胰蛋白酶抗原修复液
石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项
石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异性反应来检测并定位蛋白的方法，目前广泛应用于组织病理学诊断。
其中，抗原修复（Antigen repair，AR）是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。
原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。
这种交联在高温加热或是蛋白酶水解的作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
一AR常用的方法是否进行AR、采用什么方法进行AR 要按抗体说明书的要求决定，不同的抗体选择适合该抗体的AR方法，有的要求高温修复，有的要求酶消化。
➤微波法方法：切片于抗原修复液中经微波炉内微波辐射5-20min。
它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。
微波辐射可以使各物质分子作极性运动，促进形成的醛键断裂开。
分子间运动所产生的瞬间热可导致甲醛固定后的蛋白的变性。
该法的特点是：产热迅速，容易操作，但也容易引起抗原修复液的沸腾，使得修复液温度不稳定。
➤高温高压法方法：切片于抗原修复液中在高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-5min。
该法利用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度在100℃-120℃之间，而高压也易使蛋白变性。
➤真空负压法方法：切片于抗原修复液中在预先调至95℃的真空负压干燥箱中真空负压处理5-10min。
这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。
该法特点是分子在失重的情况下四处飘游，可以增加各分子间的碰撞机会，而且恒定的温度能保证使甲醛固定的蛋白发生变性又不会使抗原修复液达到沸点。
➤酶修复法方法：0.10%胰蛋白酶或0.40%胃蛋白酶在室温或37℃消化切片15-30min。
抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项在免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）等实验技术中，抗原修复是一个至关重要的步骤。
它对于提高抗原的检测敏感性和特异性，获得准确可靠的实验结果具有重要意义。
接下来，让我们详细了解一下抗原修复的方法以及在操作过程中需要注意的事项。
一、抗原修复的概念抗原修复，简单来说，就是通过一系列的处理方法，使在组织固定和处理过程中被封闭或破坏的抗原决定簇重新暴露出来，从而能够与抗体发生特异性结合，被检测到。
二、抗原修复的方法（一）热诱导抗原修复（HIER）这是目前应用最为广泛的方法之一。
1、水浴加热法将切片浸泡在装有修复液的容器中，然后置于水浴锅中加热。
通常温度设定在 95 100℃，时间一般为 15 20 分钟。
2、高压加热法把切片放入装有修复液的高压锅中加热。
这种方法能在较短时间内达到较好的修复效果，一般加热 2 3 分钟，压力维持在 10 13 个大气压。
3、微波加热法将切片放入装有修复液的容器中，然后放入微波炉中加热。
加热时间和功率需要根据具体情况进行调整，一般为 5 15 分钟。
（二）酶消化法常用的酶包括蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
酶的浓度和作用时间需要根据组织类型和抗原特性进行优化。
（三）非加热抗原修复法例如使用某些化学试剂，如尿素等，来实现抗原修复。
三、抗原修复液的选择常见的抗原修复液有柠檬酸盐缓冲液（pH 60）、EDTA 缓冲液（pH 80 90）和 TrisEDTA 缓冲液（pH 90）等。
不同的修复液对于不同的抗原和组织具有不同的效果，需要根据实验条件进行选择。
四、抗原修复的注意事项（一）组织切片的准备切片的厚度要适中，一般为 3 5 微米。
过厚的切片可能导致修复不均匀，过薄的切片则容易在操作过程中受损。
（二）修复液的配制要严格按照配方准确配制修复液，确保 pH 值和浓度的准确性。
同时，修复液要新鲜配制，避免长时间存放导致失效。
（三）温度和时间的控制这是抗原修复的关键因素。
重组胰蛋白酶用途
重组胰蛋白酶用途胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，主要负责分解蛋白质，帮助人体消化食物。
然而，传统的胰蛋白酶存在一些问题，例如耐酸性差、容易被胃酸破坏等。
为了克服这些问题，科学家们利用基因重组技术成功地合成了重组胰蛋白酶，这种酶具有更好的酸碱稳定性和抗胃酸能力。
重组胰蛋白酶在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
重组胰蛋白酶在医药领域有着重要的应用。
由于其具有更好的稳定性和抗胃酸能力，重组胰蛋白酶被广泛应用于治疗胰腺功能不全引起的消化不良症状。
胰腺功能不全是由于胰腺分泌的胰酶不足，导致食物中的蛋白质无法充分消化。
重组胰蛋白酶可以作为替代治疗，帮助患者消化食物，减轻胃肠道不适症状，并促进营养吸收。
重组胰蛋白酶在食品工业中也有着重要的应用。
在食品加工过程中，重组胰蛋白酶可以用作蛋白质降解剂，帮助改善食品口感和消化性。
例如，在面包、饼干等面点制作过程中，添加适量的重组胰蛋白酶可以使面团中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，提高面点的柔软度和口感。
