抗生素菌种选育的经验与窍门
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26
菌种选育工作的一些技术窍门(二)
• 用平板梯度法筛选抗性菌种
27
菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(一)
用西林小瓶代替摇瓶初筛，菌落直接投入小瓶,置摇 床上振荡发酵，用专用工具直接取发酵液做生物效价。 12×6孔 塑胶板 72根玻璃棒 容积15~20 ml，培养基 装量3~5 ml 的72个西林 小瓶 带12×6孔 盖的特制 不锈钢小 瓶盒，小 瓶之间插 入薄胶皮， 瓶口覆盖8 层纱布
菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(三)
以上样品在小瓶盒内及大盘上的排列为3×3拉丁方 排列，即每个样品在拉丁方内重复实验三次。为了减少 误差，并更有利于统计分析，也可采用以下4×4拉丁方 排列。
小瓶在拉丁 方内的排列 及点样顺序
1 2 3 4 4 3 2 1 3 4 1 2 2 1 4 3
7
白色链霉菌抗性突变株提高盐霉素产量
注： SAM-X/ 无抗性亲株， str/ 抗链霉素突变株，gen/ 抗庆大霉素突 变株， rif/ 抗利福霉素突变株，str-gen/ 链霉素和庆大霉素双抗突变 株，str-gen-rif/链霉素、庆大霉素和利福霉素三抗突变株。
8
一些链霉素抗药突变株的抗生素产率
• 每个月自然分离一次，每次不少于100个菌落。
• 每季度诱变处理或原生质体融合一次，每次筛 选菌落不少于100个。 • 每半年复筛一次，复筛斜面不少于30支，每支 重复试验3次。
• 复筛挑出的斜面要求做冷冻干燥管或液氮管保 藏，每株5支(确定上生产的菌株不少于10支)。 • 每年对冷冻干燥或液氮管保藏的每个菌种随机 抽取1支接斜面进行复试，淘汰不良菌种。
13
常用化学诱变剂的使用方法
诱变剂 使用浓度 缓冲液 HNO2 0.01~0.1 pH4.5 1mol/L mol/L 醋酸缓冲液 HA 0.1%~0.5 % ESM 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 MNNG 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 NMU 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 处理时间 终止反应方法 5~10 min pH8.6 0.07M磷 酸缓冲液 加入培养 稀释 基中 20~120 稀释 min 20~120 稀释 min 15~90 稀释 min
• • • • • • 菌落和细胞形态均一 表面培养产生特征性可溶性色素 沉没培养产生特征性气味 对蛋白质合成和核酸合成抑制剂的耐受力强 对氮源的代谢力强 沉没培养过程中放线菌和霉菌菌丝形态呈现明显 的分化，分化后的菌丝较粗短，不结球 • 生芽胞的细菌能形成较多的芽孢
6
获得高产菌株的主要途径
• 自然分离，随机筛选(高产几率一般低于1%) • 物理、化学诱变，原生质体融合，随机筛选(给 与选择压力后高产几率有一定程度提高) • 蛋白质合成抑制剂抗性筛选 即给与双 • 核酸合成抑制剂抗性筛选 • 生物合成初级代谢中间体类似物抗性 重选择压 力，又称 筛选(解除反馈抑制) 理性化筛 • 终产物水解酶抑制作用筛选 选，可显 • 生物合成瓶颈酶脱抑制/阻遏作用筛选 著地提高 • 反馈抑制剂类似物敏感活性筛选 高产几率 • 重金属抗性筛选
• 初筛只需看相对抑菌圈的大小，如果是复试， 则要求由抑菌圈直径计算出抗生素浓度。 • 要想由抑菌圈直径得出抗生素的效价(浓度)，必 须用抗生素标准品制作标准曲线，即抗生素浓 度(效价)与抑菌圈直径之间的相关关系曲线。 • 标准曲线的制作一般以2倍的等比级数取5个不 同的抗生素浓度，用标准检菌平板反复测量其 抑菌圈，中间浓度的抑菌圈直径应为19~20 mm， 抗生素浓度的对数与抑菌圈直径之间应呈线性 相关，相关系数应大于0.999。
