超薄切片

超薄切片技术
第一节 引言
超薄切片制备技术是医学研究、超微病理诊断中最基本、最常用的技术。它可作为进一步学习电镜细胞化学、免疫电镜及超微结构图像立体学定量技术的基础。透射电镜的加速电压为20－100KV（千伏），其电子束穿透能力弱，对绝大多数样品而言，不能在TEM下直接观察，必须制备成厚度为50－70nm的超薄切片。要获得高质量的电镜照片，关键在于制作合格的超薄切片。对于超薄切片制备的主要要求有：①组织、细胞的精细结构保存良好，没有明显的物质凝集、抽取、添加等人工假象。②超薄切片应具有一定的硬度和韧性，能够耐受电子束的轰击，在观察过程中，切片不发生变形；切片包埋介质不会升华。③超薄切片应均匀，没有皱褶、刀痕、震颤及染色剂沉淀等缺陷。切片还应具有良好的反差。因此只有经过一系列的固定、脱水、包埋、切片、染色等步骤，使组织标本既保存了细微结构，又具有适当的硬度和韧性以及良好的反差，才能达到上述要求。
超薄切片在电镜中被观察时，由于电镜的分辨本领很高，细胞内部的微细结构变化会在图像上反映出来，所以在整个样品制备过程中，操作者必须十分认真地对待每一个操作步骤。在样品制备过程中稍有疏忽都可能影响制片质量，或切不成超薄切片，或在图像中加入人工假象，以至于直接影响研究结果的准确性和重复性。所以整个操作过程必须细致、谨慎，严格按照操作步骤进行。所用的器皿和器械必须非常清洁，玻璃器皿都要经过清洁液泡洗，所用的药品及试剂都是分析纯级，配试剂用的蒸馏水必须是用玻璃蒸馏器蒸出的双蒸水。
超薄切片样品制备的过程比较复杂，具体的说来，大致可分为取材、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、修整定位、切片及染色等几个步骤。
常规超薄切片样品制作的具体步骤和时间如下：
⑴样品取材后在醛类固定液（3％戊二醛）预固定几个小时或更长的时间；
⑵缓冲液漂洗（0.1mol/L磷酸缓冲液）几小时或过夜，中间更换5次缓冲液；
⑶1％四氧化锇固定液后固定2h左右；
⑷0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次10min;
⑸梯度乙醇或丙酮脱水，其顺序为、50％、70％、80%、90％、100%乙醇各一次，每次10分钟100％丙酮2次，每次10－15min。脱水时间可根据组织的种类和大小适量增减；
⑹1:1丙酮包埋剂浸透1－2h;；纯包埋剂浸透过夜
⑺包埋：可根据实际情况选用4号胶囊、平板或其它包埋模具。
⑻聚合：37℃ 12h,45℃12小时， 60℃ 24小时。
⑼切片：用超薄切片机将组织块切成50—70nm厚的超薄切片。
（10染色：用醋酸铀将超薄切片染色30mi,柠檬酸

铅染色5－8min即可。

第二节 制样前的准备工作
电镜样品的制备工作是高度繁琐、高度复杂的工作。在样品制备前必须作好充分的准备工作。制样前的准备工作主要包括三个方面：一是实验设计的准备；二是实验器具和实验试剂的准备；三是实验动物的准备。下面一一加以简要的介绍：
一、实验设计的准备
实验设计应当充分考虑电镜技术的复杂性和高消耗性等特点，在没有周全的实验设计之前不要轻易地动手进行实践。在实验设计中实验者必须首先明确实验目的，围绕着实验目的制定出实验流程。根据实验流程，实验者可以选择合适的实验动物和试剂，备齐实验器具。在正式实验之前，最好要进行预实验，以检验实验设计的科学与否。这样，在进行具体的实验时，才能做到心中有数，有的放矢。
具体的讲，在实验设计时，需要考虑下列因素：①实验是进行一般的超微结构观察还是进行细胞化学或免疫电镜观察，实验涉及的是哪些组织和器官，对取材的组织和器官的部位都要考虑周密。应当特别指出的是，由于电镜工作的局限性很大，取材的部位必须尽量准确，例如肾脏的皮质和髓质显然有着不同的超微结构，肝脏的肝小叶内部位和门管区部位有极大的差别，脑组织的灰质和白质也大不相同；此外还要注意取材方向，如肌肉，是横切还是纵切等等，诸如此类的问题，都不可忽略。②根据实验的目的，采用合适的缓冲液、固定液和固定方法。例如在细胞化学工作中，一般要求选用二甲砷酸盐缓冲液，一些特定的离子细胞化学技术需要特定的缓冲液。③包埋介质有时也是需要考虑的，例如在某些免疫电镜工作时，需要低温包埋剂，这样抗原性可以保存得很好。
二、实验器具和实验试剂的准备
实验器具和实验试剂的准备要考虑到实验各个环节所需要的玻璃器皿、实验器材以及实验试剂等。对于一些常规的操作环节，例如取材室、包埋室、切片室、染色室都应准备相关的玻璃器皿、实验器材和实验试剂。玻璃器皿、实验器材和实验试剂应随着消耗随时补充，以便在进行常规工作时，可以随时取用，而不必进行1次实验，准备1次。在做特殊的实验工作时只要准备与该次实验有关的器具和实验试剂就可以了。下面以取材为例，应常备下列器具：①常用型号剪刀各1把；②常用型号的止血钳；③常用型号的直镊子和弯镊子；④双面刀片若干；⑤清洁的青霉素小瓶若干；⑥盛满冰块的平板器皿或铝制盒1个；⑦各种常用缓冲液和固定剂；⑧滤纸、牙签、卡片或蜡片若干；⑨胶布、不干胶若干。
三、实验动物的准备
实验动物的选择非常重

