HPLC使用常见问题

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基线噪声
可能的原因 1.气泡(尖锐峰) 2.污染(随机噪声) 解决方法 流动相脱气； 清洗柱,净化样品,用HPLC级试 剂； 3.检测器灯连续噪声 更换氘灯； 4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源 检查干扰的来源 5.检测器中有气泡 流动相脱气
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峰拖尾
可能的原因 1.柱超载 2.峰干扰 3.硅羟基作用 解决方法 降低样品量,增加柱直径采用较高容量 的固定相； 清洁样品,调整流动相； 加三乙胺,用碱致钝化柱，增加缓冲 液或盐的浓度，降低流动相PH值,钝 化样品
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进样
Agilent 1100 手动进样器（G1328A,G1328B)
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Agilent 1100 手动进样器工作原理
六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进 样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组 成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用， 各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
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10）进完样后一定要及时冲洗进样器，特别是用盐或缓冲液作 流动相，由于这些溶液会形成结晶从而磨损垫圈。 冲洗方法： A. 将进样器转至Inject位置，利用液相泵输送高纯水 冲洗(这时是冲洗样品环及沟槽）. B.用阀清洗接头和注射器冲洗。
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实验结束后
对于反相柱，如果流动相含缓冲液，请按如下程序冲 洗色谱柱：10％甲醇水冲≥ 60分钟 ，再换100％甲 醇冲≥40分钟；如果流动相不含缓冲液，则用纯甲醇 冲≥ 60分钟。 自动液相色谱仪，缓冲盐通路上的泵要换上水并清洗 通路。 手动进样阀清洗：冲洗色谱柱时，在‘Load’状态， 使用注射器用溶解样品的溶剂冲洗两到三遍，然后到 ‘Inject’状态，让定量环随柱一起冲洗，冲完柱后， 插入堵头，防止灰尘进入定量环。手动进样针必须用 溶解样品的溶剂冲洗干净，最后用甲醇冲洗两到三遍。
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保留时间延长
可能的原因 1.流速下降，管路泄漏 2. 硅胶柱上活性点变化 3.流动相组成变化 4.温度降低 解决方法 更换泵密封圈,排除泵内气泡 用流动相改性剂,如加三乙胺 防止流动相蒸发或沉淀 采用柱温箱或控制室温；
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出现肩峰或分叉
可能的原因 1. 样品体积过大 2. 柱塌陷或形成短路通道 3. 柱内烧结不锈钢失效 4. 进样器损坏 解决方法 更换色谱柱 更换烧结不锈钢, 过滤样品 更换进样器转子
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紫外灯的保养
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器； 在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养
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二、常见问题分析
色谱图常见问题
保留时间变化

保留时间缩短 可能的原因 1.流速增加 2.样品超载 3.流动相组成变化 4.温度增加
解决方法 检查泵,重新设定流速 降低样品量 防止流动相蒸发或沉淀 柱恒温
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Baidu Nhomakorabea剂的要求
流动相所用溶剂必须为色谱级 水为重蒸水或超纯水 缓冲液的PH值范围一般为2-8（取决于所
用柱子的性能）
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HPLC用水可以通过以下几个方面来得到
专门的纯水机或超纯水机； 去离子水重蒸； 二次或三次重蒸水； 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质 越高放置时间越短。 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲 液 建议不超过两天。
柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
平衡时间：大于30min，且基线平稳。
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鬼峰
1. 进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和 样品的清洗 2. 样品中未知物 : 处理样品 3. 柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其 是离子对色谱) 4. 水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用
HPLC级的水
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色谱柱

