疫苗的制备

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2. 毒种种子批的建立及检定 • 建立:以毒种为基础传代(5代以内得成品疫苗) • 检定:血凝素型别鉴定试验 血凝抑制试验
单向免疫扩散试验 病毒滴度:鸡胚半数感染剂量法 血凝滴度:血凝法 无菌检查、支原体检查 外源性禽白血病病毒、禽腺病毒检测:ELISA • 保存:冻干毒种-20℃以下,液体毒种-60℃以下
用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线,即定量 检测未知标本的抗原浓度
酶联免疫吸附测定
将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶 标记的抗原抗体反应在固相表面进行的反应
用于检测特异性抗原和抗体 特点:快速、灵敏、简便、载体易于标准化等 分类:间接法、夹心法、竞争法
尘土和被服上可生存数月至一年半之久 • 临床表现:主要为严重毒血症状、皮肤成批依次出
现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱,最后结痂、脱痂,遗 留痘疤。 • 传播途径:飞沫吸入或直接接触。 • 特点:发展迅速,未免疫人群感染后 15-20天内致 死率高达30%。
疫苗的产生
天花的防治——中国
• 宋真宗时期(998- 1023年) :人痘法, 吸入天花病人痂粉预防天花。
人为处理使病原微生物失去毒力或降低毒力
用无毒卡介菌(结核菌)人工接种进行初次感染,经 过巨噬细胞的加工处理,将其抗原信息传递给免疫活性 细胞,使T细胞分化增殖,形成致敏淋巴细胞,当机体再 遇到结核菌感染时,巨噬细胞和致敏淋巴细胞迅速被激 活,执行免疫功能,引起特异性免疫反应。
基因重组疫苗技术——第二次疫苗革命
疫苗
✓组成 ✓作用原理 ✓类型与特点
组成
疫苗的组成:具有免疫保护性的抗原如蛋白质、多 肽、多糖或核糖等与免疫佐剂混合制备而成。 抗原是指能刺激机体产生免疫反应的物质。 佐剂是指非特异性地增强免疫应答或改变免疫应答 类型的物质,可先与抗原或与抗原一起注入机体。 佐剂增强免疫应答的机制是: ①通过改变抗原的物理性状,延长抗原在机体内保
(1)鸡胚 毒 种 传 代 和 制 备 : 来 源 于 SPF ( Specific
pathogen Free)鸡群 疫苗生产:来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡
群、9-11日龄无畸形、血管清晰、活动 (2)毒种 WHO推荐并提供的甲型和乙型流感病毒株
2. 毒种种子批的建立及检定
符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规 定
抗原变异很慢 局限性流行,对人类致病性较低
丙型流感病毒(Influenza C virus)
抗原稳定 致病力较弱,主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群
,只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染
流感全病毒灭活疫苗
(一)制备方法 1. 生产用原材料 鸡胚是分离各类病毒的较为理想的材料
尿囊腔
花 • 1798年,医学界正式承认“疫苗接种确实是一
种行之有效的免疫方法”。 • 细胞培养法获得天花病毒——牛痘苗
Jenner是牛痘的发明者,但Jenner并不清楚为 什 么 牛 痘 能 够 预 防 天 花 。 1870 年 , 法 国 科 学 家 Pasteur在对鸡霍乱病的研究中发现,将鸡霍乱弧 菌连续培养几代,可以将细菌的毒力降到最低,
最早的治疗性疫苗:狂犬病疫苗
疫苗的制备方法
灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗 减毒活疫苗——皮内注射用卡介苗 基因工程重组亚单位疫苗——重组乙型肝炎疫苗 生化提取亚单位组分疫苗——吸附破伤风疫苗 治疗性疫苗——前列腺癌疫苗Sipuleucel-T
疫苗生产的一般流程
灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗
给鸡接种这种减毒细菌后,可使鸡获得对霍乱的 免疫力,从而发明了第一个细菌减毒活疫苗—— 鸡霍乱疫苗。Pasteur将此归纳为对动物接种什么 细菌疫苗就可以使其不受该细菌感染的免疫接种