18
原生质体融合育种的一般程序
19
原生质体融合程序图示
带标记的 亲株细胞
原生质体
各种融合子
20
原生质体融合育种的操作步骤
① 诱变、筛选标记菌株并进行稳定性验证 ② 分别培养和收集两个或多个亲株对数生长期的 营养细胞 ③ 将细胞悬浮在高渗溶液中加入溶菌酶、蜗牛酶 或纤维素酶破壁获得原生质体 ④ 两个或多个亲株的等量原生质体加聚乙二醇或 在脉冲电场作用下促进融合 ⑤ 涂布于高渗再生培养基上，再生出菌落 ⑥ 在选择性培养基上划线分离培养，挑取同时具 有两亲株标记的融合子进一步试验、保藏 ⑦ 生产性能测定、筛选
• 控制继代培养特别是产孢子继代培养次数 • 用正常单菌落进行继代培养 • 利用不易退化的细胞形态如菌丝或营养细胞进行 继代培养 • 采用有效的菌种保藏方法(超低温或冷冻干燥) • 定期进行分离纯化(自然复壮) • 加强菌种选育，并在选育过程要诱变筛选与自然 复壮相结合 • 筛选和培养过程中给与选择压力(人没有压力不 进步，物种没有压力不进化)
28
菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(二) 将用玻璃棒蘸取的发酵液移到玻璃大盘检定 平板上，置适温下培养过夜，测量抑菌圈直径。
12×6孔 塑胶板
小瓶在拉丁 方内的排列 及点样顺序
1 2 3 3 1 2 2 3 1
72根 玻璃棒
玻璃大盘
含检菌 的检定 培养基
72个 抑菌圈
29 29
抗生素菌种选育的经验与窍门
河北科技大学生物科学与工程学院 徐亲民 2008年9月
1
为什么要进行菌种选育
• 由于环境因素的影响，抗生素产生菌在继代培养 和保藏过程中容易发生自发突变。在自发突变的 菌落中，约有5%~10%不产抗生素，25%~30%产 量下降， 60%~70% 维持正常产量，产量提高者 不到1% 。 • 因此，日常的菌种选育工作，按快节奏做是走一 步退半步；按慢节奏做是走一步退一步，结果是 不进不退；不去做则只退不进。也就是说，菌种 选育必须作为日常工作快节奏地不停地去做—— 与退化赛跑。
33
抗生素生物测定标准曲线举例
抗生素浓度的对数
抑菌圈直径(mm)
9
抗药性——最低抑(杀)源自文库浓度的确定
抗生素产生菌孢子或细胞定量接种
培养基+某 种抗生素 抗生素浓度 振荡培养 1~3天 读取MIC 转种到无 抗生素琼 脂培养基 读取MBC MIC = 1mg/L 培养 3~5天 MBC = 2mg/L
10
诱变育种的一般程序
出发菌株斜面
制备细胞或孢子悬浮液 离心收集菌体 离心洗涤 玻璃珠振荡分离√ 过滤分离细胞或孢子
注：每个平板上的菌落控制在30~300个较适合于计数
17
原生质体融合育种
• 原生质体融合育种的优点
1. 杂合频率高：放线菌和霉菌的融合频率可达103~101， 细菌和酵母为106~103。 2. 融合范围广：可以在种间甚至属间进行两种或两种以上 亲株的融合，且不受结合型或致育性的限制。 3. 融合子种类多：融合的亲株间可发生多重交叉基因重组， 获得各种不同类型的重组融合子。 4. 遗传物质的传递更完善：在正常融合中遗传物质不易丢 失，不造成遗传缺陷，从而可保留亲株各自的优良性状。 5. 选择性较强：利用药物处理、加热或紫外线照射方法使 一种亲株的原生质体灭活或钝化，可以使融合子中另一种 亲株的遗传性状占优势。
2
菌种退化的表象
• • • • • • • • • 菌落和细胞形态改变 表面培养产生的可溶性色素改变 生长速度减慢 产孢子或芽胞数量减少甚至缺失 沉没培养细胞分化能力减弱 对氮代谢的活力下降 对抗生素及其他有毒物质的抗性减弱 对外界不良环境条件的抵抗力下降 代谢产物生产能力下降
3
防止菌种退化的方法
14
各种诱变剂引起弗氏链霉菌突变的频率
注：Spont/自发突变，UV/紫外线，HA/羟胺，EMS/甲 磺酸乙酯，MMS/甲磺酸甲酯，NQO/4-硝基喹啉-1-氧化 物，MNNG/N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍，CM/氯霉素