要，在实验前应当根据实验目的选择合适的实验动物，特别重要的是选择合适品级的动物，否则实验动物结果有可能得不到承认。实验动物购买应在有资格认定的部门进行，不可随意购买。实验动物购买后，应饲养在与其品级相应条件的环境下，尽量维持其正常生理状态，避免临时从远处取来，因条件的变化而造成实验的失真。
在实验时，还必须设立对照组。不仅要有正常对照，有时还应设立和实验组相同条件的对照。实验和对照的动物必须在相同条件下取材：在时间上尽量同步，采用相同的固定剂，取材部位完全相同，以增加实验的可靠性。此外，各组实验动物还应具有一定的数量，得出的结论才较为可靠及有利于统计学分析。在电镜观察时，由于电镜实验的昂贵和复杂，各组动物可稍少，但一般情况下不可少于3只。
第三节 取材
从动植物机体上或从细胞及微生物的培养物中取得所需材料的操作过程叫取材。
取材是制备标本的第一步，首先要确定取材部位，如取脏器的中央或边缘部位、器官的皮质和髓质等等，根据需要采用不同方式。
一、 取材的基本要求
①快
为了能观察到尽量接近生理生活状态时的生物或细胞的结构，取材越快越好。对于实验动物，最好在没有停止血流时就取材，因为细胞一旦失去血流供应，就处于缺氧状态，代谢发生改变，细胞内的一些酶将释放出来使细胞自溶，破坏微细结构形态。所以，要求组织离体1 分钟内迅速进入固定液进行固定，使细胞内的微细结构尽量保存在生活状态下的位置和形态。
② 冷
尽量保持低温下操作（0——4C），以降低酶的活性，减少对微细结构的影响。
③ 小
取材时，组织块体积要小，应在0。5——1mm3，因为固定液渗透能力弱，组织块太大，块的内部将不能得到良好的固定。取材时动作要轻巧，刀片要锋利，绝不能挤压牵拉组织，避免人为的造成组织损伤。
④净
尽量少带血液或组织液进入固定剂，可用缓冲液把表面血液或组织液冲掉，千万不要用水冲洗组织。
⑤准
取材部位要准确。根据研究目的和观察对象的要求，确定取材的位置。如：肾上腺的髓质与皮质，脑下垂体的前叶与后叶有截然不同的结构。由于电子显微镜的放大倍率很高，观察到的视野很小。为了避免由于取材不准确而造成的“一孔之见”，要求取材者要有一定的形态学实验基础。
二、 取材的具体方法
先准备好取材用具，包括剪刀、镊子、干净的蜡片或卡片纸、新的双面刀片、有编号的盛有固定液的小瓶、滴管、牙签及冰盒等。所有用具必须十分清洁。
。
1、实验动物的取材：先将动物麻醉或

处死，处死时用急死的方法如断头、断脊髓等。麻醉取材：先将动物麻醉，立即暴露取材部位，在不中断血流的情况下，用锋利的剪刀取下一小块组织，立即投入预冷的固定液中，待10－30分钟后再细切成1mm3 小块。也可以立即放在滴有冷固定液的石蜡板或塑料板上，用单面刀片迅速切去剪过的切面，把组织切成1mm3 的小块，立即用牙签将之轻轻挑入装有固定液的小瓶中。操作应在1分钟之内完成，把离体后组织自溶减少到最低限度。对于比较复杂的器官及对缺氧比较敏感的脑组织的取材应先进行原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再行取出。
2、临床活检取材：外科活检取材可先取厚度为1－4mm的薄片，然后在冷固定液中细切为1mm3 的小块。取材过程中，要求手术者予以良好的配合。
3、体外培养细胞的取材：生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒去培养液，接着倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置3－5分钟，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，用普通离心机低速离心（2000转／分）15分钟，使细胞聚集成团块，弃去上清液，换上新鲜的固定液继续固定。
4、植物组织的取材：植物组织的取材比较容易，它的 细胞离体后变化不像动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜先切成薄片状，经适当固定后再切成0.5—1mm3的小块　

第四节 固定
一、 固定的定义和目的
固定是指用物理或化学的方法、手段，迅速地杀死细胞，使组织细胞的形态结构尽可能地保存在接近其生活时的状态。
固定的目的：①防止组织细胞的离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致。②在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不能溶解和流失。③为样品以后的处理（包括染色和经受电子束轰击）作准备，并使组织适当的硬化。
二、 固定方法
电镜技术常用两大类固定方式即物理固定和化学固定，其中化学固定是最常用的固定方法。对于不同的样品取材，以及不同的实验目的应采用不同的固定方法。
㈠物理固定方法
物理固定是指用冷、热、或微波等物理方法对生物组织进行固定。在超微结构研究中，冷冻固定和微波固定是较为常用的物理固定方法。
㈡化学固定方法
化学固定是指采用一定的化学试剂对组织或细胞进行固定。在化学固定过程中，组织微细结构保存的质量不仅受到固定液特性的影响，而且还受到固定组织所使用方法的影响。各种不同的化学固定方法具有不同的特点和固定效果，下面一

一加以介绍。
⒈浸泡固定 组织块切小后，立即投入固定液中。一般使用清洁的青霉素小瓶，每瓶放10－20块组织，固定液2－4ml。置于4℃固定2－4h或更长时间。使用该方法固定组织，要求动作要快，组织块要小，固定液要保持低温，在0—4℃.
⒉原位固定 原位固定是指在保持实验动物器官血流不断的情况下，在原位 进行固定渗透，避免因为缺氧和死后的组织自溶引起微细结构的变化，从而达到理想的固定效果。
实行原位固定的方法之一是将实验动物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剥开包膜，把冷的固定液直接滴在组织表面上，保持固定液适当浓度不使其挥发掉；另一种方法是在实验动物麻醉后，将固定液直接注射到所需固定的组织中或者空腔器官的内部。经过这样初步固定后，取下经过固定的器官、组织，再切成小于1mm3 的小块，继续于4℃进行浸泡固定1－3h。该方法适用于较软的组织（如脑、眼球等）。
3．血管灌注固定。 这是最好的固定方式。它是利用血液循环的途径将固定液灌注到所需固定的组织中，其特点是固定迅速、均匀。血管灌注固定可以采用全身灌注和局部灌注的方式。对于小动物，可以采用全身灌注的方式；对于大动物，可以采用局部灌注方式。
具体的血管灌注方法如下：
在进行灌注前，用3.5%水合氯醛或者戊巴比妥腹腔注射麻醉动物。实验动物麻醉后，对于全身灌注的动物，打开胸腔，暴露心脏；对于进行局部灌注的动物，暴露所要灌注的器官的动脉。将灌注针头插入左心室或相应器官的动脉血管，注意灌注针头在灌注过程中不可脱落。在固定液注入前，先要用生理盐水或缓冲液灌注洗去血液。灌注针头插入心脏或血管灌入生理盐水后，应立即用眼科剪刀剪开右心房或回流静脉，使得循环畅通。当右心房或回流静脉流出的液体清亮，不含血液时，再灌入一定数量的固定液，使组织得到均匀快速的固定。一般灌流固定10－15min后，再取下组织切成小块（0.5—1mm3）置4℃3%的戊二醛固定液中继续固定2小时左右。
灌注固定需注意以下几个问题：①灌注固定要选择好合理的灌注路线，如果灌注的器官为肝、胃肠道、肾、骨髓和睾丸等，穿刺的部位开在腹主动脉，再根据动脉分支位置阻断流向其他脏器的动脉分支，然后剪开肾静脉或髂静脉等作灌注液回流。先以生理盐水冲净脏器中的血液，随后根据实验需要用不同浓度固定剂作灌注固定。②注意灌注压力，如果灌注压力过大，一方面细胞会发生肿胀，另一方面反而会使灌注液难以进入小血管，影响灌注效果。下面将不同脏器灌注时的压力及其流量数值列入下表

