2017_2018年高中生物第1部分微生物的利用实验1大肠杆菌的培养和分离学案

实验1 大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌 1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。

2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。

3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。

二、实验内容1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。

分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

2．本实验用LB 液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。

培养后再在LB 固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。

三、细菌的培养和分离1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。

人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。

接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。

2．细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h ，每毫升培养基中就有几亿个细菌。

可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。

在固体培养基培养10～20 h 后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。

如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。

这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。

接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。

通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。

将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

细菌的两种分离法各有优点，都可采用。

划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

四、灭菌操作1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 ℃、15 min)处理，并在超净台上使用。

注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。

2．各种培养基必须是无菌的。

3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。

注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1．在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。

将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。

2．灭菌后待培养基冷却至60 ℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。

在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。

为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？【提示】酒精灯火焰旁约10 cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。

3．扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 ℃每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。

4．划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ℃，恒温培养箱中培养12～24 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

5. 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24 h 后，置于4 ℃冰箱中保存。

1.(1)培养基：①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。

②作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。

(2)培养基的种类进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

3．消毒和灭菌的比较基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。

请回答与此实验相关的问题。

(1)制备培养基：根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。

对细菌进行大量的扩增，用________培养基进行培养；对细菌进行分离，用________培养基进行培养。

(2)灭菌：在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种________都必须是无菌的。

对它们进行灭菌，通常用________法灭菌。

(3)接种及培养：接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。

为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37 ℃。

要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。

(4)菌落观察计数：培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。

一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。

(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。

如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌。

【思路点拨】(1)细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。

(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。

实验室中常用高压蒸汽灭菌法。

(3)接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。

在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。

(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。

)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

【答案】 (1)液体 固体平面 (2)器皿和培养基 高压蒸汽灭菌 (3)接种环 恒温培养箱 无菌水 (4)多 高 (5)盐(或NaCl)1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )A ．接种环、手、培养基B ．高压锅、手、接种环C ．培养基、手、接种环D ．接种环、手、高压锅【解析】 此题考查对无菌技术的掌握。

高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。

用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。

火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。

【答案】 C1.LB (1)计算：根据LB 培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。

(2)称量：准确地称取各种成分。

即：蛋白胨0.5 g 、酵母提取物0.25 g 、氯化钠0.5 g ，加水50 mL 。

(如配LB 固体培养基，则再加1 g 琼脂)(3)制备空白斜面：将LB 液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管 2 mL ，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。

灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。

2．进行大肠杆菌培养与分离操作(1)灭菌⎭⎪⎬⎪⎫250 mL 三角瓶甲 →50 mL LB 液体培养基250 mL 三角瓶乙→50 mL LB 固体培养基尚未凝固牛皮纸包好的培养皿置于灭菌锅1 kg 压力灭菌15 min (2)制备LB 固体平面培养基——倒平板操作 待培养基冷却至60 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

倒平板的具体操作描述如下：(3)扩大培养①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。

②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。

③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。

④三角瓶在37 ℃摇床振荡培养12 h。

(4)划线分离①取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。

②平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。

③培养将上述划线操作后的培养皿倒置放至37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

(5)菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 ℃培养24 h后，4 ℃冰箱保存即可。

划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。

下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程：A.灭菌→B.倒平板→C.接种和培养液体培养基→D.划线分离和培养→E.菌种保存请回答：(1)灭菌常用________法，灭菌后，要待________________时才能打开锅盖。

(2)倒平板和接种前要用________擦手。

接种和划线前使用________的方法对接种环灭菌。

(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取________次。

下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。

(4)划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是__________________。

(5)实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？____________________。

【思路点拨】此题考查大肠杆菌的培养和分离过程，具体分析如下：(1)灭菌是指对LB液体培养基和LB固体培养基进行的灭菌。

对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。

灭菌后，灭菌锅内的压力与大气压相同时，才能打开灭菌锅，否则会造成培养液溅出。

(2)在进行实验操作时，操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒，接种环要用火焰烧灼灭菌。