生物技术制药试验

生物技术制药实验

武汉大学药学院生物技术实验室

湖北·武汉

目录

实验一质粒DNA的小量制备 (2)

实验二质粒DNA电泳鉴定 (4)

实验三感受态细胞的制备和转化 (5)

实验四目的基因的表达及表达产物的初步提取 (8)

实验五蛋白质纯化—盐析沉淀法 (10)

实验六凝胶过滤层析 (14)

实验七蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） (16)

实验八HRP结合物的过碘酸钠交联法 (19)

实验一质粒DNA的小量制备

【目的】

学会最常用的碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。

【原理】

根据共价闭合环状质粒DNA和线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心和蛋白质和大分子RNA等发生共沉淀下去而被去除。

【器材】

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

【试剂】

pET-28a质粒载体菌, LB培养基1000ml（含10μg/ml卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4.8）（溶液III），RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。

【实验准备】

1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制10mg/ml，分装后-20︒C保存）。

2. 配制LB培养基

（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加双蒸水至1L，121︒C灭菌20min）。

3. 溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）。

溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；

溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补双蒸水至100ml）。

4. 70%乙醇（-20︒C保存）。

5. TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA ，pH8.0）。

6. 试管洗净并塞上棉塞，1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，

高压灭菌（121︒C，30min）。

【操作步骤】

1.在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的试管中。

2.取出保存的携带pET-28a质粒的菌种, 在超净工作台上用接种环移取少量菌种至

5ml无菌的LB培养液（含10ug/ml卡那霉素）中，37︒C摇床中振荡培养20h。

3.取1ml的菌液至1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），

留沉淀备用。

4.在沉淀中加入预冷的100μl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下

静置5min。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。

5.加入200μl 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次。应确保离心管的整个内表

面均和溶液Ⅱ接触。切勿剧烈振荡。冰浴中放置5min。

6.加入预冷的150μl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，冰浴放置5min。

7.12000 rpm离心5min，小心吸取400μl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，

（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合

器上混匀，室温下静置5min。

8.12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即

在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，倒置尽量流尽。

9.再加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10

min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使

所有液体流出。

10.离心管倒置于37︒C温箱中（或室温）空气干燥10分钟。

11.加入10μLTE缓冲液，涡旋混合器上轻微振荡混匀，离心机中瞬时离心将溶液收

集于管底。用记号笔标记后放入冰箱中冷藏待电泳确认。

12.在剩余的菌液中倒入少许新洁尔灭，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒

入下水池。清理桌面，清洗仪器。

13.撰写实验报告。

【思考】

影响本实验结果的主要因素有哪些？

实验二琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA

【目的】

学会常用的琼脂糖凝胶电泳法分离和鉴定DNA。

【原理】

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

【器材】

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。

【试剂】

pET-28a，TAE电泳缓冲液，1000⨯溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10⨯加样缓冲液（或6⨯加样缓冲液），DNA分子量标准（DNA Ladder:100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500 bp）。

【实验准备】

配制TAE电泳缓冲液（50⨯储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L）；

1000⨯溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL 双蒸水，4︒C避光储存）；

10⨯加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；

6⨯加样缓冲液；

1.5ml离心管装入灭菌盒，移液器吸头装入相应的吸头盒，灭菌。

【操作步骤】

1.称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1⨯)，放入微波炉

中加热溶解（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波（切

不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。

2.戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致50-60︒C（手接触瓶壁不

感觉烫）。

3.把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至和模具的矮

边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。静置10-20分钟待胶完全凝固。在水平