•
构造
色谱柱是色谱仪的最重要部件，它由柱管和固定相组 成。柱管多用不锈钢制成，压力不高时，也可采用厚 壁玻璃和石英管，管内壁要求有很高的光洁度。 高效液相色谱柱几乎都是直形，按主要用途分为分析 型和制备型，它们的尺寸规格也不同。 色谱柱两端的柱接头内装有烧结不锈钢滤片，其孔隙 小于填料粒度，以防止填料漏出。
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9）六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全 装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量 最多为定量环体积的75％，如20μl的定量环最 多进样15μl的样品，并且要求每次进样体积准 确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最 少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最 少进样 60 至 100 μl的样品，这样才能完全置换 样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密 度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合 20ul满环进样。
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色谱柱的故障
滤片或填料堵塞 样品或流动相中杂质吸附 机械振动产生空隙 填料变性
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滤片或填料堵塞
使用预柱 缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤 样品溶液使用0.45um滤膜过滤
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工作原理
手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针 从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余 样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相 流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推 动样品进入液相分析柱进行分析。
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手动进样器操作注意点：
1）进样应使用液相色谱专用平头 塑料箍 进样针 2）进样时，进样针应插到底 3）转动手柄时应尽快，不要停留 在中途 4）不使用时将针头留在进样器内 不锈钢套 弹簧 5）样品溶液pH小于10, 常用密封 转子 垫的材质适用pH<10, 否则换 定子 特氟隆材质的密封垫pH10-13 6）分析结束后冲洗进样口，清洗 应使用专用针口清洗器 16
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泵的保养：
使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交 叉污染；
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色谱柱的保养
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂 和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞 和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞 的磨损。
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色谱柱平衡
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150


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7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 用适 当的溶剂来清洗柱； 8)保存色谱柱时应将柱内充满乙睛或甲醇，柱接头要拧紧， 防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或 更长时间。 9)色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片 被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是 大分子进入柱内，使柱头被污染；如果校效降低或色谱峰变形， 则可能柱头出现窝陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小 心拧开柱接头，用洁净小钢铲将柱头填料取出1-2mm高度 (注意把被污染填料取净)，再把柱内填料整平。然后用适当溶 剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，并拧紧柱接 头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。
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•
•

柱性能评价 柱性能指标包括在一定实验条件(试验样品、 流动相、流速、温度)下的：
柱压 理论塔板高度和理论塔板数 对称因子、容量因子 分离度等
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色谱柱的使用及操作
流动相的转换 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
7）手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上 引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。 8）在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平 头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧， 密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止 了针头刺坏密封组件及定子。手动进样时应注意，针中 不能有气泡，在Load状态进样时推针要慢，由Load切换 到inject时动作要迅速，停留半分钟后取针，进样后应 洗针。
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柱子的保养
1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动 2)一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲 时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱 效。 3)选择使用适宜的流动相(尤其是pH2-8)，避免使用高粘度 的溶剂作为流动相；有时可以在进样器前连接一预柱，分析柱 是键合硅胶时，预柱为硅胶，流动相在进入分析柱之前被硅胶 “饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 4)要注意流动相的脱气； 5)进样样品要提纯；避免将基质复杂的样品尤其是生物样品 直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱 之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱，保 护柱可以而且应该经常更换; 严格控制进样量；
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脱气 除去流动相中溶解或因混合而产生的 气泡
气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间 和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
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为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起 到 保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
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常用的脱气方法
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连 续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发 污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振 荡10-15min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗 透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本 低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元 溶剂体系。
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5. 柱塌陷或形成短路通道 6. 死体积或柱外体积过大
7. 柱效下降 8. 采用流动相溶解样品
更换色谱柱 连接点降至最低,对所有连 接点作合适调整,尽可能采 用细内径的连接管 更换柱,采用保护柱 避免溶剂效应
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样品溶剂效应
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峰展宽
可能的原因 : 解 决 方 法 1. 进样体积过大； 2. 在进样阀中造成峰扩展，进样前后排出气泡，以降低扩 散； 3. 数据系统采样速率太慢，设定速率应是每峰大于10点； 4. 检测器时间常数过大，设定时间常数为感兴趣第一峰半 宽的10%； 5. 流动相粘度过高，采用低粘度流动相； 6. 保留时间过长，等度洗脱时增加溶剂含量，也可用梯度 洗脱； 7. 样品过载 进小浓度小体积样品 ；
HPLC使用时常见问题分析
一、规范操作
HPLC的环境设置
HPLC的日常操作条件 温度：10～30℃；相对湿度<80％； 最 好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动 设备，有良好的通风设施。
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流动相的配制
HPLC对流动相的基本要求


不与固定相发生化学反应 对样品有适宜的溶解度 必须与检测器相适应。如用紫外检测器时，不能选用截 止波长大于检测波长的溶剂 避免卤素离子（不锈钢系统） 粘度小的液体
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流动相的配制
按色谱条件，以一定比例混合流动相 后，抽滤（ 0.45µm滤膜），超声脱气。
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滤膜类型 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸 和盐。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特 别适用于水基溶剂。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂 和水溶液，可以用于强酸，不适用于二 甲基甲酰胺。