15
孢子(细胞)悬浮液系列稀释法
菌悬液
稀释：
16
孢子(细胞)平板活计数法
• 常用化学诱变剂
盐酸羟胺(HA) 亚硝酸(HNO2) 甲磺酸甲酯(MSM) 甲磺酸乙酯(ESM) N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG) 亚硝基甲基脲(NMU)
12
诱变剂的使用剂量
• 不同的菌种和菌株以及同一菌株的营养细 胞和孢子对各种诱变剂的耐受程度有很大 差异，因此使用剂量也会有一定的差异。 • 使用剂量一般控制诱变后的细胞或孢子死 亡率在70%~90%以内。 • 因此，诱变前后的细胞活计数是必不可少 的操作步骤。
25
菌种选育工作的一些技术窍门(一)
• 用稀薄培养基短发酵周期初筛获得前期发 酵高单位菌种，这样的菌种更容易放大到 生产。 • 用大装量摇瓶筛选获得需氧量少亦即耗糖 少的菌种，放大生产后有利于节约能源和 原材料成本。 • 用透明的平板分离培养基便于观察菌落形 态和色素，积累高产菌株形态学方面的知 识和经验。
22
培养和收集放线菌菌丝体的简易方法
在琼脂培养基表面覆盖事先 灭菌的孔径0.45 μm 微孔滤膜， 将斜面菌种孢子悬浮液接种到滤 膜上，置适温下培养，孢子穿透 滤膜发芽，在滤膜上生长出大量 菌丝，揭下滤膜，即可获得纯粹 的菌丝体。
培养皿 0.45 μm微孔滤膜
琼脂培养基
23
对菌种选育工作量的最低要求
4
菌种选育的目标
• 目标代谢产物产量高 • 代谢产物中同系物少 • 单位生物量的代谢耗糖少，相应地耗氧和代谢 热也少 • 生长速度快 • 对原材料的选择范围广 • 对高温和不良环境的耐受力强 • 沉没培养菌丝粗短，不结球，流变学性能好， 有利于混合及氧的传递 • 代谢产物向胞外分泌性能好
5
高产菌种的一般特性
24
对菌种选育工作的技术要求
• 对复筛数据要进行统计分析，包括t-检验和方差 分析。 • 对准备上生产的新菌种，要做代谢曲线，包括 菌浓、pH、糖、氮随时间变化的曲线，同时做 显微镜检细胞形态随时间变化的图像记录，有 摇瓶的，也有小试验罐的。 • 对准备上生产的新菌种，要做发酵条件试验， 包括最适温度、pH、种龄、最适C、N源、C/N 比、无机磷、微量元素等。
容纳6个4× 4拉丁方的 玻璃大盘 含检菌的检 定培养基 96个 抑菌圈
30 30
菌种选育工作的一些技术窍门(四)
• 用菌落琼脂块法快速初筛
橡皮头
金属或 玻璃管
取菌落琼 脂块工具
31
由牛津杯滴样得到的抑菌圈
所得抑菌圈边沿应该清晰，以便测量。不清 晰的抑菌圈测量误差大。
32
生物测定标准曲线的制作
对链霉 筛选抗链霉 亲株产生的 高产抗链霉 检出最 素的 素突变株的 抗生素及产 素突变株的 高产率 MIC 链霉素浓度 率(mg/ml) 检出频率(%) (mg/ml) S. chattanoogensis 1 30 Fredericamy46/100 260 cin/10 S. Antibioticus 1 5 2/50 63 放线菌素/12 S. lavendulae 1 5 Formycin/25 2/60 130 Pyrrolnitrin/1.5 P. pyrrocinia 100 300 30/100 15 FR900493 (76) B. cereus 1 3 9/70 550 B. subtilisa 1 5 7/240 380 抗生素/8 1 400 37/194 80 抗生素/8 抗生素产生菌
细胞或孢子悬浮液 诱变剂处理 细胞活计数
细胞活计数 初筛摇瓶发酵 初筛高产斜面 复筛摇瓶发酵
突变株单菌落分离 斜面 斜面
复筛高产斜面 保藏
菌种特性及生产能力试验
11 11
诱变育种常用的诱变剂
• 常用物理诱变剂
紫外线(UV)——采用波长2537Å、功率30~40W的紫外灯 X射线——采用医用X光机 Γ射线——以60Co或137Cs为射线源
21
灭活原生质体融合
