蜂胶对人牙周膜成纤维细胞的生长影响及安全性实验研究

蜂胶对人牙周膜成纤维细胞的生长影响及安全性实验研究

第一部分、蜂胶提取物对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖、分化的影响[目的]探讨蜂胶提取物对体外培养人牙周膜成纤维细胞(Human periodontalligament fibroblasts,HPDLFs)生长增殖、骨化分化的影响,寻找蜂胶对人牙周膜成纤维细胞促增殖及分化作用的最佳显效浓度,为蜂胶牙周局部缓释制剂的研究提供实验依据。[方法]采用组织块培养法进行HPDLFs的原代培养,取4～6代HPDLFs用于实验。分别加入不同浓度梯度的蜂胶提取物配制的水溶液8组,浓度分为150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml和400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml;100ng/ml碱性成纤维生长因子(Basic Fibroblast GrowthFactor,bFGF)作为阳性对照;含1%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM为空白对照。通过检测HPDLFs 的增殖(MTT法)、碱性磷酸酶活性(alkalinephosphatase,ALP)及骨钙素含量(osteocalcin,OC),观察不同浓度梯度蜂胶提取物配制的水溶液对HPDLFs的增殖和分化的影响,并对实验数据进行统计学分析。[结果]本实验条件下与空白对照组相比,250ug/ml、300 ug/ml、350 ug/ml、400ug/ml、450 ug/ml、500 ug/ml浓度的蜂胶提取物水溶液对促进HPDLFs的增殖有显著性差异(P＜0.05),450 ug/ml浓度作用最佳,优于阳性对照组(P＜0.05);与空白对照组比较250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml的蜂胶提取物水溶液均可提高碱性磷酶活性(P ＜0.05);250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml蜂胶提取物水溶液可以促进骨钙素的合成(P＜0.05)。[结论]在本实验条件下高浓度的蜂胶提取物水溶液能促进HPDLFs的增殖,低浓度的蜂胶提取物水溶液可促进HPDLFs向成骨方向分化。蜂胶有望成为一种有效的促进牙周组织修复、再生的局部用药。第二部分、蜂胶提取物的安全性实验研究实验一、粘膜刺激实验[目的]评价蜂胶提取物潜在的口腔粘膜刺激作用,为其进入临床应用阶段提供依据。[方法]参照《GB-T 16886.10-2000医疗器械生物学评价第10部分刺激与致敏试验》及《国际标准化组织7406技术报告牙科材料的生物学评价》中的方法。以平均体重为

2.1kg的大耳白兔为实验动物,常规麻醉后将浸湿蜂胶提取物的小棉球置于白兔的右侧腭粘膜15min,左侧腭粘膜以新鲜调和的熟石膏做阴性对照,分别于去除棉球1h、24h后对测试接触部位进行肉眼观察,处死动物后切取实验部位组织,做常规HE染色组织病理切片,观察受试部位的组织反应。[结果]肉眼观察动物试验侧和阴性对照侧与材料接触部位的口腔粘膜,均无充血、肿胀、糜烂及溃疡。组织学检查,试验侧和阴性对照侧粘膜均未见异常,两者无显著性差异。[结论]所使用的蜂胶提取物对大耳白兔的口腔粘膜无刺激性。实验二、短期全身急性毒性实验[目的]评价蜂胶提取物潜在的全身毒性作用,为其进入临床应用阶段提供依据。[方法]采用《中华人民共和国医药行业标准—口腔材料生物试验方法短期全身毒性实验:经口途径》中的方法。选用130～150g的SD大鼠20只,雌雄各半。随机分为对照组和试验组,每组10只,雌雄各半。阴性对照组给服0.154 mol/L的氯化钠溶液,试验组给服蜂胶提取物配制的水溶液,每天每只给服剂量为1000mg/kg,连续给服7d,停服后再观察7d,共14d。评价动物临床毒性体征,记录动物体重及食物消耗量,计算动物食物利用率、体重相对增长率,并进行统计学分析。[结果]20只受试SD大鼠,在14d观察期内,未出现临床毒性体征,试验组和对照组动物的体重、体重相对增长率、食物利用率均没有统计学差异(P＞0.05)。[结论]所使用的蜂胶提取物无短期全身毒性。实验三、皮肤致敏实验[目的]评价蜂胶提取物潜在的致敏性,为其进入临床应用阶段提供依据。[方法]采用《中华人民共和国国家标准医疗器械生物学评价第10部分:刺激与致敏试验》中的方法。选用300～500g成年白化豚鼠15只,随机分为实验组10只、阴性对照组5只。阴性对照组采用0.9%生理盐水,实验组分别采用蜂胶提取物配制的水溶液,弗氏完全免疫佐剂(FCA)及弗氏完全免疫佐剂与受试物混合的乳化剂进行皮内诱导接触、局部诱导、激发接触,并在24h、48h后观察实验部位激发接触结果。[结果]激发接触后24h、48h,实验组7只豚鼠的受试部位可以观察到极轻微的红斑,3只无红斑,均无水肿形成:阴性对照组均未见红斑和水肿。[结论]所使用的蜂胶提取物有致敏性。