酵母双杂交(自激活)

Suppose we have two proteins...
X
Y
and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
activation domain
阳性克隆的筛选： 阳性克隆的筛选：
将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到 培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培 将在 培养基上长出的酵母菌落转移到 培 养基上进行筛选。30℃培养2天，检查生长情况。 养基上进行筛选。 ℃培养 天 检查生长情况。
对生长状态较好的单克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。 对生长状态较好的单克隆进行 半乳糖苷酶活性分析。 半乳糖苷酶活性分析
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
activation domain
Y
thus forming a functional transcription activator...
X
Y
do we get expression of the reporter?
reporter gene
His, β-gal
一般情况下， 一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（ 上游活化序列 （ GAL UAS） 结合 ， 但不能 ） 结合， 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上 ， 若其表 载体上， 的转录因子基因构建到 载体上 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录， 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象 反过来， 自激活现象。 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。 录激活活性。
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
reporter gene
His, β-gal
YPDA培养基 培养基
YPDA 蛋白胨 酵母提取物 琼脂 0.2%ade 葡萄糖 液体 500ml 10g 5g —— 10ml 10g 固体 100ml 2g 1g 2g 2ml 2g
GAL4分子的 可以同上游激活序列 分子的BD可以同上游激活序列 分子的 (upstream activating sequence,UAS)结合。 结合。 结合 AD则能激活 则能激活UAS下游的基因进行转录。 下游的基因进行转录。 则能激活 下游的基因进行转录 单独的BD和 都不能激活 都不能激活UAS的下游 单独的 和AD都不能激活 的下游 基因， 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。 在一起才具有完整的转录激活功能。
DNA binding doFra bibliotekainUAS (upstream activation sequence)
transcription machinery
gene
Do these proteins bind?
Y
X
X
X Y
our two hybrid proteins bind!
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
pH 6.5
灭菌 121℃ 15min ℃
正对照： 正对照：pGAL4 负对照： pBD-GAL4 负对照：
酵母菌株感受态细胞制备： 酵母菌株感受态细胞制备： 感受态细胞制备
1. 将-70℃下冻存的酵母菌在 平板上划线， ℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于 ℃培养 天。 平板上划线 倒置于30℃培养2-3天 2. 挑取 个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震 挑取2-4个大菌落（直径 液体培养基中， 个大菌落 ） 液体培养基中 液体培养基中（ 荡5min，打散菌落，接种于 ，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角 液体培养基中 三角 瓶），230-250转/min，30℃培养 ）， 转 ， ℃培养18-24hr。 。 需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到， 3. 取菌液测定其 600值，需达到 。若不到，再培养 取菌液测定其OD ，若还不到， 换单克隆重摇。 换单克隆重摇。 4. 取50ml菌液于 菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶）， ℃， 培养基中（ 大三角瓶）， 菌液于 培养基中 大三角瓶），30℃ 230rpm，摇培3hr，至 OD600值为 ，摇培 值为0.4~0.6。 ， 。 5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 于常温收集菌体，重复一次。 6. 室温下 室温下1000g离心 离心5min，去上清，加入 超纯水清洗悬浮3次 离心 ，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮 次。 7. 1000g离心 离心5min，弃上清，用新配的 重悬细胞， 离心 ，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰 × 重悬细胞 上，即成为酵母感受态细胞。 即成为酵母感受态细胞。 现做现用， （只能现做现用，不能贮存，室温只能放置 只能现做现用 不能贮存，室温只能放置1-2hr）。 ）。
β-半乳糖苷酶活性分析 半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析） 半乳糖苷酶活性分析
1. 取2ml的Z缓冲液 缓冲液/X- gal溶液润透 张滤纸； 溶液润透2张滤纸 的 缓冲液 溶液润透 张滤纸； 2. 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上， 使滤纸尽可能与酵母菌接触（ 泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）； ）； 3. 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸， 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸， 沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次 沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次； 4. 沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液 沾有菌的面朝上，紧贴于预先用 缓冲液 缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸 溶液润透过的那张滤纸 同时吸掉多余的Z缓冲液 缓冲液/X-gal溶液； 溶液； 上，同时吸掉多余的 缓冲液 溶液 5. 沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30℃温箱 沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于 ℃温箱3-8h，观察酵母 ， 的颜色变化。 的颜色变化。
酵母双杂交(自激活)
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。 组成的。 功能上相互独立的结构域 组成的 酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 ， 酵母的转录激活因子 端有一个 个氨基酸组成的DNA结合域 结合域(DNA 由147个氨基酸组成的 个氨基酸组成的 结合域 binding domain,BD)，C端有一个由 端有一个由113个 ， 端有一个由 个 氨基酸组成的转录激活域 转录激活域(transcription 氨基酸组成的转录激活域 activation domain,AD)。 。
DNA binding domain
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery
gene
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20µg/µl）沸水中煮 （ ）沸水中煮20min，冰上冷却 ，冰上冷却10min。 。 2. 加入 加入100µl酵母感受态细胞、1~2µl构建质粒（约200ng）、 酵母感受态细胞、 构建质粒（ ）、100µg鲑 酵母感受态细胞 构建质粒 ）、 鲑 鱼精、 鱼精、600µl TE-LiAc-PEG，变速涡旋 ，变速涡旋10s~1min至混匀。 至混匀 3. 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡 ℃ ，恒温摇床振荡30min。 。 4. 加入 加入70µl DMSO，温和颠倒混匀。 颠倒混匀。 ，温和颠倒混匀 5. 42℃水浴热休克15min，后冰浴 ℃水浴热休克 ，后冰浴10min。 。 6. 常温下，3000rpm离心 常温下， 离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬 ），用 离心 ；弃上清（去干净）， × 重悬 细胞。（ × 室温只能放置 室温只能放置1~2hr） 细胞。（ 1×TE室温只能放置 ） 7. 将转化后的酵母培养于 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30℃倒置培养约 天，直 培养基上， ℃倒置培养约3-5天 培养基上 至出现菌落。 至出现菌落。