另外，在奶制品加工中，重组胰蛋白酶也可以用来促进乳清蛋白的水解，提高乳制品的消化性和营养价值。
重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着广泛的应用。
由于其具有较高的催化活性和稳定性，重组胰蛋白酶被广泛用于蛋白质工程和基因工程中的相关研究。
在蛋白质工程中，科学家们可以利用重组胰蛋白酶对目标蛋白质进行酶切，得到特定的片段或产物，从而进行蛋白质结构和功能的研究。
在基因工程中，重组胰蛋白酶可以用于对基因进行定向剪切、连接和修饰等操作，促进基因工程的进展。
总结起来，重组胰蛋白酶作为一种改良的消化酶，在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
它可以作为治疗胰腺功能不全的替代治疗药物，帮助患者消化食物，改善胃肠道症状。
同时，在食品加工中，重组胰蛋白酶可以用来改善食品口感和消化性，提高食品的质量。
此外，重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着重要的应用，用于蛋白质工程和基因工程的研究。
随着科学技术的不断进步，相信重组胰蛋白酶将会在更多领域发挥重要作用，为人类的健康和生活质量带来更多的福祉。
Hanks液和胰蛋白酶液配置说明书
Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
BS S与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。
胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。
传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。
胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。
胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。
本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。
一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。
但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。
胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。
溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。
当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。
细胞传代使用的胰酶浓度是0．25％或0．2％。
用于原代细胞培养消化组织块则为0．1％或0．125％。
------ 来自司徙镇强主编〈细胞培养〉（P41页）NaCL--------------- 8.00gKCL --------------- 0.40gCaCL2 ------------- 0.14gMgSO4.7H20 ------0.20gNa2HP04.H2O------ 0.06gKH2PO4 ------------0.06gNaHCO3 ------------0.35g葡萄糖------------- 1.00g酚红--------------- 0.02g加水至1L，用NaHCO3调PH至7.2~7.4Hank's液不能高压，滤膜除菌。
抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适用于大量中性福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。
其效果优于微波修复和直接煮沸修复，使免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500w电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。
3.所需试剂：0.01m柠檬酸型缓冲液，ph=6.0±0.14.操作步骤：（1）常规组织切片用二甲苯脱蜡，用梯度酒精水合，然后用蒸馏水浸泡使用。
（2）取一定量pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液（800-1500ml）放入高压锅中，高温加热至沸腾；将脱蜡和水合的组织切片放在不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入沸腾缓冲液中。
盖上锅盖，关闭压力阀，继续加热直到蒸汽喷射，并从蒸汽喷射开始计时。
1-2分钟后，压力罐离开热源并冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速）。
取出载玻片，用蒸馏水清洗两次，然后用PBS（pH=7.2-7.4）清洗两次，每次3分钟（2分钟）×3’。
（3）按照试剂盒的操作步骤操作。
5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。
(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液ph值增高而导致掉片。
(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。