原理,从而奠定了疫苗的理论基础。因此,人们 把法国科学家Pasteur称为疫苗之父。
疫苗的产生
疫苗之父---法国免疫学家 Louis Pasteur • 鸡霍乱弧菌减毒株(第一个细菌减毒活疫苗)
1986年应用基因工程制备的乙型肝炎表面抗原获得 成功,并正式作为乙肝疫苗用于临床,成为最具典型意 义的第二次疫苗革命的产物。最初的乙肝疫苗是从乙肝 表面抗原阳性的携带者血浆中提取的,这对接种乙肝疫 苗的健康人群来讲其危险性是显而易见的。将乙肝表面 抗原的基因克隆到酵母菌等真核细胞中,其表达的抗原 分子具有和血源疫苗一样的结构和免疫原性。用基因重 组制备乙肝疫苗,生产简单、快速、成本低。乙肝基因 重组疫苗不仅安全、效果好,而且可以源源不断地供应 临床,不必像乙肝血源那样担心阳性血浆的来源和供应 问题。
疫苗如何制备
梁静茹 罗飞 罗亚辉 张萌
疫苗主要指将病原微 生物(细菌、病毒、 真菌、立克次氏体、 支原体、衣原体等) 及其代谢产物,经过 人工减毒、灭火或利 用基因工程等方法制 成的用于预防传染病 的免疫佐剂,例如流 感疫苗、乙肝疫苗、 霍乱疫苗等。
疫苗的产生
天花(Smallpox)
• 由天花病毒引起的一种烈性传染病 • 天花病毒:呈砖形,能对抗干燥和低温,在痂皮、
核酸疫苗
也称基因疫苗(genetic vaccine),包括DNA疫 苗和RNA疫苗。 由抗原的编码基因和载体组成,导入机体细胞 后可通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱 导宿主产生细胞和体液免疫应答的疫苗制剂。
治疗性疫苗
在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机 体中,通过诱导特异性的免疫应答,达到治疗 或防止疾病恶化的疫苗制品。
减毒活疫苗
优点: 接种次数少,反应小,免疫效果好(体液免
疫、细胞免疫、黏膜免疫),成本低
缺点: 稳定性差,有毒力返祖现象,污染环境,免
疫缺陷者不能接种
灭活疫苗
将病原体经培养增殖、灭活、纯化处理后获得 的保留病原体几乎全部组分的疫苗制品。
特点:失去了病原体的感染性,但保留了较强的 免疫原性和较好的安全性
3. 单价原液的制备 各流感病毒工作种子批分别接种 (尿囊腔),33-35℃培养48-72h 病毒收ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ(尿囊液) 收获液检定
微生物限度:菌数<105CFU/ml,沙门氏菌为阴性 血凝滴度 收获液合并
3. 单价原液的制备 病毒灭活(甲醛≤200μg/ml)、验证及内毒素
含量测定 浓缩(超滤)、纯化(柱色谱法、蔗糖密度区
2. 半成品的检定 游离甲醛含量≤50μg/剂 硫柳汞含量≤50μg/剂 血凝素含量:配制量的80%-120% 无菌检查
3. 成品的检定 鉴别:单向免疫扩散试验 外观:乳白色液体,无异物 pH值:6.8-8.0 硫柳汞含量≤ 50μg/剂 蛋白质含量≤ 200μg/剂 血凝素含量:配制量的80%-120% 卵清蛋白含量≤ 250 ng/剂 抗生素残留量≤ 50 ng/剂
基因重组技术研究相关基因和蛋白质产物
反向疫苗学技术——第三次疫苗革命
2000年6月26日美国Celera公司等宣布人类基因组测序的 完成,标志着人类进入了后基因组时代。随着这个时代的 到来,生物科学从基因组学到蛋白质组学的新的研究模式 已经初步形成,疫苗研究也开始改变过去从表型分析入手 的思维方式,而是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反 应的候选抗原。这种以基因组为基础的疫苗发展策略,有 人称之为反向疫苗学。 反向疫苗学技术主要包括三个技术步骤: 1. 基因组信息分析结合基因芯片筛选候选疫苗成分 2. 高通量基因重组表达候选疫苗蛋白成分 3. 免疫保护性检测
护。
类型与特点
1. 减毒活疫苗 2. 灭活疫苗 3. 亚单位疫苗 4. 联合疫苗 5. 核酸疫苗 6. 治疗性疫苗
减毒活疫苗
通过一定方法使病原体的致病性减弱或丧失后 获得的由完整微生物组成的疫苗制品
特点:能引发机体感染但不发生临床症状,但其 免疫原性可引发机体免疫反应,刺激机体产生特 异性的记忆B细胞和记忆T细胞,起到获得长期或 终生保护的作用。
