12第三章半薄与超薄切片总结

(三) 展片
当有皱缩的切片浮在槽液时, 用一小块滤纸浸少量氯仿,接近切片, 以 这种蒸气熏之, 使切片展开。
(四) 捞片
将切片捞在有支持膜的载网上。
直径3mm
七. 染色(电子染色)
原 理: 重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附, 电镜观察时重金属 的原子对电子束形成散射, 从而提高图象的反差。 常用染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅
4. 制刀: 玻璃刀，钻石刀- 制刀机
5．载网和支持膜 5.1 载网 铜网，圆形、直径3mm。网孔数目100、200、300目等; 5.2 支持膜 聚乙烯醇缩甲醛膜, 载网上覆盖一层, 厚度10nm～20nm。
(二) 切片
(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)调节 水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度；(6)切片。
得到电子显微镜的影像。
缺点: 组织化学染色有一定难度。 3. 发展趋势: 发展兼有两者优点的包埋剂(L.R.White resin等)
超薄切片制作程序
与石蜡切片相似, 经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切 片及染色等步骤。
一. 取材的基本要求
为保持细胞结构的生前状态, 必须做到快、小、准、冷
(1)快:最短时间内(争取在1min内)投入固定液。 (2)小:体积要小(一般不超过1mm×1mm×1mm)。
固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。
拟南介小孢子母细胞 电子染色原理 某些重金属盐（铀、铅等）与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附, 重 金属的原子对电子束形成散射, 从而提高图象的反差。
二.固定
2. 固定方法: 戊二醛—锇酸双重固定法
- 分预固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗.
- 这样可以相互补充,使细胞的细微结构得到很好的保存。
5. 清晰度高、保存结构完整性好
6. 可做组织化学、酶活性和荧光显微观察
(二) GMA包埋剂的配方
GMA只有与增塑剂及加速剂混合才能用于制片
增塑剂: 控制包埋块硬度
加速剂: 加速包埋剂凝固，也可以控制硬度
配方: GMA 聚乙二醇400(增塑剂) 过氧化苯酰(加速剂) 93g 7g 0.6g
(三) GMA制片过程
• 常用包埋剂：乙二醇丙烯酸酯(GMA)与环氧树脂
一、乙二醇丙烯酸酯(GMA)制片技术
(一) GMA的性质
1. 水溶性塑料包埋剂-凝固后可被切成0.5-2um的半薄切片 2. 染色时无须去包埋剂
3. 可在低温下凝固(紫外光照射)
4. 单体分子渗透性强, 凝固时仅是把结构分子支撑和包围起来, 并不与结构 分子形成共价键
八. 电镜观察、拍片、记录
超薄切片技术步骤过程图
取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色
第二节 半薄切片
半薄切பைடு நூலகம்法
• 可供光学显微镜观察研究的塑料切片技术； • 制片方法与超薄切片相同，但切片厚度约在0.5-2.0um，介于石
蜡切片与超薄切片之间；
• 效果比石蜡切片好: 较薄，能较好的保存细胞的结构，减少人 为假象，比石蜡切片清晰。
六. 切片
(一) 准备工作
1. 修块: 解剖显微镜下, 削去表面的包埋剂, 露出组织;
2. 半薄切片定位: 切厚度为1μm-10μm的切片, 染色, 光学显微镜 观察定位;
3. 修整: 定位以后, 对包埋块作进一步的修整。顶端金字塔形, 顶面梯形, 每边长 度0.2mm～0.3mm。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的： (1)定位: 确定所要观察的范围, 保留观察的部分, 修去其余部分; (2)对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。
经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
1. 切片前处理
与电子显微镜样品制备相同。
2. 切片、粘片
与GMA制片方法类似
3. 染色
一般石蜡切片的染料都可以用
结晶紫，甲苯胺蓝-O
三、GMA与环氧树脂半薄切片比较
1. GMA的优点: 可以做组织化学定位。 缺点: 不能进行电子显微镜观察 2. 环氧树脂的优点: 在同一个结构上既可以得到光学显微镜的影像，又可以
高尔基体 叶绿体
线粒体
酶体
内质网
超薄切片
• 透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必 须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切 片。 • 切片厚度:50-70nm • 制作程序与石蜡切片相似,只是包埋剂不同(环氧树脂),切片方法不同 植物细胞的大小 超薄切片厚度是50-70nm 直径多为25-50um之间。 最小：球菌直径0.5um。 1细胞=350-1000张切片 最大：苎麻纤维细胞长550mm。
第三章 超薄切片与半薄切片
第一节 超薄切片
专用于透射电子显微镜标本的制备
透射电镜
• 透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段：我们所获得的关于细胞、细 胞器、细胞内大分子的形态信息大多由它提供 • 透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