(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆poly-l-lysine(（5）缓冲液的用量必须确保所有切片都能被浸泡，使用过的柠檬酸缓冲液不能重复使用。
EDTA抗原热修复1.适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。
2.仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。
3.所需试剂：edta抗原修复液，ph9.04.操作步骤：（1）抗原修复液的配制：根据需要的工作液量，取适量麦新产品mvs-0098，按1:50的比例稀释。
EDTA抗原修复液(50x)
EDTA 抗原修复液(50×)简介：EDTA 抗原修复液(EDTA Antigen Retrieval solution ，50×)是一种常用的抗原修复液，可以有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，可以用于石蜡切片、冰冻切片等样品使用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后的抗原修复。
细胞或组织用多聚甲醛、福尔马林或其它醛类试剂固定后，会导致蛋白之间的交联，遮蔽样品抗原位点，导致免疫染色信号减弱，甚至出现一些假阳性染色结果。
按照每个片子需要10ml 抗原修复液(1×)计算，100ml 抗原修复液(50×)可以用于500个样本的抗原修复。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)石蜡切片1、脱蜡至水①二甲苯3次，每次3～5min 。
②无水乙醇脱水2次，每次3～5min 。
③95%的乙醇，3～5min 。
④90%的乙醇，3～5min 。
⑤80%的乙醇，3～5min 。
⑥70%的乙醇，3～5min 。
⑦蒸馏水冲洗2次，每次3～5min 。
2、抗原修复①用去离子水或双蒸水稀释EDTA Antigen Retrieval solution(50×)至1×。
②将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，95℃或沸水加热。
③抗原修复液(1×)使用前需预热。
3、免疫染色洗涤液洗涤1～2次。
4、封闭等后续的免疫染色步骤。
(二)冰冻切片：1、用去离子水或双蒸水稀释EDTA Antigen Retrieval solution(50×)至1×。
编号 名称 IH0304 Storage EDTA Antigen Retrieval solution(50×) 100ml 4℃ 使用说明书 1份2、免疫染色洗涤液洗涤切片5min。
3、将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，95℃或沸水加热4、抗原修复液(1×)使用前预热至。
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化实验
免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化染色中某些抗体最佳修复方式探讨_陈任生
目前，免疫组化染色技术已成为病理学诊断中 不 可 缺 少 的 重 要 手 段[1]，而 进 行 抗 原 修 复 使 抗 原 决 定簇暴露则是免疫组化染色成功的关键。 绝大多数 抗原的修复是通过加热来完成的，可以这样说，抗原 热 修 复 是 免 疫 组 化 的 关 键 技 术[2]，但 是 有 些 抗 体 在 检测中使用抗原热修复法会直接影响到最终的染色 结果，比如：CD68、lysozyme、α-AT 和 S-100。 本研究 中，观察了高压加热法(EDTA pH 9.0)、微波加热法 (柠檬酸 pH 6.0)、 胰酶消化法 3 种抗原修复方法对 免疫组化染色结果的影响。
adoption of different recovery modes to different antibodies can obtain the best staining effect.
[Key words] Immunohistochemistry; Antigen reovery; Staining
克隆抗体 CD68 和 S-100，兔抗人多克隆抗体 α-AT 和 lysozyme， 修复液： 柠檬酸缓冲液(PH6.0)、EDTA 缓冲液(pH 9.0)，EnVisionTM 试剂盒, 均购自基因公 司。
2 方法 按抗原修复方法分 3 组,每组所有病例 均进行 4 种抗体染色，即每个抗体染 20 例，每组总 数均为 80 例。
2006,20(27):60～64. [2] 龚志锦,詹容洲.病理组织制片和染色技术[M].上海:上海科学技术
出版社, 1994,1:5. [3] Shi SR, Imam SA, Young L, et al. Antigen Retrieval Immunohisto-
chemistry Under the Influence of pH Using Monoclonal Antibodies [J]. J Histochem cytochem, 1995,43(2):193～201. [4] 周 虹.抗原修复方法在Ⅳ型胶原免 疫 组 化 染 色 中 的 应 用[J].临 床 与实验病理学杂志, 2007,23(1):93～94. [5] 刘复生.免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的应用及其存在的问题 [J].癌症进展杂志, 2007 年 7 月第 5 卷第 4 期:355～36. [6] 周小鸽.全国性免疫组织化学质量控制活动介绍及总结[J].临床与 实验病理学杂志, 2007,23(4):510～511.