，供参考。
局部脏器灌注时的灌注压力和流量
脏器 灌注压力（kPa） 灌注流量（ml/min）
肝、胃肠道 16.0-18.7 9-10
肾 16.0-18.7 9-10
骨髓 24.0-26.7 11-12
睾丸 26.6-29.3 12-13
③灌注液的温度一般接近室温，25－30℃，否则会引起血管收缩，影响灌注效果。④采用近交系动物，因杂种动物血管分布不一，不易找到准确位置。⑤做血管穿刺时应尽量一次进入，多次穿刺可使血管收缩；对手术无关的部位不去触摸，以减少损伤。灌注动作要快，动作慢，会使血液发生凝固，甚至动物出现死亡，从而影响固定效果。⑥灌注时间及防凝。一般生理盐水冲洗1－2min，然后用固定剂灌注10 min左右。为了不让血液凝固，可在穿刺前从肠系膜动脉注射肝素0.4ml，可防止血液凝固。
上述三种固定方式中，以血管灌注固定效果好，但操作复杂，要求高。浸泡固定最简便，也最常用。通常先用醛类固定液作预固定，经过漂洗后，再用1%四氧化锇固定液作后固定，以提高固定效果。
三、 电镜制样中常用的缓冲液及其配制
化学固定剂通常需用一定的缓冲液配制，缓冲介质在固定时所起的作用为：①使固定液维持稳定的pH;②使固定液有适当的渗透压，不使细胞收缩或肿胀；③提供适当的离子成分，使细胞成分不被抽取或沉淀。用于电镜制样的缓冲介质有多种，如磷酸盐缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等，这些缓冲液各有其优缺点，可根据不同研究目的选用。由于大多数动物组织的pH平均值为7.4，因此缓冲液的pH值选择在7.4左右。
㈠磷酸盐缓冲液
用于电镜技术的磷酸盐缓冲液是仿效细胞外液的成分而配成的，它的优点是便宜，无毒性作用；缺点是久放易产生沉淀并易遭到细菌的污染。磷酸盐缓冲液的pH会随温度的变化而稍有变化，在pH7.5以下，它的缓冲能力很强，控制固定液的pH值比较有效。
磷酸盐缓冲液常用于配制戊二醛固定液和多聚甲醛固定液，并适于灌流固定。配方有多种，只要渗透压相同，固定效果基本相同。一般先配成贮存液，临用时将贮存液按比例混合而成。
配方1： 0.2mol/L磷酸缓冲液(Sorensen配方)
A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4.H2O 27.6g
或NaH2PO4.2H2O 31.21g
加双蒸水到1000ml
B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）:Na2HPO4.2H2O 35.61g
或Na2HPO4.12H2O 71.64g
加双蒸水溶解成1000ml
按表所列数据取A液和B液混合后，即得所需的0.2mol/L磷酸缓冲液。

0.2mol/L磷酸缓冲液
pH A液(ml) B液(ml)
6.1 85 15
6.5 68 32
6.8 51 49
6.9 45 55
7.0 39 61
7.1 33 67
7.2 28 72
7.3 23 77
7.4 19 81
7.5 16 84
混合后测pH，常用缓冲液的PH 在7.2—7.4范围， 稀释2倍则成0.1mol/L磷酸缓冲液，渗透压为226mmol／L。加入0.18mol/L 蔗糖，则为425mmol/L。
配方2：Millonig磷酸缓冲液
A液: 2.26% NaH2PO4.H2O
B液: 2.52% NaOH
C液: 5.04% 葡萄糖
D液: A液41.5ml + B液 8.5ml
临时取C液5ml加D液45ml，混和后用B液调节pH到7.3.该液比较稳定，在4℃下可保存数周。
配方3： Maunsbach磷酸缓冲液
用以下试剂配成0.135mol/L的磷酸缓冲液：NaH2PO4.H2O 2.98g
Na2HPO4.7H2O 30.40g
加双蒸水到1000 ml
此缓冲液pH为7.35，渗透压为298 mmol/L,适用于固定大鼠的肾脏。
配方4：Karlsson 和Schultz磷酸缓冲液
用以下试剂配制缓冲液：NaH2PO4.H2O 3.31g
Na2HPO4.7H2O 33.77g
加双蒸水至 1000 ml
此缓冲液pH为7.4，渗透压为320mmol/L,与大鼠的脑脊液相等。适用于对中枢神经系统的灌注固定。
㈡ 二甲砷酸盐缓冲液
此液配制比较简单，比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定的毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。另外，由于二甲砷酸盐不像磷酸盐那样会和铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。常用浓度为0.1mol/L。
配方如下：
A液（0.4mol/L 二甲砷酸钠贮存液）：Na(CH3)2.ASO2.3H2O 8.65g
加双蒸水至100 ml
B液(0.2mol/L 盐酸溶液)：HCL(36%-38%)1ml: 加双蒸水到60 ml
取25ml A液、3-4ml B液混合，测pH，可用B液调整pH值到7.3左右，再加双蒸水到50ml，配成的二甲砷酸钠浓度为0.2mol/L。在配制固定液时也应稀释到0.1mol/L。最后配成的固定液中加1-3 mmol/L的钙离子，可使结构保存更好。
㈢醋酸巴比妥缓冲液
醋酸巴比妥缓冲液在电镜的早期用来配制四氧化锇，固定效果比磷酸缓冲液的效果好。此液缓冲能力较差，和醛产生作用后减弱缓冲能力，因此不能用来配制醛类固定剂，适于作四氧化锇及醋酸铀的稀释剂。该缓冲液易于被细菌污染，不能长期保存。临用时取储存液按比例配制。
四．电镜制样中常用的固定剂及其配制
（一）四氧化锇和 四氧化锇固定液
1．四氧化锇 也被称为锇酸。 实际上，它即非电解质，也不生成盐，是强氧化剂。市售商品为安瓶装的微黄色结晶,挥发性强,有强烈的刺激性气味，该试剂较贵重，通常密封在玻璃安瓶里，0.5克或1克包装,使用时要节约。四氧化锇

