第一章 生命大分子物质制备.

二、提取溶剂选择原理
1、极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于 非极性溶剂； 2、碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱 性溶剂； 3、温度升高，溶解度加大； 4、远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度 的增加和保持其生物活性。
三、 影响因子
1、缓冲液（buffer)的pH：提取蛋白质时应远离其 pI 的 pH 条件下进行，以不危及蛋白质的化学属性,并 使其有良好的溶解性。故酸性蛋白选择高的pH，碱 性蛋白质选择低的pH。
2.自溶法：细胞结构在自身所具有的各种水解酶 （如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细 胞内含物释放出来。
3.化学溶剂、表面活性剂处理：利用氯仿、甲苯、 丙酮等脂溶性溶剂或SDS等表面活性剂处理细胞， 可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂。
第四节 提取与分离
一、定义
提取是利用适当的方法，适当的溶剂，使有效 成份充分释放到溶剂中，即由固相转入液相或从 细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
备方法的通用性差。
四、生物大分子分离提纯的基本程序
1、前处理：将欲分离的生物大分子组分从原来的 组织或细胞中以溶解的状态释放出来。
2、粗分级：选用一套适当的方法，将所要的成分 与其他的杂质成分分离开来。
3、细分级：将粗分级后的样品进一步地提纯。 4、结百度文库：样品（如蛋白质）分离纯化的最后步骤
及最终结果。
二、物理法
1.超声波法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞 器。（微波法） 2.反复冻融法：形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度，使 细胞发生溶胀、破碎。 3.溶胀：由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 4.急热骤冷法
三、生物及生物化学法
1.酶降解法：利用各种水解酶（如溶菌酶、纤维素 酶、蜗牛酶和酯酶等），于37℃，pH8，处理15 分钟，可以专一性地将细胞壁分解。
第一节 材料的选择与处理
一、有效成份：指欲纯化的某种单一的生命 大分子物质。
二、选材的原则：遵循有效成份含量多、稳 定性好；来源丰富；提取工艺简单；有综合 利用价值等原则。
三、材料的处理：目的是去除影响有效成份 的杂质，要求保持材料的活力，保持提取率 高。
材料的处理方法
（一）动物脏器的处理： 1.冰冻：去除脂肪及结缔组织，迅速冰冻； 2.干燥：经过脱水、干燥条件下保存样品；
第五节 样品的浓缩
定义：当有效成份浓度太低，体积较大时，用适当 的方法，使其浓度加大，体积缩小的过程。
方法： 中性盐沉淀法 超过滤法 吸附法 减压蒸馏法 透析法 冷冻干燥法
样品透析浓缩
对浓缩样品的考虑
保护样品的生物活性，因此除了减压蒸馏浓缩法 外，其余的浓缩方法均应在摄氏4℃进行;除特殊 的例外。
在操作过程中保持样品有相对高的回收率。 时间的考虑，在尽可能短的时间里完成。 样品的分子量与方法及工具的匹配。
六、冷冻真空干燥
冷冻真空干燥又称升华干燥，除利用真空干燥原理 外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸气 压力随温度的下降而下降，故在低温低压下，冰很 容易升华为气体。
操作时，一般将待干燥液体冷冻到冰点以下，使水 分变成固态冰，然后在低温(-10—-50℃)，高真空 度13.3—40Pa时，将溶剂变成气体直接用真空泵抽 走。
2.液态保存 对保持生物大分子活性是不利的，
故只在一些特殊情况下采用，并需要严格的防腐保 护措施，保存时间也不宜过长。
常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白质和 酶常用的稳定剂有硫酸铵、蔗糖、甘油等，某些金 属离子如钙、镁、锌等对某些酶也有一定的保护作 用。液态核酸可保存在缓冲液中。大多数生物活性 物质液态保存时，在0—4℃冰箱即可。
