超薄切片制备

制备肾脏扫描电镜超薄切片

内蒙古医科大学病理学与病理生理学孙微2013110051

制备肾脏扫描电镜超薄切片的步骤如下：

1、取材

材料：动物，雄性SD大鼠1只，大鼠体质量在300g左右。

方法：10%水合氯醛（0.5ml/100g）腹腔注射麻醉成年大鼠；取右侧卧位，腹膜后暴露分离出肾脏组织；用预冷的双面刀片从肾脏皮质部位切取

2mm×2mm×1mm的组织块。

2、固定

固定剂：2.5%戊二醛、2%四氧化锇水溶液

方法：将切取下来的组织块放于盛有2.5%戊二醛溶液的带盖小玻璃瓶中；

然后将该小瓶使用振荡器持续震荡4h；

再将组织块放于盛有2%四氧化锇溶液的带盖小瓶中，继续用振荡器震

荡1.5h。

注意：由于四氧化锇易使组织变脆，故组织块固定时间不宜太长。3、脱水

脱水剂：乙醇

方法：将固定好的组织块依次放入分别盛有浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100% (2次) 酒精的带盖小瓶子中，并使用振荡器震荡，每步脱

水时间为15 min。

注意：换液时，动作应迅速，切勿使样品暴露于空气中过久，以免自

然干燥,使组织收缩、脆裂。

4、透明

透明剂：二甲苯

方法：将组织块完全浸没于盛二甲苯的袋盖小瓶中，1:1浸透，使用振荡器震荡。冬季置37℃温箱，夏季室温即可，浸透应振摇，目的是使透明剂

能完全地置换出残余的脱水。

5、浸蜡

试剂：环氧树脂Epon812

方法：将透明好的组织块放入盛有环氧树脂Epon812的容器中，20min。

6、包埋

包埋剂：环氧树脂Epon812

方法：将浸蜡好的组织块放于盛有环氧树脂Epon812的包埋器中，注意不要盖住标记；再注入包埋剂，将组织块完全浸没。

再将包埋器置于37℃温箱，24h。

7、切片

制备玻璃刀。

用单面刀片去除多余的树脂,将样品团块暴露出来，修成合适的形状和大小；

将修好的组织块装在LKB 超薄切片机上，注意方向；

换上新制的玻璃刀，加双蒸水于刀槽内，吸出弃去；

注入双蒸水，调出最大亮区，自动切超薄片约60nm。

注意：国产制刀机制作的玻璃刀，中部刀刃锐利,切片一般无刀口。此过程虽

因换刀、洗水槽稍花费时间,但由于新刀的刀锋未损伤,所以能一次切出完好、无刀口、非常洁净的大超薄片,可提供较大的观察范围。

由于超薄切片平铺于铜网上的面积大，并能耐受电子束轰击,因此铜网就无需制备Formvar 膜来承载切片。此法既省去了制膜这一程序，又消除了膜过薄、过厚或产生气泡、皱折、本底污染等因素，使样品的超微结构在电镜观察下更清晰。

8、染色

配制Reynolds 铅染液。柠檬酸钠与硝酸铅充分反应，经过持续振摇片刻后, 放入超声波仪中助溶, 并分3～4次加入新配1 mol/L 的NaOH液, 边加液边调pH为12。

关键在超声波中助溶的实际作用时间不超过1min, 以免瓶内空气中的二氧化碳与铅离子在超声波作用下快速形成碳酸铅沉淀而使染液变浑浊。配好的铅染液, 再用孔经2.2µm微孔滤膜快速过滤，表面加少许液体石蜡隔绝空气。另外, 要用分析纯NaOH, 以减少其碳酸根离子含量。

9、透射电镜观察

①图系在低倍镜下观察，示肾小球、肾小囊和泌尿小管。

②图系高倍镜下观察，示足细胞胞体。

③图系高倍镜观察，足细胞胞体及其伸出的各级突起。

（图片来源：崔芳，乔君，王一，王丽.制备肾脏扫描电镜样品的技术方法改良[J].

河北医科大学学报：技术方法，2012,33（3）：357-359）

参考文献

1.吴岩.《电镜技术与实验指南》内蒙古出版集团内蒙古人民出版社2013.

2. 崔芳，乔君，王一，王丽.制备肾脏扫描电镜样品的技术方法改良[J].河北医科

大学学报：技术方法，2012,33（3）：357-359

3．叶达夫，张杰，姚颐.大鼠急、慢性梗阻性积水肾组织的形态学改变[J].武汉大学学报：医学版,2010,31(2):166-169

4. GARROSA M,LLANES F,GAYOSO MJ. Histopathological changes in gerbil liver

and kidney after aluminum sub chronic intoxication [J]. Histol Histopathol,2011,26(7):883-892

5. 钟秀荣，陈莲云，陈文列.制备电镜超薄切片的技巧[J].福建药科大学学报：

1999,33(2)

6.刘鲜林,张博义.透射电镜超薄切片法与负染法探讨[J].贵阳医学院学报：

1999,24(2)

7.应国华主编.电镜技术与细胞超微结构.香港：香港现代出版社,1993.30,50