4组织培养第四章 器官培养
植物组织培养 期末复习
绪论植物组织培养（Tissue culture）：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。
器官：根、茎、叶、花、果实、种子；组织：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等。
或指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体，放在离体无菌人工控制的环境条件下培养，对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
组织（tissue)、器官（organ)或细胞培养：指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养，使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。
愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
原生质体培养指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，依据细胞全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。
植物组织培养特点：①培养条件可以人为控制；②生长周期短，繁殖率高；③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制()。
1、植物组织培养的理论基础—细胞全能性：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
2、植物细胞全能性的表达：①脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
②再分化（redifferentiation)：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。
离体的植物器官、组织、细胞→脱分化形成愈伤组织→再分化形成根、芽→再生植株。
4、组织培养植株再生的途径：1）、体细胞胚胎发生途径(胚状体发生途径)：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期)，形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。
第四章 器官培养
第四章器官培养植物器官培养主要是指包括离体的根、茎、叶、花器和果实、种子的无菌培养。
以器官作为外植体进行离体培养的植物种类最多，应用的范围也最广，它是植物组织培养中最主要的一个方面。
植物器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法，而且在生产实践上具有重要的应用价值。
如利用茎、叶和花器培养建立的试管培养物，可在短期内提高繁殖速率，从而实现名、优、特、新品种的快速繁殖；利用茎尖培养可以获得脱毒试管苗，解决品种的退化问题；将植物器官作诱变处理和培养可获得突变株，进行细胞的突变育种。
另外，器官培养也是种质保存的有效手段。
第一节根的培养离体根的培养是进行根系生理和代谢研究最优良的实验体系。
因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无菌和不受微生物的干扰，可以通过改变培养基的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化；在工厂化生物反应器系统中通过工艺调控实现根的大规模培养不受环境和季节的限制，可以随时随地生产离体根的培养物，进行药物、微量活性物质及一系列次生代谢产物的工厂化生产。
另一方面通过根细胞的培养可再生植株，用于生产实践。
一、根无性繁殖系的建立1.外植体根的培养材料一般来自无菌种子发芽产生的幼根或植株根系经消毒处理后的切段。
2.根无性繁殖系的建立将种子消毒后在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖（或植株的根系经表面灭菌后）接种于培养基中。
这些根的培养物生长甚快，几天后发育出侧根。
待侧根生长约1周后，即切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进行培养，如此反复切接就可得到从单个根尖衍生的无性繁殖系。
二、培养方法1.植株的再生培养根离体培养再生出植株的方法是：先诱导离体根形成愈伤组织，再在再分化培养基上诱导芽的分化，进而形成小植株。
如果愈伤组织先分化形成根，则往往抑制芽的形成。
2.固氮培养将具有固氮作用的根瘤菌接种到禾谷类等作物的试管苗根系中，并在诱瘤剂的诱导下使根瘤菌侵入试管苗根部结瘤固氮，从而实现谷物直接利用生物固氮的捷径。
植物组织培养技术第三章第四章植物器官的培养
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
1、 取材 、
取1-2㎝顶梢 ①直接取材：在生长旺盛、枝 直接取材：在生长旺盛、 条健壮、 条健壮、无病的母株上选生 长不久、杂菌污染少的顶梢 长不久、 （1－2cm）（取前可喷杀菌 cm）（取前可喷杀菌 ）（ 药，可顶芽或侧芽）。 可顶芽或侧芽）。 ②从试管苗获取。 从试管苗获取。
第一节 一、离体根的培养 意义： （一） 意义： ①生理代谢研究的优良实验体系 ②研究器官分化形态建成的良好体系 ③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种 营养器官的培养
营养器官的培养——根的培养 营养器官的培养——根的培养
（二） 培养方法 1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 培养基； 或 培养基 培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入 B1、B6最重要 生长素对离体根影响不一致。 最重要， B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养 温度25 27℃，暗光培养。 25－ 温度25－27℃，暗光培养。
离 体 根
脱分化培养基
愈 伤 组 织
再分化培养基
分 化 芽
再 生 植 株
植物器官的培养
二、茎尖的培养
•1.茎尖培养概念及类型 1.茎尖培养概念及类型 1. •2.茎尖培养方法及步骤 2.茎尖培养方法及步骤 2.