• 采用热、紫外线、电离辐射、化学药物等处理一 个或多个亲株，使其灭活而失去再生能力，由此 获得的不能单独再生的原生质体称为灭活原生质 体。 • 这种灭活原生质体经融合后，由于损伤部位的互 补，可以产生具有再生能力的融合子。 • 采用双灭活亲株的原生质体融合，勿须对亲株进 行诱变标记，即省略了操作步骤，又避免了由诱 变造成的遗传损害。 • 灭活处理的条件应尽量温和，以保持亲株细胞的 遗传功能与重组再生能力。
菌种选育工作的一些技术窍门(二)
• 用平板梯度法筛选抗性菌种
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菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(一)
用西林小瓶代替摇瓶初筛，菌落直接投入小瓶,置摇 床上振荡发酵，用专用工具直接取发酵液做生物效价。 12×6孔 塑胶板 72根玻璃棒 容积15~20 ml，培养基 装量3~5 ml 的72个西林 小瓶 带12×6孔 盖的特制 不锈钢小 瓶盒，小 瓶之间插 入薄胶皮， 瓶口覆盖8 层纱布
菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(三)
以上样品在小瓶盒内及大盘上的排列为3×3拉丁方 排列，即每个样品在拉丁方内重复实验三次。为了减少 误差，并更有利于统计分析，也可采用以下4×4拉丁方 排列。
小瓶在拉丁 方内的排列 及点样顺序
1 2 3 4 4 3 2 1 3 4 1 2 2 1 4 3
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白色链霉菌抗性突变株提高盐霉素产量
注： SAM-X/ 无抗性亲株， str/ 抗链霉素突变株，gen/ 抗庆大霉素突 变株， rif/ 抗利福霉素突变株，str-gen/ 链霉素和庆大霉素双抗突变 株，str-gen-rif/链霉素、庆大霉素和利福霉素三抗突变株。
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一些链霉素抗药突变株的抗生素产率
• 每个月自然分离一次，每次不少于100个菌落。
• 每季度诱变处理或原生质体融合一次，每次筛 选菌落不少于100个。 • 每半年复筛一次，复筛斜面不少于30支，每支 重复试验3次。
• 复筛挑出的斜面要求做冷冻干燥管或液氮管保 藏，每株5支(确定上生产的菌株不少于10支)。 • 每年对冷冻干燥或液氮管保藏的每个菌种随机 抽取1支接斜面进行复试，淘汰不良菌种。
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常用化学诱变剂的使用方法
诱变剂 使用浓度 缓冲液 HNO2 0.01~0.1 pH4.5 1mol/L mol/L 醋酸缓冲液 HA 0.1%~0.5 % ESM 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 MNNG 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 NMU 0.1~1.0 pH7.0 0.1mol/L g/L 磷酸缓冲液 处理时间 终止反应方法 5~10 min pH8.6 0.07M磷 酸缓冲液 加入培养 稀释 基中 20~120 稀释 min 20~120 稀释 min 15~90 稀释 min
• • • • • • 菌落和细胞形态均一 表面培养产生特征性可溶性色素 沉没培养产生特征性气味 对蛋白质合成和核酸合成抑制剂的耐受力强 对氮源的代谢力强 沉没培养过程中放线菌和霉菌菌丝形态呈现明显 的分化，分化后的菌丝较粗短，不结球 • 生芽胞的细菌能形成较多的芽孢
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获得高产菌株的主要途径