的毒性很强，它的蒸气对眼角膜及鼻，喉粘膜具有毒性作用，使用时要注意防护，最好在通风橱内操作。
四氧化锇有以下主要优点：1.它能与不饱和脂肪酸结合形成脂肪-锇复合物固定脂类,与蛋白质发生交联稳定蛋白质,因此能较好地保存组织细胞的微细结构;(2)虽然四氧化锇不和单独的核酸及糖类起反应,但当核酸,糖类与蛋白质结合在一起时也能被固定,因此它几乎能和所有的细胞成分结合;(3) 四氧化锇电子密度高,能使被固定的组织产生良好的反差,本身能起到染色的作用;(4) 四氧化锇对缓冲液的要求不高
然而, 四氧化锇也存在不少缺点(1)它不能保护糖原,不能固定核酸,对微管固定较差;(2) 四氧化锇渗透组织很慢,渗透速度最快是在第一小时内,约0.6mm，以后更慢，所以组织块要切得很小。当组织块大于1mm以上时，不能得到完全固定；（3）四氧化锇不能保存酶的活性，因此不能用作细胞化学的固定剂；（4）四氧化锇具有挥发性和对粘膜的毒性作用。
2．四氧化锇固定液的具体配法 四氧化锇固定液一般是配成2%的水溶液保存，临用时加等量的缓冲液稀释，使最终固定液的浓度为1%。锇酸不易溶解，配后要1-2 d才能使用，且应避光，贮存在冰箱内。水溶液应呈无色或淡黄色透明，若变成棕色，则不能使用。
（1）2%四氧化锇贮存液的配制：先将4只装有四氧化锇的安瓶(共2g)用肥皂水洗净,再用清洁液浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用玻璃划割器在上面刻痕,再用蒸馏水冲洗几次,放入洁净棕色广口玻璃瓶内,加入100ml双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓶，或用力摇破。然后用蜡严密封口，贴上标签备用。洗净后的安瓶严禁与手或纱布、滤纸等接触。将配好的2％四氧化锇置于干燥器中，于4℃保存。
（2）磷酸缓冲的1%四氧化锇固定液的配制：等量的0.2mol/L磷酸缓冲液（PH 7.3）与2％四氧化锇贮存液混合，临用时现配。
（3）二甲砷酸盐缓冲的1%四氧化锇固定液的配制：等量的0.2mol/L二甲砷酸盐缓冲液（PH 7.3）与2％四氧化锇贮存液混合，临用时现配。

（二）戊二醛和戊二醛固定液
1．戊二醛： 戊二醛的分子式为O=CH-CH2-CH2CH2CH=O,它是一种五碳醛，含有两个醛基。30％以上浓度的戊二醛易聚合，一般商品浓度在25％以下，含有较多杂质。新处理过的戊二醛为无色或很淡的黄色，贮存久时颜色会变深。由于戊二醛中醛基易氧化为有机酸，使PH下降。当PH下降至3.5以下时，就失去固定能力，需要纯化。纯化的方法有蒸馏及用活性炭处理等方法。活性炭提纯的方法是 在市售的戊二醛溶液中按每10ml／lg的比例加入活性炭，在4℃下摇动1h以上，然后过滤。测PH,在PH4以上即可使用。

如PH在4以下，可用活性炭重复吸附2次。此外，还可用碳酸钡吸附法提纯，做法是100ml戊二醛中加2g碳酸钡，摇动5～10min,然后过滤备用。
醛类固定剂固定后，一般需用四氧化锇进行二次固定，这就是迄今为止被广泛使用的双固定方法。戊二醛固定剂 具有下列优点：①它与蛋白质交联的能力是固定剂中最好的，也能固定糖元和核酸，对细胞内结构如微管等保存也较好，并能保存细胞内一些酶的活性，因此是保存精细结构最有效的醛；②戊二醛的渗透速度比四氧化锇要快些，且反应快；③戊二醛能够弥补四氧化锇固定剂的不足，对糖元、核酸，尤其是对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用，可以避免四氧化锇作原始固定剂可能产生的抽提作用；④戊二醛较适于进行超微细胞化学研究工作。
戊二醛固定的主要缺点是：①它不能固定脂质，致使其在以后的脱水过程中被有机溶剂溶去，因而不适于作为单独的电镜固定剂；②戊二醛不像四氧化锇那样能提供高反差，因此与四氧化锇复合使用，则可发挥两种固定剂的长处，互相弥补不足之处；③戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此它对缓冲液及其渗透压要求较高。
2．戊二醛固定液的配制 戊二醛固定液一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐缓冲液配制，而不能用醋酸－巴比妥缓冲液配制，因为后者会与醛基起反应而使醛基失效。
（1）磷酸缓冲的戊二醛固定液的配制：可按下表配制所需浓度的戊二醛固定液。
0．1M磷酸缓冲的不同浓度戊二醛固定液配制表
戊二醛最终浓度（％） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0　
0.2mol/L磷酸缓冲液（ml） 50 50 50 50 50 50 50
25％戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12 16 20
双蒸水加至(ml) 100 100 100 100 100 100 100
(2) 二甲砷酸盐缓冲的戊二醛固定液的配制：可按下表配制所需浓度的戊二醛固定液。
0.1mol./L二甲砷酸盐缓冲的不同浓度的戊二醛固定液配制表
戊二醛最终浓度（％） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液（ml） 50 50 50 50 50
25％戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12
双蒸水加至(ml) 100 100 100 100 100
（三）多聚甲醛和多聚甲醛固定液
1.多聚甲醛 用于光镜固定的甲醛 不能用作电镜固定。市售的37％～40％的甲醛水溶液俗称福尔马林，内含10％～15％的甲醇作为稳定剂并且含有微量的甲酸。甲醇和甲酸对保存组织细胞的微细结构不利，会影响固定效果。电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。多聚甲醛经水溶解后，解聚为甲醛溶液，不含上述有害成分。多聚甲醛的优点是能和蛋白质、脂类、核酸等起反应，并能保存部分

细胞内酶的活性；多聚甲醛的分子很小，因此穿透组织的能力很强，对固定致密的组织以及较大的组织尤其适合。此外，多聚甲醛还有价格低、使用方便的优点。但甲醛只有一个醛基，反应速率较慢，与组织形成的交联数目比戊二醛固定液少，导致甲醛固定液的微细结构的保存和组织反差不如戊二醛固定液。所以多聚甲醛固定液一般多用于组织化学或快速固定。在样品处理过程中，一般用多聚甲醛固定液作前固定，以后再用四氧化锇作后固定，能取长补短，效果较好。也可与戊二醛同时进行混合固定，效果更好。
2．多聚甲醛固定液的配法
（1）4％多聚甲醛固定液：4g多聚甲醛粉末，加50ml双蒸水，放在三角烧瓶中80℃水浴，同时不停摇动，待溶化成乳白色时，加1mol／LNaOH3～4滴，边加边搅拌，直至溶液全部透明清晰。冷却后过滤，加50ml 0.2mol/L磷酸缓冲液，测PH，放冰箱保存备用。
（2）多聚甲醛和戊二醛混合固定液（按Karnovsky方法）：溶解2g多聚甲醛于25ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1～3滴1mol/LNaOH，使溶液澄清。冷却后加10ml 25％戊二醛，再加15ml 0.2mol/L磷酸缓冲液，调PH备用。此固定液中含多聚甲醛4％，戊二醛5％，属高渗液，但固定效果不错，尤其对细胞内的微管保存较好。在实际应用中，多聚甲醛和戊二醛的浓度还可根据需要调节使用，一般常规使用2％多聚甲醛、2％戊二醛混合固定液，免疫电镜使用4％多聚甲醛、0.5％戊二醛混合固定液。
（四）其他固定剂及其固定液
1．高锰酸钾和高锰酸钾固定液 除了上面三种常用的固定剂外，还有其他的固定剂，可根据实验需要选用。如高锰酸钾，主要用于保存细胞的膜性结构，对质膜、内质网及髓鞘等结构保存良好，其他结构则保存很差，一般用1.3%浓度，配法如下：
醋酸巴比妥缓冲液 12 ml
高锰酸钾 1.3g
双蒸水加到 100 ml。
此液不稳定，临用时现配。
2．钌红和钌红固定液 钌红固定剂的优点是对脂质的固定效果较好，特别是在对肺泡表面活性物质的染色方面，应用很广。
五： 影响固定效果的因素：固定是一种复杂的化学过程，固定液的PH。离子组成与渗透压，固定时的温度、时间与方式以及组织块的大小等因素都能影响固定的效果。在实际工作中根据不同的组织选用适当的固定液和固定条件。
1 ．固定液的pH 蛋白质是一种两性化合物，其相对分子质量以及其他理化性质与溶液的pH密切相关，固定液的pH 将影响细胞中原生质的组成、膜的选择性及酶的活性。固定液的pH必须接近固定组织的pH，这样可以使细胞避免由固定液所造成的蛋白质结构和性质