EDTA抗原修复液(50×)使用说明书
htpp://
EDTA 抗原修复液(50×) EDTA 抗原修复液(50×)
细胞或组织用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后，会导致蛋白之间的交联，遮蔽样品 的抗原位点，导致免疫染色时染色信号减弱，甚至出现一些假阳性染色结果。
EDTA 抗原修复液(50×)采用了广泛使用的 EDTA，可以有效去除醛类固定试剂导致的蛋白 之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。
温馨提示 为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，戴手套等。
储存温度 2~8℃保存。如果长时间不使用，请保存于-20℃。
包装清单 货号
HCY056
品名 EDTA 抗原修复液(50×)
说明书
包装 100mL 1份
推荐产品
产品名称
货号 主要成分
柠檬酸钠抗 原修复液 (50×)
HCY057 柠檬酸钠等
htpp://
和 EDTA
剂等
抗原修复 温度
95-100℃
95-100℃ 95-100℃
95-100℃
室温
80℃
石蜡切片 修复效果
++43;++
++++
+
+
冰冻切片 修复效果
++
+
++
+++
+++
+
漂片修复 效果
++
+
++
+++
+
+++
抗原修复方法及注意事项
柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法,使得免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500W电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。
3.所需试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0±0.14.操作步骤：(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(800-1500ml)于压力锅中，大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。
盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水笼头下加速冷却)，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
(3)按有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。
(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高而导致掉片。
(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。
(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine((5)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
EDTA抗原热修复法1.适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。
2.仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。
3.所需试剂：EDTA抗原修复液，pH9 .04.操作步骤：(1)抗原修复液的配制：根据所需工作液的量，取迈新公司产品MVS-0098适量，按1:50的比例稀释。
抗原修复
抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。
抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施，AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。
修复方法多种，主要有加热修复和酶修复。
为什么要进行抗原修复？(1)福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。
(2)甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
修复方法:(一)加热AR技术可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。
抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
(1)微波加热方法切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。
将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。
取出容器，室温冷却30分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。
PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P- glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法
柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法常见问答集 - 石蜡组织切片抗原热修复方法1.适用范围:适合于中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果比高压修复法差。
2.仪器设备:电炉(600W)、烧杯(1000ml)等。
3.所需试剂:0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0?0.1.4.操作步骤:(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热直至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮20分钟;烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
(3)按迈新公司有关试剂盒的操作步骤执行。
5.注意事项:(1)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防pH值改变而导致掉片。
(2)煮好后必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
(3)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆Poly-L-Lysine (4)缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
柠檬酸缓冲液微波抗原修复法常见问答集 - 石蜡组织切片抗原热修复方法1.适用范围:适合于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果比高温高压修复差但比直接水煮好。
2.仪器设备:微波炉(700-800w)。
3.所需试剂:0.01M柠檬酸型缓冲液，pH=6.0?0.14.操作步骤:(1)常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，浸泡于蒸馏水中待用。
(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液(缓冲液量不得<500ml)于微波盒中，微波加热直至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档或中档继续微波处理15-20分钟;取出微波盒冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS(pH=7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟(2×3')。
胰蛋白酶溶液2.5%
胰蛋白酶溶液(2.5%)简介：胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。
胰蛋白酶的特点在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。
胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。
Leagene Trypsin solution(2.5%)由2.5%胰酶组成，不含EDTA ，经过滤除菌。
本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温下1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。
该溶液浓度较高，可以稀释到相应浓度后使用。
组成：自备材料：1、 PBS 、Hanks 液或无血清培养液2、 显微镜3、 离心机操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，用无菌的PBS 、Hanks 液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