• 自然分离，随机筛选(高产几率一般低于1%) • 物理、化学诱变，原生质体融合，随机筛选(给 与选择压力后高产几率有一定程度提高) • 蛋白质合成抑制剂抗性筛选 即给与双 • 核酸合成抑制剂抗性筛选 • 生物合成初级代谢中间体类似物抗性 重选择压 力，又称 筛选(解除反馈抑制) 理性化筛 • 终产物水解酶抑制作用筛选 选，可显 • 生物合成瓶颈酶脱抑制/阻遏作用筛选 著地提高 • 反馈抑制剂类似物敏感活性筛选 高产几率 • 重金属抗性筛选
• 初筛只需看相对抑菌圈的大小，如果是复试， 则要求由抑菌圈直径计算出抗生素浓度。 • 要想由抑菌圈直径得出抗生素的效价(浓度)，必 须用抗生素标准品制作标准曲线，即抗生素浓 度(效价)与抑菌圈直径之间的相关关系曲线。 • 标准曲线的制作一般以2倍的等比级数取5个不 同的抗生素浓度，用标准检菌平板反复测量其 抑菌圈，中间浓度的抑菌圈直径应为19~20 mm， 抗生素浓度的对数与抑菌圈直径之间应呈线性 相关，相关系数应大于0.999。
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原生质体融合育种的一般程序
19
原生质体融合程序图示
带标记的 亲株细胞
原生质体
各种融合子
20
原生质体融合育种的操作步骤
① 诱变、筛选标记菌株并进行稳定性验证 ② 分别培养和收集两个或多个亲株对数生长期的 营养细胞 ③ 将细胞悬浮在高渗溶液中加入溶菌酶、蜗牛酶 或纤维素酶破壁获得原生质体 ④ 两个或多个亲株的等量原生质体加聚乙二醇或 在脉冲电场作用下促进融合 ⑤ 涂布于高渗再生培养基上，再生出菌落 ⑥ 在选择性培养基上划线分离培养，挑取同时具 有两亲株标记的融合子进一步试验、保藏 ⑦ 生产性能测定、筛选
• 控制继代培养特别是产孢子继代培养次数 • 用正常单菌落进行继代培养 • 利用不易退化的细胞形态如菌丝或营养细胞进行 继代培养 • 采用有效的菌种保藏方法(超低温或冷冻干燥) • 定期进行分离纯化(自然复壮) • 加强菌种选育，并在选育过程要诱变筛选与自然 复壮相结合 • 筛选和培养过程中给与选择压力(人没有压力不 进步，物种没有压力不进化)
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菌种选育工作的一些技术窍门(三)
• 用西林小瓶法快速初筛(二) 将用玻璃棒蘸取的发酵液移到玻璃大盘检定 平板上，置适温下培养过夜，测量抑菌圈直径。
12×6孔 塑胶板
小瓶在拉丁 方内的排列 及点样顺序
1 2 3 3 1 2 2 3 1
72根 玻璃棒
玻璃大盘
含检菌 的检定 培养基
72个 抑菌圈
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抗生素菌种选育的经验与窍门
河北科技大学生物科学与工程学院 徐亲民 2008年9月
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为什么要进行菌种选育
• 由于环境因素的影响，抗生素产生菌在继代培养 和保藏过程中容易发生自发突变。在自发突变的 菌落中，约有5%~10%不产抗生素，25%~30%产 量下降， 60%~70% 维持正常产量，产量提高者 不到1% 。 • 因此，日常的菌种选育工作，按快节奏做是走一 步退半步；按慢节奏做是走一步退一步，结果是 不进不退；不去做则只退不进。也就是说，菌种 选育必须作为日常工作快节奏地不停地去做—— 与退化赛跑。
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抗生素生物测定标准曲线举例
抗生素浓度的对数
抑菌圈直径(mm)
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抗药性——最低抑(杀)源自文库浓度的确定
抗生素产生菌孢子或细胞定量接种
培养基+某 种抗生素 抗生素浓度 振荡培养 1~3天 读取MIC 转种到无 抗生素琼 脂培养基 读取MBC MIC = 1mg/L 培养 3~5天 MBC = 2mg/L
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诱变育种的一般程序