留时间; ②刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力; ③刺激淋巴细胞分化,增加扩大免疫应答的能力。
作用原理
当机体通过注射或口服 等途径接种疫苗后,疫苗中 的抗原分子就会发挥免疫原 性作用,刺激机体免疫系统 产生高效价特异性的免疫保 护物质,如特异性抗体、免 疫细胞及细胞因子等,当机 体再次接触到相同病原菌抗 原时,机体的免疫系统便会 依循其免疫记忆,迅速制造 出更多的保护物质来阻断病 原菌的入侵,从而使机体获 得针对病原体特异性的免疫 力,使其免受侵害而得到保
或旧亚型重现引起 甲型流感病毒根据H (hemagglutinin,血凝素)
和N (neuraminidase,神经氨酸酶)抗原不同分 为许多亚型,H有17个亚型(H1~H17),N有10 个亚型(N1~N10)。 H1、H5、H7亚型为高致病性
流感病毒
乙型流感病毒(Influenza B virus)
血凝抑制实验
一种测定抗原或抗体的技术 血凝现象:有血凝素的病毒能凝集人或动物红细
胞 血凝抑制试验:血凝现象被相应抗体抑制
单向免疫扩散实验
将一定量抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板,在适当 位置打孔后将抗原加入孔中,抗原扩散过程中与板 中抗体相遇,形成以抗原孔为中心的沉淀环
沉淀环直径或面积与抗原浓度呈正相关
类型与特点
联合疫苗
两种或两种以上抗原物理混合后制成的疫苗制剂。 多联疫苗(multi-combined vaccine):预防不同 病原微生物引起的传染病(例:百白破) 多价疫苗(multivalent vaccine):预防由同一病 原微生物不同亚型引起的传染病(例:23价肺炎多 糖疫苗)
• 明朝隆庆年间(1567-1572年):痘衣法、痘浆法、 旱痘法和水苗法等多种接种方法出现。
• 清朝顺治死于天花,得过天花的康熙继位 • 人痘法的缺点:有时也会引起严重的天花
疫苗的产生
天花的防治——欧洲
• 1721年,人痘接种法传入英国 • 1796年,英国医生E. Jenner 利用牛痘防治天
灭活疫苗
优点: 稳定性好,反应小,免疫缺陷者也可接种
缺点: 需多次接种,免疫效果较差(体液免疫),需
要量大
亚单位疫苗
利用微生物的某种表面结构成分制成的能诱发机 体产生抗体的疫苗制品。
分类: 1. 纯化亚单位疫苗:单个蛋白或寡糖组成、佐剂 2. 合成肽亚单位疫苗:抗病毒/肿瘤/细菌、寄生
虫 感染 3. 基因工程亚单位疫苗
带离心)及过滤除菌(硫柳汞) 单价原液保存(2-8℃)
4. 半成品的制备 对单价原液根据相同血凝素含量进行配制:15-
18μg/剂 补加硫柳汞 5. 成品的制备 半成品分批、分装及冻干后包装:0.5-1.0ml/剂,
含各型流感病毒株血凝素为15μg/剂
(二)检定要求
1. 单价原液的检定 鉴别试验:血凝抑制试验、单向免疫扩散试验 病毒灭活验证试验:鸡胚存活率、血凝试验 血凝素含量检测:单向免疫扩散试验
本品系用世界卫生组织 (WHO)推荐的并经国家 食品药品监督管理局批 准的流感病毒株,分别 接种鸡胚,经培养、收 获病毒液,病毒灭活、 浓缩和纯化后制成。
用于预防本株病毒引起 的流行性感冒
流感病毒
甲型流感病毒
最容易发生变异(抗原转变、抗原漂移) 世界性流感大流行:甲型流感病毒出现新亚型
疫苗及其技术的发展简史
✓减毒活疫苗制备——第一次疫苗革命 ✓基因重组疫苗技术——第二次疫苗革命 ✓反向疫苗学技术——第三次疫苗革命
减毒活疫苗制备(卡介苗)——第一次疫苗革命
Calmette和Guerin将一株从母牛分离到的牛型结核杆 菌在含有公牛胆汁的培养基上连续培养230代,经过13年 后获得了减毒的卡介苗(BCG),这种菌苗首先使敏感动 物豚鼠不再感染结核杆菌。卡介苗于1921年首次给一名 新生儿经口服途径进行免疫,婴儿服用疫苗后无任何副 反应。这名婴儿在其母亲死于肺结核病后虽与患有结核 病的外祖母一起生活,与结核杆菌有密切接触,但是在 他的一生中却没有患结核病。由于卡介苗既安全又有效, 到了20世纪20年代末,在法国已有5万婴儿服用了卡介苗。 此后,卡介苗的使用由口服改成皮内注射。从1928年开 始,卡介苗在全世界广泛使用,至今已在182个国家和地 区对40多亿的儿童接种了卡介苗。
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