的变化。大部分动物组织的平均pH为7.4，细胞精细结构最适固定pH范围在7.2～7.4之间。对于不同性质的组织，如原生动物、海洋无脊椎动物及胚胎组织等，用pH8.0～8.4的固定液可获得较好的固定效果；对于胃粘膜，在pH8.5时固定效果较好，因为在这种pH下，胃蛋白酶的水解作用受到抑制；植物细胞用pH6.8～7.1的固定液，固定效果较好。总之，对于不同的材料，固定液的最佳pH应通过试验来确定。由于细胞的自身缓冲能力很有限，如果没有外加的缓冲液，在固定的过程中，组织将不断的酸化。因此，为了恒定固定液的pH，还需要选择适当的缓冲系统。
2. 固定液的浓度 ： 一般来说，较低的浓度需要较长的固定时间，这就容易引起酶的扩散、细胞物质的抽提及组织的肿胀。较高浓度的固定液也是不合适的，因为较高浓度的固定液容易毁坏酶的活性和细胞的精细结构。尤其是氧化固定剂，如锇酸和高锰酸钾，只有在适当的浓度下，才是有效的交联剂，较高的浓度就会造成蛋白质分子的断裂。低浓度的甲醛会毁坏内质网的结构，而线粒体对固定剂的浓度变化不敏感，但它对缓冲系统的渗透压变化敏感。戊二醛固定剂的常用浓度范围是1％～6％，而锇酸用1％～2％。含水较多的组织，一般需要较高的固定浓度。
2. 固定液的渗透压及离子组成 ： 一般来说，低渗的固定液容易引起组织肿胀，而高渗的固定液容易造成组织的收缩。为了调节固定液与组织的渗透压平衡，固定液中常加入钾、钠、钙盐等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质。尤其是高度液泡化的植物组织，由于液泡液的释放，使细胞突然失去充填而导致细胞膜断裂，如果在固定液中加入适当的葡萄糖或蔗糖，则固定效果明显改善。但也有人认为调解渗透压平衡是不必要的，因为渗透压平衡只存在于活细胞中，细胞一旦和固定液接触，即被固定并死亡，因此失去了渗透压平衡调节的能力。
固定的效果不仅受pH影响，而且也受缓冲液所存在的离子类型的影响。固定液中加有两价阳离子，可以减少细胞内物质的抽提，例如固定液中加0.01mol/LCa2+可以抑制血红蛋白的抽提并稳定红细胞,而Na+则没有这种稳定效果。应该注意的是Ca2+与Mg2＋在蛋白质胶体化期间容易产生颗粒性和不透明性，因此，通常只能采用较低的浓度。
4.固定的温度和时间 为了降低酶的活性、减少细胞自溶及胞内物质的抽提，大部分组织通常是在0～4℃下固定1～4h，但细胞中的微管与微丝应在室温下固定。较高的温度可以增加固定剂与细胞组分之间的化学反应速度，并增加固定剂渗入组织的速度，但与此同时，细胞的自溶

也加速。低温可以减少物质抽提和降低细胞自溶的速度。由于化学固定所引起的物质的抽提是随时间逐渐进行的，因此，过渡的固定可能丢失更多的物质。锇酸固定的时间比戊二醛更严格。
5.固定方式 在体内条件下，固定速度较快、深度较深。例如，大鼠肾脏用1％锇酸灌流固定时渗透速率是20μm/min,固定深度为100～200μm；而体外固定的速度是8μm/min，固定深度为30～40μm。因此，从固定效果看，体内原位或灌流固定效果最好。
　6. 组织块的大小 固定作用通常是不均匀的，从组织块的表层到深部，存在着固定梯度。表层有高浓度的锇的沉积，但这一层的机械损伤较大；中心部位虽然无机械损伤，但往往固定不足。因此，在这两层之间的那一部分组织是比较理想的。一般来说，锇酸的均匀固定大约在0.25mm的深度，因此组织块的大小最好在0.5mm3左右（戊二醛固定时可稍大些。由于某些原因，样品不能切成小方块时，应该切成约0.5mm或更薄的切片。实际操作中，组织块容易偏大，这是常见固定失败的原因之一。
固定是标本制备过程中极为关键的一步，也是一种复杂的化学过程。某种组织应用哪种固定液、用哪一种缓冲介质、用多少浓度、固定液的pH值及固定的时间和温度等，都要经过预试验。其中的每一个因素都会影响固定的效果。

第五节 漂洗与脱水
组织固定后，应用漂洗液洗去残留的固定液，尤其是用醛类固定液固定后，一定要充分漂洗干净，一般需漂洗5次以上，漂洗时间为2h或过夜。这是因为醛会和锇酸起反应，产生细而致密的颗粒沉淀在样品中，又会造成样品污染。此外，由于锇酸亦能和乙醇作用，产生沉淀，因而用锇酸固定后，也应把多余的锇酸固定液漂洗掉，但洗的时间可短些，10～15min剂可。常规电镜样品所用的漂洗液一般是0.1mol/L磷酸缓冲液，其温度与固定液温度一致，为4℃，但时间不宜过长。
漂洗后的组织块还需进行脱水处理。除了极少数水溶性包埋剂外，绝大多数包埋剂都是不溶于水的。脱水的目的是用能与水和包埋剂相混溶的有机溶剂，即脱水剂，除去组织块中所有的游离水，使得包埋剂能均匀渗透入组织块内；同时也是为了获得清晰的电子图像。脱水时间要适当，不能太长，而且脱水剂的浓度应按梯度增高，以免过快地脱水在组织成份中引起剧烈的渗透改变，导致结构出现较大破坏。每级脱水的具体时间应视样品的性质和大小而定。
常用的脱水剂是乙醇和丙酮。乙醇对脂质及蛋白质的抽提作用比丙酮小，不易吸水，而丙酮较易吸水，故应在无水丙酮中加入适量无水硫酸钠等吸水剂。丙酮能与环氧树