出发菌株斜面
制备细胞或孢子悬浮液 离心收集菌体 离心洗涤 玻璃珠振荡分离√ 过滤分离细胞或孢子
注：每个平板上的菌落控制在30~300个较适合于计数
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原生质体融合育种
• 原生质体融合育种的优点
1. 杂合频率高：放线菌和霉菌的融合频率可达103~101， 细菌和酵母为106~103。 2. 融合范围广：可以在种间甚至属间进行两种或两种以上 亲株的融合，且不受结合型或致育性的限制。 3. 融合子种类多：融合的亲株间可发生多重交叉基因重组， 获得各种不同类型的重组融合子。 4. 遗传物质的传递更完善：在正常融合中遗传物质不易丢 失，不造成遗传缺陷，从而可保留亲株各自的优良性状。 5. 选择性较强：利用药物处理、加热或紫外线照射方法使 一种亲株的原生质体灭活或钝化，可以使融合子中另一种 亲株的遗传性状占优势。
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菌种退化的表象
• • • • • • • • • 菌落和细胞形态改变 表面培养产生的可溶性色素改变 生长速度减慢 产孢子或芽胞数量减少甚至缺失 沉没培养细胞分化能力减弱 对氮代谢的活力下降 对抗生素及其他有毒物质的抗性减弱 对外界不良环境条件的抵抗力下降 代谢产物生产能力下降
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防止菌种退化的方法
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各种诱变剂引起弗氏链霉菌突变的频率
注：Spont/自发突变，UV/紫外线，HA/羟胺，EMS/甲 磺酸乙酯，MMS/甲磺酸甲酯，NQO/4-硝基喹啉-1-氧化 物，MNNG/N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍，CM/氯霉素
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孢子(细胞)悬浮液系列稀释法
菌悬液
稀释：
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孢子(细胞)平板活计数法
• 常用化学诱变剂
盐酸羟胺(HA) 亚硝酸(HNO2) 甲磺酸甲酯(MSM) 甲磺酸乙酯(ESM) N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG) 亚硝基甲基脲(NMU)
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诱变剂的使用剂量
• 不同的菌种和菌株以及同一菌株的营养细 胞和孢子对各种诱变剂的耐受程度有很大 差异，因此使用剂量也会有一定的差异。 • 使用剂量一般控制诱变后的细胞或孢子死 亡率在70%~90%以内。 • 因此，诱变前后的细胞活计数是必不可少 的操作步骤。
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菌种选育工作的一些技术窍门(一)
• 用稀薄培养基短发酵周期初筛获得前期发 酵高单位菌种，这样的菌种更容易放大到 生产。 • 用大装量摇瓶筛选获得需氧量少亦即耗糖 少的菌种，放大生产后有利于节约能源和 原材料成本。 • 用透明的平板分离培养基便于观察菌落形 态和色素，积累高产菌株形态学方面的知 识和经验。
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培养和收集放线菌菌丝体的简易方法
在琼脂培养基表面覆盖事先 灭菌的孔径0.45 μm 微孔滤膜， 将斜面菌种孢子悬浮液接种到滤 膜上，置适温下培养，孢子穿透 滤膜发芽，在滤膜上生长出大量 菌丝，揭下滤膜，即可获得纯粹 的菌丝体。
培养皿 0.45 μm微孔滤膜
