第三章 蛋白质2

PG
氨基被保护的aa，在低温且有叔胺存在下与氯甲酸乙酯生成 混合酸酐→能与另一aa酸酯缩合成肽 易产生消旋→无水溶剂中进行
4、 活化酯
R
H C NH PG
O C O NO2 H2N
H C R1 COO
-
O R H C NH PG C N H H C R1 COO- ＋ HO NO2
氨基被保护的氨基酸对硝基苯酯（一种活化酯）能与另一个氨 基酸的氨基缩合成肽 作用温和，产率较高
的羧基形成的肽键 等疏水性aa羧 基形成的肽键 两侧残基均疏水
7、确定肽段在多肽链中的次序
• 所得资料： • N－末端残基 H • C－末端残基 S • 第一套肽段 OUS PS EOVE RLA HOWT HO • 第二套肽段 SEO WTOU VERL APS
• 借助重叠肽确定肽段次序：胰岛素B链的测序 HOWT OUS EOVERLAPS
共价主链 R
?
二肽——肽键数？ 氨基酸残基？ aa residue 丢失的水分子数与 氨基酸残基数?
肽链的极性与 肽的读法
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp2 sp2 sp2
sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转
形成酰胺平面 产生键的平均化
肽键呈反式构型
• 肽键具有部分双键特性，不能自由旋转，呈现相对的 刚性和平面化。 • 除脯氨酸外多以反式结构存在。 • 寡肽：12-20个氨基酸残基。 • 多肽：多于20个（10个）氨基酸残基的肽链。
• 问A肽的氨基酸排列顺序如何？
• 答：Ala－Arg－Glu－Phe－Met－Ser
四、肽的化学合成
• (一) 、保护：对暂不参加反应的氨基和羧基的保护， 对氨基酸侧链上活性基团的保护 • 作为保护基条件：在接肽时能起保护作用，而在接肽 以后又很容易除去，但又不致引起肽键的断裂。 • (二)、肽键形成 • 活化：正常条件下，羧基和氨基之间形成肽键是不会 自发发生的→通常对参与形成酰胺键的羧基活化，以 增强碳原子亲电特性
6、测定各个肽段的氨基酸顺序
• 目前常用的有Edman降解法，此外尚有酶解法、气相色谱 －质谱联用法（GC-MS）等
7、确定肽段在多肽链中的次序
• 利用两套或几套肽段的氨基酸顺序彼此间有交错重叠→ 拼 凑出整条多肽链的氨基酸顺序
8、确定多肽链中S-S的位置
几条多肽链之间或链内通过二硫键交联在一起 可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯 基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护 生成的巯基，以防止它重新被氧化。
三、蛋白质一级结构（共价结构、化学结构）
• 蛋白质一级结构：多肽链中氨基酸的序列，包括二硫键位置。
• （一）蛋白质一级结构的测定
• 要求：样品必须是均一，纯度>97%以上，知道蛋白质的相 对分子质量
• 每种蛋白质的一级结构均有自己特殊的问题需要解决，而一 般的步骤可概括为：
1、测定蛋白质分子中多肽链的数目 →经测定末端残基（C-端或N-端）的摩尔数 →看蛋白质的摩尔数与末端残基的摩尔数的比例？ 末端残基是蛋白质摩尔数的倍数→若检测到的末端基多于一种？
5、缩合剂DCC
——多肽的固相合成中最为常用
直接将氨基被保护的羧基与另一个羧基被保护的氨基反应 N,N’-
N
C
N R1 H C NH
O C O DCC
N C NH
+
R1 H C NH PG
O C OH
H+
+
H3COOC
PG NH2 C H R2
二 环 己 基 碳 二 亚 胺 （ ）
DCC
O R1 H C NH PG C NH CH R2 二肽 COOCH3
DCC …….
