3、样品转入酶标板上，使用promega酶标仪检测荧光强度（x365nm/455nm）

180ul

蛋白标准曲线 y=0.0022x+0.3620(R2=0.9966)

蛋白标准曲线的绘制

标准蛋白 BSA 0.22mg/ml 中科泰瑞考马斯亮蓝G-250

1、考马斯亮蓝染色使用前应平衡温度至室温并颠倒混匀，预热分光光度计

2、将0,10,30,50,70,90，100ulBSA标准溶液分别加入到7支1.5ml 离心管中，加入ddH2O补只到100ul

BSA体积（ul） ddH2O体积（ul） BSA浓度（ug/ml）0 100 0

10 90 22

30 70 66

50 50 110

70 30 154

90 10 198

100 0 220

3、将5-10ul的蛋白样品加到1.5ml离心管中，用ddH2O补足到50ul（用于测定样品蛋白浓度）

4、向各管中加入500ul的考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min

5、用光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数，以不含BSA的样品的吸光值做为空白对照

6、绘制标准曲线计算样品中的蛋白浓度，如果所得的蛋白浓度不在标准曲线范围内，稀释样品，重测。

MU标准曲线的绘制

先配置4MU 20mM,稀释（用Na2CO3）200倍到100uM,再稀释100倍到1uM，用于制作标准曲线

4MU体积（ul）0.2M Na2CO3 4MU浓度

0 500 0

10 490 20

20 480 40

30 470 60

40 460 80

50 450 100