②加入少量Trypsin solution 或用无菌水配制成适合浓度，略盖过细胞即可，室温放置，不同的细胞消化时间有所不同。
③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，此时吸除胰酶细胞消化液。
加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
④如果发现消化不足，则加入Trypsin solution 工作液重新消化。
⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。
离心，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
编号 名称 CC0134 Storage Trypsin solution(2.5%) 100ml -20℃ 使用说明书 1份2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。
神经医学常用抗原修复方法汇总
抗原修复大全组织在福尔马林或其它固定液中固定会引起位于蛋白内或蛋白间的亚甲基桥的桥连，引起许多抗原决定簇被封闭。
如在组织切片前未进行某种形式的抗原修复，免疫染色结果将不能令人满意甚至不能成功。
最常用的抗原修复技术是酶消化和热引导的抗原决定簇的修复(heatinduced epitope retrieval,HIER)，但其它技术，如声波处理抗原修复技术也在某些实验室应用。
有些抗体则适宜于几种抗原修复技术的联合使用，如酶消化加HIER可使anti-calponin抗体的染色效果最佳。
有关抗原修复的基本要素如下：1 足够的抗原修复是影响免疫组化染色结果最重要的因素，总的说来，较检测系统更为重要。
2 尽管某种形式的抗原修复对大多数抗体有益，但有些抗体经抗原修复后不再发生反应(例如某些不需要抗原修复的抗体)。
3 主要的抗原修复形式包括：。
酶处理，如：胰蛋白酶、胃蛋白酶、pronase。
热引导的抗原决定簇修复，使用湿热。
HIER对大多数的抗体有益，特别是核抗原(对它们来说，HIER可能是抗体工作的前提条件，如Ki-67、雌激素)。
4 某些抗体适宜于几种抗原修复方法联合使用，如anticalponin抗体经酶处理及HIER 联合修复后抗体工作效果最佳。
5 抗某一抗原的不同抗体可能需要不同的抗原修复方式，如有些抗CD21的抗体可能需要酶消化，而另一些则需要HIER。
6 使用HIER时，要注意两个基本点：。
抗体孵育前每一步操作均勿使组织干燥，否则免疫反应可能完全不能进行。
加热后放置足够的时间(至少10～20 min)使之变凉是必需的，可假设为允许蛋白恢复到它的自然结构，否则HIER将无任何效果。
目前常见的抗原修复液，如：枸橼酸缓冲液、尿素、EDTA、Tris-HCl、氯化铵和商品化靶修复液。
作者选择压力锅HIER方法，结果表明在pH8.0 1 mmol/L EDTA溶液中修复的效果最佳，特别是与常用的枸橼酸缓冲液(pH6.0)比较。
免疫组化技术
组织学切片制作
石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法
较好的保持组织细胞的形态结构 切片有连续性 长期存档，供回顾性研究 由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交
探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到 的颜色/形态都较冰冻切片好。 抗原的保存量不如冰冻切片。
抗原修复
化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶
优点：此方法由于微波场内极性分子、离子高速 运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复 正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对 抗原再现效果好。
抗原修复
高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液 内，置高压锅中高压 2～3min，可取得极好的效 果。
优点：由于高压下受热均匀，特别适用于大批量 标本的染色。 应用于一些较难修复的抗原。
量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中
生物素——抗生物素染色法最常用（ABC法）。
常用的染色方法
免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。
• 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理， 先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞 或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗 原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发 出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的 定位，进而还可进行定量分析。
加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法
抗原修复
化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决 定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
•胰蛋白酶：主要用于细胞内抗原的显示；-：一 般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37 度 10～40min， •胃蛋白酶：主要用于细胞间质抗原的显示。一般 使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37 度30～ 180min， 例如：Laminin、CollagenIV
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胰蛋白酶抗原修复液
简介：
组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
柠檬酸盐、EDTA或Tris等缓冲液在热的条件下可以使被福尔马林屏蔽的抗原重新暴露出来，同时又不会对抗原表位造成破坏，从而提高抗原的检出率，降低背景染色，提高诊断的准确率。
在热诱导抗原修复法出现之前，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等酶类的诱导的表位修复是最常用的方法。
Leagene 胃蛋白酶抗原修复液能暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。
通常石蜡切片都需进行抗原修复处理，而冰冻切片可以不进行抗原修复处理，抗原修复可以提高石蜡切片的免疫染色效果，亦可以不同程度的提高冰冻切片的染色效果。
当冰冻切片免疫染色效果不理想时，可考虑进行抗原修复。
按照每个片子需要10ml抗原修复液(1×)计算，100ml抗原修复液可以用于10个样本的抗原修复。
组成：
自备材料：
1、系列乙醇
2、双蒸水或去离子水
3、加热设备
4、免疫染色洗涤液
操作步骤（仅供参考）：
(一)石蜡切片
1、脱蜡至水
①二甲苯3次，每次3～5min。
②无水乙醇脱水2次，每次3～5min。
③95%的乙醇，3～5min。
编号
名称
IH0310 Storage 胰蛋白酶抗原修复液100ml -20℃使用说明书1份
④90%的乙醇，3～5min。
⑤80%的乙醇，3～5min。
⑥70%的乙醇，3～5min。
⑦蒸馏水冲洗2次，每次3～5min。
2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。
3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。
4、进行后续的免疫染色步骤。
(二)冰冻切片：
1、免疫染色洗涤液或自来水洗涤切片5min。
2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。
3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。
4、进行后续的免疫染色步骤。
(三)其它样品：
其它样品参考石蜡切片或冰冻切片进行操作。
注意事项：
1、胰蛋白酶抗原修复液恢复至室温后再使用，但应避免反复冻融。
2、浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，最佳孵育时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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PE0103 Acr-Bis(30%,29:1)
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