生物大分子分离纯化的一般步骤
生物组织→无细胞提取液→粗产品→
层析法
电泳法 超离心法
→ 结晶
超滤
│←前处理→│←粗分级→│←细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破碎、 溶涨和自溶、酶解、化 学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等电点沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
四、生物物质制备的基本过程
材料的选择与处理 确定测定方法 有效成份的抽提 粗制品的纯化 纯化产品的分析与鉴定（定性与定量）
二、方法
定性和定量；或是为了求得更多更纯的产品；或是 为了获得新的物质。 1、生物测定方法： 全面涉及生物学各科的实验内容 2、理化测定方法：色谱法、光谱法、电泳法、电化 学法
3、生化测定方法：生物学与物理化学方法二者 结合使用。 鉴定方法应是： 特异性强、重现性好、准确度 大、灵敏度高、手续简便。
2、离子强度：适宜用等渗溶液 3、金属离子螯和物：加入EDTA、EGTA防止沉淀产生 4、水解酶：加入蛋白酶抑制剂 5、氧化：加入还原剂HS-OH、DTT 6、温度：大多数适合低温操作，利于保存、稳定生物
活性
蛋白质的提取
水溶液提取：能溶解于水、稀酸、稀盐、稀碱缓冲 液的蛋白质
有机溶剂提取：利用有机溶剂的亲水性和亲脂性提 取脂蛋白(与脂质结合的、含非极性侧链较多的蛋白 质和酶,不溶于水)
DNA，RNA，蛋白质和酶等不宜在O℃以下保存，因为 溶液结冰会造成大分子构象破坏，使其失活。
生物大分子和各种生化制品的保存，总的来说，温 度和水分是影响稳定性的两个重要因素，其次是各 种稳定剂的应用是否适当，关系也很大。实际应用 时，必须对各种影响因素都加以考虑。
第六节 纯化方案的设计与评价
2．浓度 溶液愈浓，就愈容易结晶，若在过饱和的 溶液中结晶，杂质含量多，且晶形也不好，故样品 浓宿至一定浓度或所得沉淀溶解至合适浓度后，
缓慢地加入盐溶液或有机溶剂至呈现微弱浑或略 处于过饱和状态，然后放置在一定温度下，待其 静止地、慢慢地析出结晶，此时才酌情补充加人 少量的盐或有机溶剂使其结晶完全。如加入的盐 或溶剂过多，沉淀出来的不是晶体，可逐滴加入 蒸馏水或对水透析，促使沉淀转化为结晶。
细胞破碎的方法介绍
一、机械破碎
1.研磨法 将剪碎的动物组织置于研钵中，加入少 量石英砂研磨 2.组织捣碎器法 较剧烈，用10000－20000r/min的 内刀式组织捣碎机将组织的细胞打碎 3.压榨法 条件温和，彻底破碎细胞，用1.77－ 3.54×108 Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一 小孔 4.匀浆法
第一章 生命大分子物质制备
Preparation of Life-Molecules
概述
一、生命大分子的概念
生命大分子是指生物机体（动物、植 物和微生物）经过新陈代谢产生的蛋白 质（多肽、酶类）核酸、糖类以及它们 的复合物。
二、生化分离制备方法基本原理
各种方法的基本原理基本上可归纳为两个方面： 1、根据混合物中几个组分分配系数的差别将它们分
1．干粉保存 干燥的制品一般比较稳定，如制
品含水量很低，在低温情况下，生物大分子活性可 在数个月甚至数年没有显著变化。
储藏方法很简单，只将干燥后的样品置于干燥器 内(内装有干燥剂)密封，在O一4℃冰箱中保存即可。 有时为了取样方便和避免取样时样品吸水和污染， 可先将样品分装成许多小瓶，每次用时，只取出一 小瓶。
阴离子表面去垢剂:SDS、脱氧胆酸钠等具有溶解 病毒蛋白质外壳,细菌表壁蛋白质的作用,使核酸 释放游离于溶液中;
蛋白质变性剂:酚-氯仿抽提,破坏蛋白质的结构, 使核酸得到分离. 例:DNA的分离; RNA的分离
四、选用方法的考虑因素
1.利用样品组分之间的溶解度差别进行分离：硫酸铵 或乙醇分级沉淀方法
一. 纯化方案的设计
纯化方案是由几种纯化方法组成的，故在设计 纯化方案时，首先应确定纯化方法。即根据有效成 份和杂质之间理化性质的差异考虑设计分级分离纯 化的各种方法,依各方面的性质，难易程度，效率 的高低，分离体积的大小等诸因素的考虑，把各方 法排列成序，组成纯化有效成份的一套完整方案。
例：大肠杆菌碱性磷酸酶的制备纯化步骤