脂互溶，所以常采用先酒精后丙酮的脱水方法，浓度梯度依次为30％、50％、70％、90％酒精，90％、100％（3次）丙酮，每次10～15min。若当天不能完成浸透等操作步骤，样品可以放在70％脱水剂中保存，千万不能放在无水乙醇或无水丙酮中过夜，否则脱水过度会引起更多物质被抽取，并且会使样品变脆，影响切片。脱水过程中应注意两点：一是脱水要充分，脱水不完全会导致渗透不完全，造成切片困难，还会造成组织和细胞受损；二是更换脱水剂时动作要快，尤其是换无水乙醇和无水丙酮时，不要使样品干燥，否则样品内易产生小气泡而影响包埋剂的浸透。
第六节浸透与包埋
组织在脱水后，要用一种常温下为液态、经过加温聚合后具有一定硬度的介质对其进行处理，使处理后的组织有适当的硬度和良好的切割性能。这种介质就称为包埋剂。通过脱水剂稀释包埋剂，并最终以包埋剂完全取代脱水剂，使其渗透到组织块中的过程就是浸透。而将浸透好的组织块放在适当的模具中并灌入包埋剂，再加温聚合成硬块的过程就是包埋。
一、 理想的包埋介质应具备的条件
样品若没有得到良好的浸透和聚合，超薄切片就将失败。而包埋块的硬度和弹性应当适中，否则很难获得理想的切片。因此选择适当的包埋剂尤为重要。
理想的包埋介质应具备的条件是：粘度低，容易浸透入组织块；对细胞成分抽提少，精细结构保存良好；能和脱水剂混溶；聚合均匀，硬度一致，聚合前后体积变化小；聚合后有良好的切割性，组织切片易被染色；性质稳定能经受电子轰击，高温下不易升华、变形；透明度好，本身在电镜的高倍放大下不应显示任何结构；软硬度易调整，易操作，毒性低。
二、 几种常用的包埋剂及其配方
根据上述条件，多年来应用于电镜技术的包埋剂有很多种，主要有环氧树脂、聚酯树脂和甲基丙烯酸酯，各有长处。国内比较常用的是下列几种环氧树脂，如国产环氧树脂618、EPOn812及低粘度Spurr环氧树脂。
环氧树脂包埋剂对细胞精细结构保存好，制成的切片性质稳定，在电子束轰击下不易升华、变形。有些型号的包埋剂不需要支持膜就可以进行捞片并观察。
㈠Epon812环氧树脂
Epon812环氧树脂是一种性能良好的包埋剂，为淡黄色、低粘度的甘油及脂肪族环氧树脂。在25℃时，其粘度小于200厘泊，因此，它易渗入组织，对细胞结构保存好，其切割性能好，易得到大面积的切片，有利于无支持膜载网的应用，便于捞片。制得的切片组织结构细，染色性能好，反差好，抗电子损伤强，用电镜观察时切片不易毁坏。Epon812环氧树脂对包埋的条件要求高，

对湿度要求严格，单体及聚合物均宜贮存于干燥处，操作也应于干燥箱内进行，配制时应充分搅拌，否则，包埋剂硬度不均匀，切片上易出现 震颤损伤，即出现搓板样的平行条纹。
Epon812的配方有多种，一般均沿用Luft1961年的配方，即
A液：Epon812 62ml
DDSA(十二烷基琥珀酸酐) 100ml
B液：Epon812 100ml
MNA(甲基内次甲基四氢邻二甲酸酐) 89ml
A液和B液按一定比例混合后，再逐滴加入1.5％的DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基）苯酚），边加边搅拌，要搅拌充分，否则得到的包埋块硬度不均匀。A液和B液的比例一般为：冬季2：8。，夏季1：9。为了配制方便，也可把配制包埋剂的体积比换算为重量比。以A:B是2：8为例，配制10ml左右的包埋剂，其比例是：
DDSA 1.4g
MNA 4.5g
Epon 6.2g
充分混匀后，逐滴加入0.15mlDMP-30，再搅拌10min。
配制时，在有机玻璃操作箱中进行，箱内相对湿度保持在25％以下。由于各批环氧树脂的性能略有差异，所以更换新试剂时需做实验，如配方不合适应及时调整。
㈡环氧树脂618
环氧树脂618是国产环氧树脂，为淡黄色粘稠液体，能较好保存细胞超微结构，切割性能不错，但切片要用支持膜，粘度较大，在40℃时粘度约2500厘泊，渗透到组织块中的速度较慢。配方如下：
环氧树脂618 6ml
DDSA 4ml
DBP(苯二甲酸二丁酯) 0.3～0.8ml
DMP-30 0.1ml
由于618粘度大，配制时应先放入60℃温箱内加温，使其粘度降低，量取所需量，依次加入其他几种试剂，边加边搅拌，充分搅拌后置于37～40℃温箱内排出气泡，即可用于浸透包埋。
三、 浸透与包埋的具体操作
㈠浸透
组织块在用乙醇和无水丙酮（或环氧丙烷）脱水后，用包埋剂与无水丙酮（或环氧丙烷）按一定比例混合，逐渐渗透入组织块，取代乙醇。若包埋剂渗透不完全就会影响切片的质量和性能。一般组织块渗透过程如下：
无水丙酮或环氧丙烷：包埋剂＝1：1 1～2h
无水丙酮或环氧丙烷：包埋剂＝1：2 3h或过夜
纯包埋剂 1～3h
对皮肤等含很多致密结缔组织的标本要适当延长渗透的时间，而单层培养细胞等可缩短浸透时间。
㈡包埋及聚合硬化
浸透完成后就进行包埋。取药用空心胶囊（一般为4＃透明胶囊）或特制的锥形塑料囊或多孔橡胶模板作包埋块的模子。包埋前先将胶囊或模板及标签置于60℃温箱中1～3h烘干进行包埋。包埋时有些组织要注意定位、切向问题，如肌肉是准备横切或纵切，皮肤、粘膜、血管、神经等组织是切横断面还是切纵切面等，取材时就应按需要将组织切成长条或特定形状。包埋时选用扁平的橡胶模板，注入包埋剂，将组织块按所需切的一端对