CF3COOH/HBr
目标多肽
全自动多肽合成仪
• 多肽合成的自动化、程序化 • →将被保护的aa逐个偶联到惰性固相载体上去 • 利用强酸将肽链从载体上裂解下来，同时去除侧链保护 • 美国应用生物系统公司 • Applied Biosystem
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典型蛋白质的一级结构
5、多肽链断裂成肽段
• 要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋 白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解。 • 将所得混合物进行分离纯化得到较短、便于测定的肽段 • 经N未端、C未端以及氨基酸顺序测定，确定出每一肽 段的序列。
肽链断裂成肽段
• 酶解法（表现出专一性） • 化学法：溴化氰水解法(CNBr)，切割Met的羧基所形 成的肽键。 • 用羟胺断裂:它断裂－Asn-Gly-,但专一性不高。蛋白质 中出现机率低，适于分子量大的蛋白质序列的测定。 一些蛋白水解酶（proteolitic enzymes）的水解特性
CLeabharlann Baidu
R
C
N H
COO-
反应条件温和，不易引起消旋化
→小肽段进一步缩合成大肽时常用
3、 酸酐法
R1 H C NH PG O C NH H C R2 O C O PG H2N H C R2 O C OH O
+
Cl
C
OEt Et3N
R1
H C NH PG
O C O
O C OEt
×
O C O
+
R1
H C NH PG
• 蛋白质的这一特性具有重要生物学意义
1）血液凝固的生物化学机理
凝血酶作用点
纤维蛋白原分子由两对α链、β－链及γ－链组成，每3条肽链 (α、β、γ)绞合成索状，形成两条索状肽链，在N末端有二硫键 使整个分子得到稳定。
O
+
N H
C
N H
二环己基 脲 (dicyclohexylurea, DCU)
肽键形成方法
•（二）氨基活化法
•氨基活化一般不需要特殊的手段，通常是在接肽时加入 有机碱，如三乙胺以保证氨基处在自由状态
固相多肽合成
氯甲基苯乙烯树脂
1962年，美国Merrifield R. B.
叔丁氧甲酰基氨基酸
CF3COOH/CH2Cl2
生 物 化 学
第三章 蛋白质
§2.3 蛋白质的共价结构
• 一、肽和肽键的结构 • 蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptide bond） • 在蛋白质和多肽分子中连接氨基酸残基的共价键除了肽键以 外，还有两个半胱氨酸残基的侧链之间形成的二硫键
丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-甘氨酰－亮氨酸（五肽）
• 蛋白质：分子量在5－6kDa以上的多肽称为蛋白质
二、肽的物理和化学性质
• 肽的晶体是离子晶格，熔点高。 • 具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质－－决定于末端 α-氨基和α-羧基及R基。 • 具有旋光性： • 茚三酮反应、 α-氨基和α-羧基及R基的反应（注：茚三 酮反应不是肽的特有反应） • 具有双缩脲反应：肽和蛋白质所特有→两个或两个以上 的肽键化合物与CuSO4碱性溶液发生反应生成紫红色复 合物（参看实验讲义） • 具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定 量测定（原因是：含色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 ）
8、确定原多肽链中二硫键的位置
• 肽内或肽间是否有二硫键？采用胃蛋白酶：
• 1）专一性低，切点多，生成的肽段包括含有S－S的几率 比较小， 对后续分离、鉴定比较容易
• 2）作用pH在酸性范围（pH＝2）有利于防止二硫键发生 交换反应。 • 肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳：
例：有一个A肽：
• 1）酸水解得到：Ala、Arg、Ser、Glu、 • Phe、Met； • 2）当A肽与DNFB试剂反应后得：DNP-Ala； 3）当A肽用CNBr降解时得到：游离的Ser和一种肽 ； • 4）当A肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽： 一种含Ala、 Arg，另一种含其它氨基酸 • 5）当A肽用糜蛋白酶降解时得到两种肽： 一种含Met、 Ser，另一种含其它氨基酸；
SOCl2或PCl3
反应条件剧烈，现已不太采用
2、 酰基叠氮法
O R H C NH PG O
H2N H C R1 COO
-
O OCH3 NH NH 2 2 R H C NH PG H C NH PG H C R1 C NHNH2 HNO2 R
O H C NH PG 酰基叠氮化物 (acylazide) C N3
