IL-12和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子真核表达载体的构建及在肝癌细胞中的表达 邵雪

ＳＨＡＯ Ｘｕｅ ＭＡ Ｊｉｎｇｔｉｎｇ ＳＯＮＧ Ｊｉｅ ｅｔ ａｌ．
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００４１ ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ － １２ （ ＩＬ － １２ ）ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ － ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ － ，ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ ａｎｄ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ｉｎ ｈｅｐａ ＧＭ － ＣＳＦ） ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （
１３００４１ ） （吉 林 大 学 第 二 医 院 肝 胆 胰 内 科 ，长 春
㊀ 构建小鼠 ＩＬ － １２ 和粒细胞 － 巨噬细胞集落刺激因子（ ＧＭ － ＣＳＦ ） 真核表达载体 ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ 和 ＰＢＩ － 摘 要 ： 目 的 ㊀ Ｔｒｉｚｏｌ 法提取小鼠肝脏总 ＲＮＡ，反转 方 法
． ＩＬ － １２ 和 －巨 邵 雪 ， 等 粒 细 胞 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 在 肝 癌 细 胞 中 的 表 达
１４８７
ＩＬ － １２ * "# － => "# ?@AB `D C + ¦ D ;% EF ]4!$"#7% + ¦
㊀ 雪 ㊀ 洁 ㊀ 倩 ㊀ 萌 邵 ，马 静 婷 ，宋 ，张 ，张 传 辉 ，王 武 东 ，吴 ，潘 留 兰
ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ，转染 Ｈ２２ 肝癌细胞，检测 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 在肝癌细胞中的表达。
录成 ｃＤＮＡ，以含有 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ酶切位点的特异性引物扩增得到 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 编码序列，将所得产物和 ＰＢＩ － ＣＭＶ３ 空 载体进行双酶切、回收、连接后转化至 ＤＨ５ α 中，挑取单克隆菌落进行质粒提取、酶切鉴定及测序分析，对构建的表达载体进行鉴 定。 将构建好的质粒分为空载组、ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ 组、ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ 组和共转染组，分别转染至 Ｈ２２ 肝癌细胞中，荧 光定量 ＰＣＲ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 检测细胞中 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ ｍＲＮＡ 及蛋白表达水平。 计量资料多组间比较采用单因素方差分析， 进一步两两比较采用 Ｄｕｎｎｅｔｔᶄｓ Ｔ３ 法。 ㊀ 成功构建了 ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ 和 ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ 真核表达载体，荧光定 结 果 量 ＰＣＲ 检测结果显示，４ 组间 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ ｍＲＮＡ 相对表达量差异均有统计学意义（ Ｆ 值分别为 ５２２ 、１６３ ， Ｐ 值均 ＜ ０． ００１ ） ； 其中 ＩＬ － １２ ｍＲＮＡ 表达水平比较，ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ 组、共转染组较空载组均显著升高（ Ｐ 值均 ＜ ０． ０５ ） ， ＧＭ － ＣＳＦ ｍＲＮＡ 相对 表达水平比较，ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ 组、共转染组较空载组均显著升高（ Ｐ 值均 ＜ ０． ０５ ） 。 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ 结果显示，目的蛋白可以 与抗体结合并在膜上产生特异性条带，条带大小和灰度分析结果显示， ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 蛋白的表达趋势与 ｍＲＮＡ 表达水平一 致。 ㊀ 成功构建了 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 真核表达载体，且可在 Ｈ２２ 肝癌细胞中高效表达。 结 论 关 键 词 ： 肝肿瘤； 白细胞介素 １２ ； 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 Ｒ７３５． ７㊀ ㊀ ㊀ 文 Ａ㊀ ㊀ ㊀ 文 １００１ － ５２５６ （ ２０１８ ） ０７ － １４８７ － ０５ 中 图 分 类 号 ： 献 标 志 码 ： 章 编 号 ：
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ － １２ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ － ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ － ｓｔｉｍｕｌａ ｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ
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ｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ｈ２２ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｃｈ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ Ｔｈｅ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｌｉｖｅｒ ＲＮＡ ｆｒｏｍ
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ｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ｉｎ ｃｅｌｌｓ． Ａ ｏｎｅ － ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄａｔａ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｕｎｎｅｔｔᶄｓ Ｔ３ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒ ｔｈｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ㊀ Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ ａｎｄ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ
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Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｌｉｖｅｒ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ － １２ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ － ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ － ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ
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原 发 性 肝 癌 是 常 见 恶 性 肿 瘤 之 一 ， 近 年 来 其 患 病 ［ ］ 瘤 治 疗 的 致 死 率 逐 渐 上 升 ， 且 治 疗 效 果 不 显 著。肿 方 法 主 要 有 手 术 、 放 疗 、 化 疗 和 生 物 治 疗 等 ， 其 中 生 物 治 疗 已 成 为 当 今 的 研 究 热 点 ， 并 表 现 出 良 好 的 应 用 前 ［ ］ 景。ＩＬ － １２ 是 一 种 介 导 细 胞 免 疫 的 多 功 能 细 胞 因 子 ， 将 固 有 免 疫 与 获 得 免 疫 紧 密 联 系 在 一 起 ，增 加 分 泌 量 ， 进 而 促 进 自 然 杀 伤 细 胞 （ＮＫ 细 胞 ） 、 ＩＦＮγ 的 Ｔ 淋 巴 细 胞 的 增 殖 ， 增 强 细 胞 毒 性 。ＩＬ － １２ 也 可 以 单 独 诱 导 生 成 其 他 细 胞 因 子 ， 从 而 发 挥 其 生 物 学 功 能 ， 调 ［ ］ 控 炎 症 和 肿 瘤 的 发 生 与 发 展。粒 细 胞 噬 细 胞 －巨 集 落 刺 激 因 子 （ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ － ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕ 为 一 种 重 要 的 造 血 生 长 因 ｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ － ＣＳＦ ）作 子 ， 可 以 刺 激 树 突 状 细 胞 、 粒 细 胞 和 巨 噬 细 胞 的 增 殖 分 化 ， 并 间 接 促 进 胞 增 殖 ， 增 强 机 体 对 肿 瘤 的 免 ＮＫ 细 ［ ］。但 疫 能 力 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 单 独 用 药 后 会 产 生 一 定 的 毒 副 作 用 ， 如 发 热 、 肝 功 能 异 常 、 胃 肠 反 应 ［ ］ 此 ，为 了 更 好 地 在 小 鼠 体 内 验 证 过 表 达 等。因 粒 对 肿 瘤 的 影 响 ， 构 建 了 小 鼠 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 质 核 表 达 载 体 ， 分 别 单 独 或 共 转 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 真 Ｈ２２ 肝 ＩＬ － １２ 和 ＧＭ － ＣＳＦ 的 染 癌 细 胞 ， 检 测 表 达 情 况 ， 为 进 一 步 研 究 二 者 联 合 免 疫 治 疗 肝 癌 提 供 技 术 支 持 及 理 论 依 据 。 １㊀ 材 料 与 方 法 １． １㊀ 材 料 康 小 鼠 购 于 吉 林 大 学 动 物 实 验 中 １． １． １㊀ 样 ㊀ 健 品 心 ， 小 鼠 癌 细 胞 购 于 上 海 康 朗 生 物 科 技 有 限 公 Ｈ２２ 肝 司 ， 质 粒 于 宝 生 物 公 司 ， 自 于 ＰＢＩ － ＣＭＶ３ 购 ＤＨ５ α 购 天 根 生 物 公 司 。 氏 生 物 ） 、 １． １． ２㊀ 实 ㊀ ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ （罗 验 试 剂 和 耗 材 胎 牛 血 清 、 养 基 （赛 默 飞 世 尔 公 司 ） ； Ｔｒｉｚｏｌ、 ＤＭＥＭ 培 反 转 录 试 剂 盒 （ 东 洋 纺 公 司 ） ； 限 制 性 内 切 酶 （ＢａｍＨⅠ 和 （ ； 真 酶 、 接 酶 、 胶 ＨｉｎｄⅢ） ＮＥＢ ） ＬＡ 保 Ｔ４ 连 ＤＮＡ 凝 回 收 试 剂 盒 、 荧 光 定 量 试 剂 盒 （宝 生 物 公 司 ） ； 质 粒 大 ＢＣＡ 蛋 提 试 剂 盒 （ 天 根 生 物 公 司 ） ； 白 含 量 检 测 试 剂 盒
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ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｇｒｏｕｐｓ Ｆ ＝ ５２２ ａｎｄ １６３ ｂｏｔｈ Ｐ ＜ ０． ００１ ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｔｈｅ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ －
ｄｏｉ １０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００１ － ５２５６． ２０１８． ０７． ０２４ ２０１８ － ０３ － ０５ ２０１８ － ０４ － ０３
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： 收 稿 日 期 ： ； 修 回 日 期 ： 。 基 金 项 目 ： 吉 林 省 发 展 改 革 委 员 会 资 助 高 技 术 产 业 发 展 项 目 （Ｋ００４００２００１ ） １９８０ － ）， 作 者 简 介 ： 邵 雪 （ 女 ， 主 要 从 事 肝 胆 胰 疾 病 的 研 究 。 通 信 作 者 ： 潘 留 兰 ， 电 子 信 箱 ： ｗｏｓｈｉｐａｎｌｉｕｌａｎ＠ １２６． ｃｏｍ。
ｍｉｃｅ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｈｅｎ ｒｅｖｅｒｓｅｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎｔｏ ｃＤＮＡ． Ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＢａｍＨＩ ａｎｄ ＨｉｎｄＩＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ． Ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ＤＨ５ α ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｒｅｃｙｃｌｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＩＬ － １２ ｇｒｏｕｐ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏ － ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅｓｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｈ２２ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉ
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３４ 卷 ７期 ２０１８ 年 ７月 ㊀ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌ， Ｖｏｌ． ３４ Ｎｏ． ７， Ｊｕｌ． ２０１８ 临 床 肝 胆 病 杂 志 第 第
１２ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏ － ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｈａｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ｂｏｔｈ Ｐ ＜ ０． ０５ ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｇｒｏｕｐ ｔｈｅ ＰＢＩ － ＣＭＶ３ － ＧＭ － ＣＳＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏ － ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｈａｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＭ － ＣＳＦ ｂｏｔｈ Ｐ ＜ ０． ０５ ． Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂБайду номын сангаасｎｄ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｍ ｂｒａｎｅ ａｎｄ ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｎｄ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｇｒａｙ ｖａｌｕｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ｈａｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｒｅｎｄ ａｓ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ＩＬ － １２ ａｎｄ ＧＭ － ＣＳＦ ａｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎ ｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｙ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈ２２ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．