准尖端进行包埋。
组织块包埋好后，放在干燥器里置于温箱中聚合。Epon812、环氧树脂618可置于37℃12h或过夜，60℃温箱聚合，时间为1～2d；Spurr树脂放在70℃温箱8h即可。总之，要使包埋剂完全聚合，才能有均匀的硬度，否则会导致切片困难。
第七节 修块与定位
一、 修块
修块是成功切出理想连续切片的关键。通常采用手工修块，将已聚合的环氧树脂包埋块放入专用的样品夹中，在解剖显微镜下用单面刀片修去其顶端和组织周围多余的包埋介质，成金字塔形（四面锥形体）。
二、 定位
由于超薄切片的面积极小，为了在电镜观察时容易找到所希望观察的部位，进行超薄切片前，必须先定位。将修好的组织块在超薄切片机上先切成1um的半薄切片，也称厚片，在载玻片上滴一滴水，将厚片放在水滴上，60～80℃下烫平烤干，，在显微镜下观察，找到所需的部位，再将包埋块放在解剖显微镜下借反光寻找出与厚片相对应的地方，把表面修成梯形或长方形，所需观察的部位应尽量定在梯形或长方形的中间。
三、 半薄切片染色
半薄切片的观察很重要，必要时可进行染色，染色时不必除去包埋剂。染色的方法很多，如用姬姆萨染色或1％甲苯胺蓝液染色均很好。
第八节 超薄切片
包埋块修整定位好后就进入超薄切片阶段了。要获得高质量的电镜照片，切片必须是超薄的，厚度均匀，表面平整，无震颤、无皱褶和无裂痕，且能耐受高真空和电子束轰击。影响切片质量的因素很多，有切片机的性能、切片刀的质量、包埋块的切割性能等。
一、 超薄切片机的简单原理
超薄切片机是用来将已包埋在环氧树脂中或已冷冻固定的生物样品制成纳米（nm）级厚度薄样品的专业机器。超薄切片机从进刀原理构成上可以分为两大类：一类是以热膨胀为主的切片机；另一类是以机械推进为主的切片机。由于超薄切片机的进刀精度要求极高，因此，在20世纪70年代前生产的超薄切片机为热膨胀式，80年代开始，超薄切片机向机械推进式过渡，目前的超薄切片机已大多为机械推进式了。
1、 热膨胀式超薄切片机 该类型超薄切片机的进刀控制有对热极为敏感的金属材料控制，当对其加热时，该金属规则膨胀，使切片机刀口缓慢向前推进。
2、 机械推进式超薄切片机 该类型超薄切片机的进刀以机械推进的方式进行。由于采用了高精度的机械推进装置，使进刀的稳定性大大提高，摒弃了热膨胀式超薄切片机由于温度不稳定而带来的切片质量不易控制的缺点，如再能配和使用钻石刀，则超薄切片的质量能够达到理想的程度。
二、 载网
超薄切片需捞在特制的载网上才

能在电镜上观察。制作载网的材料大多是铜，因此习惯上将载网称为铜网，不过制作载网的材料还可以是金、银、镍、铝 、铂、及尼龙。载网的大小随电镜的需要而不同，一般直径为3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形及狭缝形等，网孔有50、100、200、300及400目等多种规格，常用的是200目和300目，视研究的目的选用不同的载网。新的载网在使用前也需清洗，一般是用丙酮洗几遍，然后再用无水乙醇洗几遍，除去铜网上的油污，或是浸在乙醇中用超声波清洗，烘干后即可使用。
三、 支持膜的制备
有些超薄切片（如以环氧树脂618为包埋剂的切片）需要捞在覆有薄膜的金属或非金属载网上，这层薄膜就成为支持膜。其厚度一般为12nm，粘附于载网上，以支持切片或其他微小样品。制作支持膜所选的材料要求具有透明、本身在电镜下无可见的结构及在电子轰击下有高度的机械稳定性3个基本条件。常用的支持膜有火棉胶膜、弗姆瓦（Formvar，聚乙烯醇缩甲醛）膜及碳膜。

1，弗姆瓦膜： 弗姆瓦的化学成分为聚乙烯醇缩甲醛。用氯仿或0 .2%～0.5％的溶液，用玻片法制膜。制膜时要注意干燥，防止水气凝结在膜表面，否则会使膜上形成许多微小的空洞；另外要注意清洁，防止空气中微小尘埃污染膜的表面，影响膜的质量。弗姆瓦膜的机械强度比火棉胶膜好，不容易被电子束击破，因此它是目前最常用的电镜样品的支持膜。2：火棉胶膜。3：碳膜：观察高分辨率的样品需要用碳膜，因为碳膜的械性能及化学稳定性均优于火棉胶膜和弗姆瓦膜，它可以减少样品的热漂移，增强其稳定性。但有脆性，易碎。其制作方法是：在高真空喷度仪中，将两碳棒加热，使碳粒子蒸发出来，喷镀在玻片上或火棉胶膜上。
四 ：超薄切片刀的 类型，制备及使用
用于超薄切片的刀主要有两种：一种是玻璃刀，另一种是钻石刀。另外还有一种是喷钨刀，它是玻璃刀的改进型。下面分别介绍这三种刀。
1，玻璃刀的特点是制作方便，来源丰富，价格低廉，但刀刃太脆，不耐用，易风化，必须随用随做，不能保存，而且切过一次后不能重复使用。制备玻璃刀的材料应选用硬质玻璃，含硅量在72％～75％以上，内应力较小，侧面观应透亮呈微黄或微绿色，内部不含杂质或小气泡，厚度为4～6mm。制刀时，先将玻璃条洗净、擦干，再放到制刀机上，裁割成正方块，然后沿着略微偏离对角线的方向按45°角裂开,制成两块玻璃刀；亦可采用不同角度的菱形裂成不同大小的刀角,小角度的刀较大角度的刀锋利,但耐固性较差.刀制成后先肉眼观察,挑选角度好、刀刃直的，然后放在切