• 肽链外切酶 从多肽链的N端逐个向里切 • 据不同反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数 量 知道该蛋白质N末端残基顺序 • 缺点：对各种肽键敏感性不一样 难判断哪个残基在 前哪个在后。eg.亮氨酸氨肽酶
（2）C－端分析
• a. 肼解法： • 单肽链＋无水肼加热
• 氨基酸肼(与苯甲醛生成水不溶性的二苯基衍生物)＋C－ 末端氨基酸
天然存在的活性肽
• 具有特殊的生理功能，常称为活性肽，含有（非）蛋白 质氨基酸和肽键。 例：催产素、加压素等激素、抗生素 如短杆菌肽 • ※α- 鹅膏蕈碱 ：环状八肽，剧毒毒素。能与真核生物的 RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性。 • ※谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 SH COOH CH2 H2N-CHCH2CH2CO—NHCHCO NHCH2COOH — Cys γ-Glu Gly 还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红 蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态
• 加DNFB或DNS 以及层析技术进行鉴定
• b.羧肽酶法
• 专一从肽链的C端开始逐个降解，释放出游离氨基酸 • 羧肽酶A：能水解除Pro,Arg和Lys以外所有C-末端氨基酸； 羧肽酶B：只能水解 Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 • c.还原法： • 单肽链＋硼氢化锂C－末端氨基酸被还原成相应的α－氨基 醇 水解，层析
• 经分离提纯的多肽链一部分样品进行完全水解→测定其氨 基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比
4、分析多肽链的N末端和C末端残基
• 经分离提纯的多肽链另一部分样品进行N末端和C末端残基 的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸顺序参考点
5、多肽链断裂成肽段
• 用两种或几种不同的断裂方法（断裂点不一）将多肽链样 品降解成两套或几套肽段，并将这些肽段分离开
• 表示方法：每摩尔蛋白 质中含氨基酸残基的摩 尔数，或100克蛋白质中 含氨基酸的克数。
柱后茚三酮显色
出峰时间（min）
4、分析多肽链的N末端和C末端残基 • （1）N－端分析
a. Sanger法（DNFB法）
B
水解
DNP－氨基酸（黄色）
b. Dansyl chloride(DNS)法
（荧光）
c. 苯异硫氰酸酯(PITC)法
• PITC（苯异硫氰酸酯、Edman法） • 单肽链＋ PITC PTC－多肽 • 酸性有机溶剂中加热（N末端PTC－氨基酸发生环化 N末端氨基酸从多肽链上断裂下来） • PTH－氨基酸（强紫外吸收） ＋ 余下的肽链
• 抽提：用有机溶剂，层析鉴定。
d. 氨肽酶法（amino peptidases）
巯 基 （ ） 的 保 护
O CH2OCCl -
OOC CHCH2 SOCCH2 NH3+ O
-SH
-
OOC CHCH2 SH NH3+
O
CH2Cl
-
OOC CHCH2 S CH2 NH3
+
ICH2CNH2
OOC CHCH2 SCH2CNH2 NH3+ O
3、分析每一多肽链的氨基酸组成
• 待测样品经酸(6mol/L HCl)和碱(5mol/L NaOH) 完全水解，用氨基酸分 析仪进行测定（或层析 法）。
注意：二硫键！
蛋白质的一级结构
• 许多蛋白质一级结构已经确定 • 蛋白质一级结构查询网站： • 美国生物技术信息中心及国家医学图书馆NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/（拓宽）
蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活
• 在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质的部分肽链 必须先按特定的方式断裂后才呈现生物活性 • 如： • 血液凝固时血纤维蛋白原和凝血酶原的变化 • 消化液中一系列蛋白水解酶原的激活 • 许多肽或蛋白质激素前体转变为活性的激素形式等
2、拆分蛋白质分子多肽链和二硫键
• 1）借助非共价相互作用缔合的（亚基之间）→ 采用变性 剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。 • 2）通过共价二硫桥（S－S）交联的（链内或链间）→采 用过甲酸氧化或巯基化合物做还原剂将二硫键断裂。 • 3）分离、纯化多肽链
3、测定多肽链的氨基酸组成
氨基保护基（酰化试剂）
羧基保护基（盐或酯化）
叔丁氧甲酰基 苄酯 除去条件：H2/Pd法或 金属钠-液氨法除去
苄氧甲酰基
对甲苯磺酰基 除去条件：HBr/CH3COOH 叔丁酯 除去条件： 温和条件下用酸除去
肽键形成方法
• （一）羧基活化法 1. 酰氯法
O R H C NH PG C O
-
O R H C NH PG PG－保护基 C Cl