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
（一）茎尖培养概念及类型
茎尖培养： 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行 无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 微茎尖培养 带有1-2个叶原基的生长锥, 其长度不超过0.5mm 普通茎尖培养： 普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便， 茎尖容易成活，成苗所需时间短
植物组织培养技术
楚雄师范学院化学与生命科学系生物技术专业《植物组织培养技术》课程教学大纲一、课程基本信息课程代码：031106014课程中文名称：植物组织培养技术课程英文名称：Plant Tissue Culture Technology课程性质：专业选修课使用专业：生物技术专业、葡萄与葡萄酒工程专业开课学期：第7学期总学时：36+27总学分：3预修课程：植物学、植物生理学课程简介植物组织培养技术是将植物的离体材料器官、组织、细胞、原生质体等）无菌培养，使其生长、分化，进而再生完整植株的无性繁殖技术，是实践性较强的专业课之一。
本课程在介绍了组织培养的含义、特点及其意义；组织培养的概念、类型、特点；组织培养技术的基本原理及操作规范；组织培养的发展简史、发展趋势及其应用。
通过本课程的学习，使学生掌握组培实验室、家庭组培室、组培育苗工厂的组成、设计原则与设计要求；熟练掌握各种培养基的特点与应用；熟练掌握茎尖、茎段、叶及花器官培养消毒灭菌、接种及培养的技术；理解种质资源离体保存的意义，掌握种质资源离体保存常用方法；掌握一些常见植物的组培脱毒与快繁技术的应用。
教材建议《植物组织培养原理与技术》，李胜、李唯主编，化学工业出版社，2008年。
参考书《植物细胞组织培养》，刘庆昌编著，北京：中国农业大学出版社，2002年，标准书号：7-81066-529-4。
《植物组织培养（第三版）》，潘瑞炽编著，广州：广东高等教育出版社，2003年，标准书号：7-5361-2501-1。
《植物组织培养教程》，李浚明编著，北京：中国农业大学出版社，1996年，标准书号：7-81066-466-2。
《高等植物组织离体培养的形态建成及调控》，黄学林编著，北京：科学技术出版社，1995 年，标准书号：7-03-004377-4。
《植物组织培养》，王水琦编著，北京：中国轻工业出版社，2007年，标准书号：978-7-5019-5818-4。
《植物组织与细胞培养》，陈耀锋编著，北京：中国农业出版社，2007年，标准书号: 978-7-109-11844-7。
第四章植物器官的培养
第四章植物器官的培养1、器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。
以器官作为外植体进行离体培养。
器官培养的意义:研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成在生产实践上具有重要的应用价值,可在短期内提高繁殖速率,进行名贵品种的快速繁殖;利用茎尖培养可得到脱毒试管苗,解决品种的退化问题,提高产量和质量;将植物器官作诱变处理,用器官培养可得到突变株,进行细胞突变育种等。
第一节营养器官的培养一、茎尖的培养茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分,进行无菌培养。
这是组织培养中用得最多的一个取材部位。
茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。
微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥,其长度不超过0.5mm。
普通茎尖指较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽。
普通茎尖培养(1)取材: 挑选杂菌污染少,生长不久的茎尖。
(2)消毒接种: 将茎尖切成0.5-1.Ocm长将茎尖置于流水冲洗2-4h在75%的酒精中处理30s在稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min无菌水冲洗数次接种(3)接种: 为了减少污染,可在接种前再剥掉一些叶片,使茎尖为0.5cm左右大小。
(4)培养的方法和程序①培养基多数茎尖培养采用MS作为基本培养基,常用的其他培养基有White,Heller.培养基中生长素:2,4-D,IAA,NAA,浓度一般用0.1mg/L左右,高于此浓度,往往产生畸变芽或形成愈伤组织。
茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。
生长太慢:接种后茎尖不增大,只是茎尖逐渐变绿,出现绿色小点,细胞逐渐老化而进人休眠状态,或者逐渐变褐死亡。