片机上用聚光灯进行检查，好的刀刃应是一条光滑的亮线。选择好玻璃刀后，再按上一个小液槽，液槽可用胶布制作，也可用蜡将塑料或金属制成的液槽封牢在玻璃刀上，槽的上缘与刀口平齐，以便切片时往里注入槽液，使切下的薄片漂浮在液面上伸展平整。玻璃的厚度就是刀刃的长度，用于超薄切片的刀刃一般在玻璃刀的中左端部分，往往只占刀刃总长度的1／3。2，喷钨刀的制备及使用：用真空蒸发方法在玻璃刀的刀口及两侧镀上一层金属薄膜，从而改进了玻璃刀刀口的切割性能。3，钻石刀的使用：
对于生物电镜工作者来说，超薄切片技术是最重要、也是最难掌握的技术之一，其关键就在于生物样品的多样性及在制作过程中，由于技术不稳定使已制备的生物样品软硬不一，再加上切片室温度和湿度不易控制及玻璃刀易破损等原因，导致切片质量及切片速度难以控制，大量的时间浪费在换玻璃刀上。
钻石刀的出现，给生物样品制备带来了方便，由于钻石刀极为锋利坚硬，能够迅速切得高质量的生物切片，节省了大量时间。但钻石刀极为昂贵（钻石刀价格以刀口宽度而定，1万元人民币／mm刀口），因此，使用时要极为小心，一旦操作失误，伤了刀口，将带来巨大损失。
目前，性价比较高、质量上乘、制造工艺理想可靠、在我国使用较多的钻石刀首推瑞士Diatome公司（戴通公司）生产的钻石刀，Diatome公司生产的钻石刀品种较多，基本已满足各种生物制样的要求。
五：超薄切片
㈠对刀与切片
完成各项准备工作后就可以切片了。将定位好的包埋块夹在样品夹上，固定在超薄切片机样品定向头中，固定时使组织块切面放正，再将装好液槽的玻璃刀安装在刀台上，并于刀台的标尺等高，间隙角即刀背与标本的夹角为2°～5°。在解剖显微镜下进行对刀，使标本的梯形上下底边与刀口平行，慢慢移动刀，使其尽量靠近标本。
对好刀后，在液槽内注满蒸馏水或15％乙醇，调整好切割速度，开启自动切片按钮，选择适当的切片厚度，即可观察到切下的薄片漂浮在液面上。如果刀锋利，包埋块的硬度和韧性适当，组织定位的好，就可以切出连续均匀的薄片。
㈡切片厚度
由于超薄切片机切下的片子很薄，很难测量其厚度，因此，一般利用切片表面反射的光和从切片下面反射光发生干涉所产生的干涉色来判断切片厚度，厚度不同的切片在显微镜下呈现的干涉色也不同。用树脂包埋的切片，其干涉色与厚度的关系如下：
　灰色：40～50nm；银白色：50～70nm；金黄色；70～90nm；紫色：90nm以上。
　灰色和银白色切片较薄，可在一般透射电镜下观察，

分辨率较高，但反差小。金黄色切片较厚，分辨率低，但反差好，故有时亦可用于电镜观察。紫色切片很厚，一般不用于电镜观察。
（三），切片收集
漂浮在槽液上的切片必须收集到载网上才能观察，而收集切片的两个重要要求就是切片必须在载网中心及切片不互相重叠。收集切片的方法有多种，常用的有贴片法和捞片法。
　贴片法就是将所要切片用眉毛针轻轻拨到一起，再将载网上有支持膜的一面朝下，从上向下对准切片带轻轻压下去，一接触到切片就提起，不能压得太深，然后用滤纸吸干槽液。此法较简单，但切片的边角容易翻转重叠，大的切片易被弄皱。捞片法是将载网伸向液面下方，对准聚集在一起的切片或切片带由下至上轻轻提起，使切片漂在载网中央，小心地用滤纸吸干水。此法难度较大，但捞起的切片比较平整。要求载网必须洗干净，具有亲水性。将收集了切片的载网保存在洁净的培养皿中准备染色。
第九节 超薄切片染色
生物标本本身的反差极低，需要经过染色才能在电镜下显示清晰的结构。染色的目的就是增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构和成分。超薄切片的染色是一种“电子染色”，它只显现黑白的对比。
一、 染色原理及染色液
电镜图象的反差实质上是电子密度的差异，它是由于样品不同部分对电子束的散射能力不同而形成的。散射的电子数越多，图象越暗；反之，散射的电子数越少，图象越亮。超薄切片染色就是利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使细胞内各结构对电子产生强散射能力，从而增加反差。
超薄切片常用的染色液有铀盐和铅盐，在铅盐中有二铅和三铅。为了得到最好的反差效果，往往铀铅复合使用，先染铀后染铅。
1醋酸铀（uranyl acetate） 用醋酸铀配制成0．5%～5%的水溶液，呈淡黄色，亦可用低浓度酒精配制。它能和细胞内大多数成分结合，主要是提高核酸核蛋白和结缔组织纤维成分的反差，对糖原分泌颗粒和溶酶体等也能染色，但对膜结构染色效果较差。醋酸铀有轻微放射性，使用时应注意防护。
2枸橼酸铅（lead citrate）枸橼酸铅为二铅，具有很高的电子密度，对细胞超微结构有广泛的亲和力，能提高细胞膜系统及其脂类的反差。其配制方法是：
硝酸铅（高纯） 1．33g
枸橼酸钠 1．76g
双蒸水 30ml
放入容量瓶中猛摇2min，然后断断续续地振荡30min,溶液呈白色混悬液，加1mol/LNaOH8ml,可见混悬液逐渐变澄清，再加双蒸水至50ml，PH调至12，其中双蒸水应先放在三角烧瓶中煮沸5min,除去二氧化碳。容量瓶口应密封，因为铅染液与空气中的二氧化碳

接触会形成不溶性碳酸铅沉淀。
二、染色方法
常规超薄切片制备中常用的染色法是醋酸铀－枸橼酸铅双染法，染色的方式有多种，下面先简单介绍传统的染色方法。
将1片洁净的牙科蜡片放在培养皿中，滴一滴过滤的醋酸铀染液到蜡片上，再将带有切片的载网覆盖在染液上，使有切片的一面与染液接触，染色时间30min，染好后用蒸溜水将切片洗净吸干，再覆盖在用同样方法滴在另一洁净蜡片上铅染液上，有切片的那面与染液接触。铅染色时应严格控制染色时间，5～7min即可，防止过染。同时应尽量减少暴露在空气中的时间，并可在培养皿周围放些氢氧化钠结晶，以免铅染液与空气中的二氧化碳形成沉淀，污染切片。
此外，在传统染色方法的基础之上，还进行了很多技术改进。下面简单介绍两种改进的染色方法。
一种是制作一个专用的染色装置。该装置为带有槽沟的普列克斯玻璃组装成的染色盒，染色盒具有进液及出液装置。进液装置由三道阀门控制，通过它可向染色盒输入染液或双蒸水，染液及双蒸水用后又可通过出液装置排出染色盒。染色时，带有切片的载网嵌在槽沟中，上面覆以薄膜固定再分别注入染液、双蒸水，进行染色及漂洗。这样，载网在一个封闭的环境中染色，能减少污染。另外，多个载网可以同时进行染色，节约染液（20张载网染液用量约为3ml），并提高了工作效率。这种方法对覆有支持膜的载网尤为有利，因为对载网的操作很少，支持膜与载网能保持紧密接触，不易脱落。另一种方法是我室采用过的更加简单的方法，将带有切片的载网放入载网存放板中，然后将此载网存放板放入干净的培养皿中，加染色液染色后，再更换双蒸水漂洗。这样，也可以提高效率，而且所需器皿简单易得。
染色是整个超薄切片技术的最后一步，染色好坏直接在电镜观察中受到检验。不过，前面标本制备时所用的固定液、缓冲液、包埋剂等的种类以及染色液的浓度、PH值等等,均会影响染色的结果,因此,超薄切片技术的每一步都是非常重要的,环环相扣,每个环节出问题都会影响最终的结果.