第四章(1节)

酵母的杀伤质粒(killerplasmid)已知是RNA分子。
1.2 质粒的分类 ★
1.2.1 按照复制性质： 严紧型质粒:带有与分配有关的基因，由DNA聚合酶Ⅲ复 制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，1～2个/ 细胞； 松弛型质粒:由DNA聚合酶Ⅰ复制，当染色体复制停止后 仍然能继续复制，数十～数百个/细胞
一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的 复制有时和它们的宿主细胞有关，例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属 严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
1.2.2 按照构型： 环形双链DNA分子

共价闭合环状：两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型 开环DNA：一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口 线状DNA：这种质粒的双链断裂，由环状变为呈线状
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
质粒一般只带有少量复制需要的基因，其它由宿主提供。 广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因，而且启动子、 RBS位点都可以被多种宿主识别。 质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列，可以用其它序列 替换来进行基因克隆或表达。
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
RepA 调控
Iterons are directly repeated sequences（17～22bp) which play an important role in regulation of plasmid copy number in bacterial cells （重复子） Ori附近的repA基因编码RepA蛋 白，其对自身的表达具有负调节 作用 RepA蛋白可以和Iterons结合，促 进复制复合物的形成，从而开始 质粒的复制 质粒拷贝数高时， RepA蛋白浓 度高，形成二聚体，两个质粒聚 集连在一起，复制停止。细胞分 裂后重新复制
（2）滚环复制
在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制，如pC194, pE194 等，这种方式会造成质粒结构的不稳定，存在大量的单链质粒DNA
1.7 质粒的转移性
质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞 ，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移。
质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能 进行，即接合作用 (conjugation)，这类质粒被称为自主转移质 粒(self-transmissible plasmid)或接合质粒(conjugative plasmid) 。 有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒 所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid) ，可以借助这种方式将重组质粒导入难于转化的宿主中。
这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时， 出现不同的迁移速率，超螺旋构型最快，其次是 线性构型，开环构型最慢。
线性质粒
发卡线性质粒：在两端均有反向重复 序列，形成共价闭合的发卡环 多肽结合质粒：5’端与多肽连接，同时 两末端还具有反向重复序列，多为放线菌 质粒 这些结构可以防止质粒被降解
ColIb-P9, R144, R483, R64, R621a
革兰氏阴性细菌
R69, R466b R46, R15, N3, pKM101 R16, R723
RP1, RP4, R68, R751, R690, RK2
RSF1010, pKT212, pKT230, pGSS
R7K, R388, pSA747 R6K
质粒上的par区段编码分配蛋白，质粒上还有par蛋白的结合序列（inc区）
负超螺旋密度的增加可以使质粒分配更稳定，par 区可以增加负超螺旋密 度，DNA促旋酶则降低分配稳定性。 (partition region）
质粒多聚体也导致分配不稳定：
质粒多聚体含有多个复制起点，其复制速度是单体的数倍， 将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性

1.2.3 按照接合能力: 接合型质粒（F质粒） 非接合型质粒
1.2.4 按照宿主范围: 广宿主质粒（以及穿梭质粒） 单一宿主质粒 1.2.5 按照宿主中的存在形式: 游离型质粒 整合型质粒（复制子不能被宿主识 别，带有同源片段） 1.2.6 按照功能： 基因克隆质粒（筛选系统，MCS） 基因表达质粒(筛选系统，MCS，启动子，
pT181, pC221, pUB112, pE194 pS194, pC223,
革兰氏阳性细菌
pBC110, pBC16 pSN2, pE12, pIM13
1.6 质粒的复制方式
（1）θ型复制 单向复制 双向复制
革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型 方式复制，R1，R100等是单向复制 ，F，R6k等是双向复制类型。
F质粒诱动ColEl转移的模型图
不能转移 F- mob
mob产物 bom
性菌毛 转移
F质粒
F+ mob bom
不能转移 F+ mob-
不能转移 F+ mob+ bom-
1.8 报告基因 ★
报告基因：是为基因表达强度、蛋白定位等提供可测信号的一类基因。 标记基因：为重组提供筛选标记的一类基因
抗生素抗性基因：
不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子
细菌种类
质粒不相容群 IncFⅠ IncFⅡ IncFⅢ IncFⅣ IncA IncC IncH IncI IncM IncN IncO IncP IncQ IncW IncX pT181 pUB110 pSN2
代表性质粒 F, R386, R455, ColV R1, R100 Col1B-K98 R124 RA1 R40a, R55 R27, R726
（2） 可移动质粒的特点
不能在菌株间形成接合通道： G-细菌中可移动质粒缺少 与性菌毛合成有关的基因(约10个左右) 。因此，在进行 转移时，必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码 合成的性菌毛才能进行。 具有特殊的转移起始位点和切割功能基因：如 ColEl 具有 独特的bom位点和负责DNA转移的mob基因。ColEl的bom 位点类似于 F 质粒的 oriT 。 mob 基因的功能类似于 tra 基因 ， mob 基因也能编码特异的核酸内切酶，在 bom 位点进行 切割，但没有编码性菌毛的 tra 基因，所以它不能自主转 移。
荧光素酶在氧化底物荧光素（luciferin）的过程中，会发出生物荧 光，可以通过荧光测定仪或液闪仪测定荧光强度。可以极其灵敏、高效 地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作 用的一种检测方法。
蓝白斑筛选(互补筛选）原理 ★
载体携带大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个
colE1 replicon
1.3.2 拷贝数控制机理 反义RNA对拷贝数的调控 RNAII被RNaseH切割后充 当复制引物链（前导链的 引物），而RNAI与其结合 后阻止RNaseH的切割 质粒编码的Rop蛋白二聚 体可提高两种RNA结合复 合物的稳定性 质粒拷贝数越高， Rop、 RNAI浓度越大，最终终止 复制 细胞分裂后，Rop及RNAI 浓度变小，开始进行复制

pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主来自百度文库围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
第四章 载体的选择与构建
主要内容
1.细菌质粒载体 2.噬菌体载体 3.酵母细胞载体及大容量载体 4.动、植物载体
★基因工程载体：
携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具。
★载体的一般特性：

在宿主中能自我复制或借助宿主染色体进行复制 容易从宿主细胞中分离纯化 具有容纳外源DNA分子的能力
已知大肠杆菌的 F质粒、 R1、 R100、 ColV、 Collb-P9、 R6k、 RP4 等均属于自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的R6k质粒 也有38kb。 G+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒外，很多都 是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只有2kb左右。 自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同， G+细菌 中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒分子量较小。


有限制性内切酶位点，便于基因组装
有对载体进行筛选的标记或报告基因
1. 质粒载体 ★
1.1 质粒的定义 ★
质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位，由J.莱德伯 格在1952年提出。
共生生物、真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子 某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。
E.coli 质粒的转移性
质粒 ColE1 ColE2 拷贝数 10-18 10-18 转移性 不能 不能 质粒 R6k RP4 拷贝数 1-2 4-7 转移性 能 能
ColE3
F 因子
10-18
1-2
不能
能
pBR322
pBR325
约20
约20
不能
不能
R100
1-2
能
（1）自主转移质粒的特点
G-菌中质粒分子量较大，而G+菌中质粒较小；
有的质粒具有宿主致死功能，杀死丢失质粒的细胞，如F质粒的ccdA(编码解 毒剂）,ccdB（编码毒性蛋白）
1.5 质粒的不相容性 ★
用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼 此竟争，这样的质粒在同一个细胞中不能和平共处。这种现象称之为不相 容性
若两种质粒拷贝数 不一样，分配有利 于高拷贝数质粒
oriT位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后DNA 末端再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。
自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质 粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也 是从质粒的oriT位点开始的。
kan, cat, bla, spc, em, tet 等
组织化学显色基因：
E. coli lacZ ， -galactosidase（半乳糖苷酶） E. coli gusA（uidA) ， -glucuronidase (GUS，葡萄糖苷醛酸酶）
荧光蛋白基因：
rfp，gfp，..
荧光素酶基因：luc


氨基酸（ N端，称为肽）的编码信息。 宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸（met), 导致翻译在后续met处开始， 其产物为β-半乳糖苷酶的C端，称为ω肽） 肽段无催化能力，但可使ω肽段正确折叠并形成稳定的四聚体；ω 肽段单独无法正确折叠，因此两个肽段在一起才具有催化活性，这称 为互补。 载体的肽编码序列中还插入一个不破坏阅读框的多克隆位点 （MCS）， 由MCS编码的少数十几个氨基酸插入到肽的氨基端不 会影响其功能，然而，当外源DNA插入MCS后，几乎不可避免地导 致其功能丧失。 空载体进入宿主后在IPTG诱导下实现互补， β-半乳糖苷酶分解XGal产生蓝色物质，菌落为蓝色；连接有插入片段的载体在IPTG诱导 下无互补作用， X-Gal不被分解，菌落为白色