E.coli 菌种的培养 渗透压法破细菌 热处理80℃ 15分钟（除变性蛋白） 硫酸铵 盐析（浓缩蛋白质） DEAE—纤维素离子 交换层析（纯化蛋白质） 紫外检测 （U.V280nm） 合并吸收峰— 凝胶过 滤（除杂蛋白） 收集吸收峰（纯化的酶） 活力（活性）测定
二. 纯化方案的评价
对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每 一个纯化方法的评价。
此法干燥后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然 结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。
七、结晶
结晶是蛋白质分离的最后步骤，蛋白质和酶的结晶 条件如下：
1．纯度 蛋白质纯度愈高，就愈容易结晶。大多数 生物大分子第一次得到结晶后，仍可以进行多次重 结晶，每次重结晶纯度均有一定提高，直至恒定为 止。
三、常用的测定方法
（一）光谱法 1.吸收光谱法：测定核酸含量；测定蛋白质的含量及
纯度。 2.荧光法：在生化反应进行中含量低，吸收光谱法检
测不到时应用。 3.浊度法：悬浮液样品、培养液中细菌生长的浓度测
定。 （二）电化学法 （三）生物活性检测法 （四）免疫分析法
（四）免疫分析法 （五）生物传感器
各种核酸的浓度吸收曲线
2.利用蛋白质的分子大小差别进行分离：SDS-PAGE、 凝胶过滤等方法
3.根据不同电荷性质进行分离：离子交换、等电点聚 焦层析、毛细管电泳等方法
4.已制备有该产物的抗体进行分离：亲和层析、免疫 沉淀等方法
5.产物的浓缩：离子交换、亲和层析、透析、超滤、 冷冻干燥等方法 6.产物纯度的鉴定：上述方法2，3可用于对样品纯 度的鉴定，还有末端分析、质谱分析、反相层析、 活力反应等
八、样品的保存
保存方法与生物大分子稳定性及保持生物活性 的关系很大，生物大分子的保存可分为干粉和液态 两种。但不论是干粉或液态都应避免长期暴露于空 气中防止微生物的污染。温度对生物大分子的稳定 性和生物活性影响很大，故一般生物大分子物质都 在低温(O一4℃)保存，保存时间也不宜过长，否则， 会招致样品的变质或失活。
（二）植物组织：除腊去油脂，低温储藏－4～－30℃； （三）细胞、微生物：离心法收集菌体后，再进行后
续处理；分泌型的表达蛋白质、胞外酶则离心弃菌体 后对上清液的后续处理。
第二节 测定方法的确定
一、目的要求
追踪有效成份的去向，建立快速、特异、准确、灵 敏、简便及重复性好的方法，并经济的、能在小体 积内进行操作，尽量不需用昂贵的仪器。
DNA和RNA样品的纯度可根据 不同吸收值的比例进行判断, 蛋白质的吸收峰＝A280，纯净 DNA的在中性及稍碱性的PH时 A260/ A280＝1.8，纯RNA的比 例＝2.0
第三节 组织细胞破碎
定义：在不破坏有效成份的条件下，采 用适当的生物学、化学、物理学的方法， 对动物、植物、微生物的组织或细胞结 构进行破碎加工，除去任何不想要的组 织与成份，以便提取生物活性成份的过 程。
3．pH值 结晶的溶液pH值一般选择在被结晶的蛋 白质或酶的等电点处，可有利于晶体的析出。
4．温度 低温条件下，蛋白质和酶不仅溶解度低， 而且不易变性失活，温度可在4—10℃范围内选择。 5．晶种 蛋白质和酶不易结晶，如胰岛素往往加 入少量胰岛素晶体可导致大量结晶的形成，有时用 玻璃棒轻轻刮擦容器壁也可以达到此目的。
核酸的提取
性质特征: 核酸溶解于水,不溶解于有机溶剂。 核酸在细胞内与蛋白质形成DNP,RNP复合物。 DNP在1mol／L的 NaCl中溶解度大,在 0.14mol／L
的 NaCl中溶解度小; RNP在0.14mol／L的 NaCl中 溶解度大。根据上述特征将二者分开。
核酸与结合蛋白质的分离
配于两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、 层析、结晶等）。 2、将混合物置于某一物相中（固相或液相）外加一 定的作用力，使各种成份分配于不同区域，达到 分离目的（如电泳、离心、超滤等）。
三、生化分离制备方法的特点
1、生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、 游离形式、分泌型。
2、生物材料组成非常复杂，不断代谢变化。 3、有效成份在材料中含量极微。 4、生物材料离体后丧失生理活性。 5、分离制备的溶液各种参数难以控制。 6、一般采用温和的、多阶式程序。 7、材料来源、含量、存在状态、稳定性的差异，制