琼脂培养基
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对菌种选育工作量的最低要求
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菌种选育的目标
• 目标代谢产物产量高 • 代谢产物中同系物少 • 单位生物量的代谢耗糖少，相应地耗氧和代谢 热也少 • 生长速度快 • 对原材料的选择范围广 • 对高温和不良环境的耐受力强 • 沉没培养菌丝粗短，不结球，流变学性能好， 有利于混合及氧的传递 • 代谢产物向胞外分泌性能好
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高产菌种的一般特性
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对菌种选育工作的技术要求
• 对复筛数据要进行统计分析，包括t-检验和方差 分析。 • 对准备上生产的新菌种，要做代谢曲线，包括 菌浓、pH、糖、氮随时间变化的曲线，同时做 显微镜检细胞形态随时间变化的图像记录，有 摇瓶的，也有小试验罐的。 • 对准备上生产的新菌种，要做发酵条件试验， 包括最适温度、pH、种龄、最适C、N源、C/N 比、无机磷、微量元素等。
容纳6个4× 4拉丁方的 玻璃大盘 含检菌的检 定培养基 96个 抑菌圈
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菌种选育工作的一些技术窍门(四)
• 用菌落琼脂块法快速初筛
橡皮头
金属或 玻璃管
取菌落琼 脂块工具
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由牛津杯滴样得到的抑菌圈
所得抑菌圈边沿应该清晰，以便测量。不清 晰的抑菌圈测量误差大。
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生物测定标准曲线的制作
对链霉 筛选抗链霉 亲株产生的 高产抗链霉 检出最 素的 素突变株的 抗生素及产 素突变株的 高产率 MIC 链霉素浓度 率(mg/ml) 检出频率(%) (mg/ml) S. chattanoogensis 1 30 Fredericamy46/100 260 cin/10 S. Antibioticus 1 5 2/50 63 放线菌素/12 S. lavendulae 1 5 Formycin/25 2/60 130 Pyrrolnitrin/1.5 P. pyrrocinia 100 300 30/100 15 FR900493 (76) B. cereus 1 3 9/70 550 B. subtilisa 1 5 7/240 380 抗生素/8 1 400 37/194 80 抗生素/8 抗生素产生菌
细胞或孢子悬浮液 诱变剂处理 细胞活计数
细胞活计数 初筛摇瓶发酵 初筛高产斜面 复筛摇瓶发酵
突变株单菌落分离 斜面 斜面
复筛高产斜面 保藏
菌种特性及生产能力试验
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诱变育种常用的诱变剂
• 常用物理诱变剂
紫外线(UV)——采用波长2537Å、功率30~40W的紫外灯 X射线——采用医用X光机 Γ射线——以60Co或137Cs为射线源
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灭活原生质体融合
• 采用热、紫外线、电离辐射、化学药物等处理一 个或多个亲株，使其灭活而失去再生能力，由此 获得的不能单独再生的原生质体称为灭活原生质 体。 • 这种灭活原生质体经融合后，由于损伤部位的互 补，可以产生具有再生能力的融合子。 • 采用双灭活亲株的原生质体融合，勿须对亲株进 行诱变标记，即省略了操作步骤，又避免了由诱 变造成的遗传损害。 • 灭活处理的条件应尽量温和，以保持亲株细胞的 遗传功能与重组再生能力。