产酶微生物的分离与筛选实验报告书

产酶微生物的分离与筛选

实

验

报

告

组别：第6组

组长：冯建阳

组员：崔国强、石勇、于锦

项目：产纤维素酶的筛

选与分离

时间：2014年5月11日

一、实验目的

1.从富含纤维素的土壤中分离出可以产生纤维素酶的菌种。

2.掌握菌种的筛选方法以及菌种的鉴定方法。

3.掌握培养基的设计和配置。

4.熟练掌握无菌接种技术，微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。

5.学习设计性，综合性实验报告的书写规范。

二、实验原理

纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的可再生资源，探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。纤维素酶最早是1904年在蜗牛消化液中首次发现，由多种组分组成的一个复杂酶系，为水解纤维素及其衍生物的一组酶的总称。纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多，合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶解能力也大不相同。在过去的半个世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶。近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在。

菌种采集:产纤维素酶细菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。本次实验拟从森林土及朽木中获得产酶菌株。

采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。故实验选取距表层土壤10cm处的土壤进行筛选。

纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：

1、刚果红可以跟大分子多糖牢固结合。

2、纤维素是大分子多糖，跟刚果红牢固结合。

3、纤维素酶降解平板中的纤维素小分子糖，那么刚果红无法与小分子糖结合，就被洗脱下来，呈现透明圈。

4、在通常的纤维素刚果红培养基筛选菌种的程序中，先用含有纤维素的平板培养菌，等菌长出来后，把菌体刮离，然后加入刚果红染色10-15分钟，再用NaCl冲洗2-3次，产生透明圈的就是能水解纤维素的菌。

三、实验步骤

（一）菌种的采集

采集人民公园距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。

（二）菌种初筛

1．按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。

2．于无菌台上倒9个CMC培养基备用。

3．另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）1.000mL加入1号试管，加无菌水9.000mL。混匀后吸取1.000mL加

入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。

4.待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。

5．将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）

6．配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。

7．在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。

8．将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。（三）酶活力测定

以水解圈直径与菌落直径的比值(D／d)作为判别指标，观察哪个浓度的酶活力比较大

（四）菌种复筛

1．配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2．将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r／min下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。

四、培养基及仪器设备

初筛与复筛菌株所用的培养基：

1、初筛

CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨1 g、FeSO4·7H2 O 0.005 g、NaCl 0．25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。

刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0．5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0．5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0．4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。

无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC 培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。

2、复筛

基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO4 19，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min 五、实验结果

六、误差分析

1、在配置培养基过程中，由于实验器材条件限制导致药品的称量不准确，造成培养基成分误差。

2、在接种过程中，由于无菌操作台可能被杂菌污染，导致培养基接

种造成污染。

3、由于复筛时透明圈的大小不是很明显，只能根据肉眼观察，选取水解能力强的菌种进行培养，可能造成实验误差。

七、实验体会

在本次实验中，我们不仅学会了如何设计实验，还充分锻炼了自己的动手操作能力。在设计实验过程中，不仅要查阅大量的资料，还要考虑实验室实验条件的限制。由于实验量大，不仅需要我们进行充分的准备工作，还要我们组员有组织有秩序的进行实验。