Chloroplast of tobacco: 1 = cell wall 2 = cytoplasm 3 = vacuole 4 = chloroplast envelope 叶绿体被膜 5 = tonoplast液泡膜 6 = plasma membrane质膜 7 = grana叶绿体基粒 8 = stroma thylakoids类囊体 9 = starch grains淀粉粒 10 = stroma基质
步骤: 前固定用2.5%戊二醛固定2小时、后固定用1%锇酸固定1～ 2小时，脱水。缓冲液漂洗20min
三. 脱水 常用脱水剂: 乙醇、丙酮 梯度脱水 四.过渡 环氧丙烷:相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。 五.浸透和包埋 (一) 浸透 利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。 步骤:环氧树脂+无水乙醇(1:1)中12小时→环氧树脂24小时 (二) 包埋剂 环氧树脂:高分子聚合物,单体状态时(聚合前)为液体、能够渗 入组织内;当加入硬化剂和经加温后,聚合成固体
染色方法
a. 组织块染色: 脱水至70%乙醇, 组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸 铀溶液中, 染色2h以上, 或冰箱中过夜。 b. 切 片 染 色: 溶解石蜡制作蜡板,蜡板上滴数滴柠檬酸铅染液, 载网浮在液滴 上(贴有切片的一面朝下),盖上培养皿,染色10-20min. 载网从染液中取 出后,必须尽快用蒸馏水清洗干净.
增塑剂: 使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。
邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)
包埋步骤
1.组织块包埋在环氧树脂包埋模板中， 2.置烤箱烘干，
3.经45℃(12小时)、60℃(36小时)后，即可聚合硬化， 形成包埋块。 包埋操作中注意事项 (1)干燥: 所有试剂要防潮, 所用器皿应烘干； (2)搅拌: 配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (3)包埋时动作轻巧，防止产生气泡； (4)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；
6. 切片
普通切片机、超薄切片机
7. 展片
切片捞起后放在滴有蒸馏水的载玻片上,在酒精灯上烘烫,待切片完全展开 后,用吸管将水吸走, 烘干切片
8. 染色
不需要去掉包埋剂。
常用甲苯胺蓝-O染色。
7. 苯胺蓝(aniline blue) 特 点: 酸性染料， 染纤维素细胞壁、非染色质结构
二、环氧树脂半薄切片技术
(3)准:取材部位要准确。 (4)冷:低温(0℃～4℃)操作,以降低酶的活性,防止细胞自溶。
二.固定
1. 固定剂
四氧化锇: 对多细胞结构蛋白, 脂肪, 脂蛋白的固定效果好。有强烈的电子染色 作用, 固定样品图象反差较好。
戊 二 醛: 穿透力比四氧化锇强. 糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好. 对 脂类的保存能力很差, 没有电子染色作用。
与超薄切片相似, 经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染 色等步骤。
1. 固定
常采用戊二醛和四氧化锇双重固定法 固定方法与超薄切片一样
2. 清洗
用0.1M 磷酸缓冲液洗涤3-4次
3. 脱水
梯度乙醇至100%
4. 渗透
GMA包埋剂, 0-4℃下两天以上，换两次。
5. 聚合(包埋)
用明胶胶囊做模具 A. 加热方法: 40℃ 1-2天，60 ℃ 1天。一般观察。 B. 低温聚合: 0 ℃下紫外光照射。做组织化学定位。
环氧树脂包埋剂的配方
包埋剂: 环氧树脂 硬化剂: 酸酐类,与环氧树脂起交联作用,并被吸收到树脂链中
十二烷基琥珀酸酐(DDSA), 六甲酸酐(MNA), 顺丁烯二酸酐
加速剂: 引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状
聚合物,加速包埋剂的凝固速度。
2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺
参考: 材料的包埋
药用胶囊：最好用1号(直径6. 3mm)或2号(直径5. 6mm)
包埋步骤: a. 取载玻片硬纸盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径 比胶囊略小。 b. 然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。 c. 打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至3/4的位置，然后小心地将 材料连同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只 细的清洁铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。 d. 但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹，这样可以避免空气停留在盖的顶 端，因为氧气会阻碍环氧树脂凝固。 e. 最后将载有胶囊的纸盒放进温箱中，按45 ℃ 12小时、60 ℃ 36小时的顺序 升温聚合。