引起的原因:生长素浓度太低,或是温度过低或过高;生长太快型是接种后茎尖迅速增大,在茎尖基部产生愈伤组织,并迅速增殖,而茎尖不伸长,久之茎尖也形成愈伤组织,从而丧失发育成苗的能力。
引起的原因:一是生长素浓度过高,引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。
植物的器官和组织培养
二、植物根段培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外 植体进行离体培养，再生完整植株的过程 。是研究根系生理代谢、器官分化及形态 建成的良好实验体系。培养方法与叶片培 养相似。
培养过程包括愈伤组织诱导、不定芽分 化、无菌苗的增殖与生根等。
大蒜根尖培养及植株再生
三、植物茎段培养
植物茎段培养是指对植物的带有定芽或 不定芽的外植体进行离体培养，再生完 整植株的过程。
利用灭菌剂对 外植体灭菌
无菌水冲洗 3-5次
1、茎尖、茎段、叶片的灭菌 2、根、块茎、鳞茎的灭菌 3、花蕾的灭菌 4、果实、种子的灭菌
二、初代培养物的建立
（一）无菌环境 （二）规范操作 （三）条件合适
三、形态发生和植株再生
外植体 愈伤组织
体胚途径
植株
具根茎的两极器官
器官化途径
先茎后根
单极器官
先根后茎
对培养的要求：成熟种子萌发培养所用培养基成 分简单，不需生长调节剂；未成熟种子萌发培养 则需要添加一定的营养成分和生长调节剂。若需 要其形成愈伤组织，需要相应的生长调节剂及营 养物质。
第四节 植物组织培养和脱毒苗的生产
一、植物分生组织(meristem culture)培养：
定义：是指对植物的分生组织进行离体培养 的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组 织和形成层组织的培养。其中茎尖培养广泛 应用于植物再生和脱病毒研究。
植物茎尖培养过程
➢茎尖离体培养可能出现的培养反应：
生长太慢 生长过旺，愈伤增多 生长正常
三、利用茎尖培养生产脱毒苗
脱毒苗生产的意义 茎尖脱毒机理 基本技术规程 影响脱毒效果的因素
1、脱毒苗生产的意义：
目前受病毒危害严重影响生产的有：
植物细胞培养
4.3 植物组织与器官培养
4.3.1 植物组织培养的定义： 在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
•
4.4.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象： 主要有：单细胞培养，单倍体培养（花药雄 性生殖细胞），原生质 根据培养系统： 主要有：固体培养和液体培养。
4.4.3 植物细胞培养的培养基
• 基础培养基有：
MS，B5，N6 。 主要有无机盐， 碳源， 有机氮源，有机酸等构成。 常用的培养基的组成：MS+植物生长激素+椰 子汁
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.4 植物细胞的培养：
• 4.4.1 植物细胞培养定义 • 定义：指在离体条件下，将愈伤组织或其它容易
分散的组织置于培养基中进行培养，得到分散成 游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从 而获得大量细胞群体的一门技术。目的是获得初 级和次级代谢产物。 可通过改变培养基成分及其浓度，生长调节剂的 选择等手段来实现代谢产物的诱导。
4.5.2 原生质体研究意义
研究组织和器官发育机制；
可以进行有关遗传操作；
研究植物细胞的生理功能；
诱导融合形成杂种细胞。
4.5.3 原生质体的制备 原材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化 原生质体活力检测
4.5.3.1 用于分离原生质体的材料来源
两个来源：
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
第四章离体培养的类型
第四章离体培养的类型第一节细胞的分化和器官分化一、植物细胞的全能性与细胞分化植物细胞全能性指植物体的每个体细胞或性细胞，在一定离体培养条件下都具有再生成完整植株的能力。
植物细胞的全能性不仅在理论上完全得到证实，而且也为植物组织培养在实践上的应用奠定了基础。
植物细胞脱分化是已分化的细胞在一定因素作用下，重新恢复分裂机能，并改变其原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。
不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。
细胞分化是指导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在发育方式改变的过程，是多细胞生物体形态发生的基础，是植物形态建成中的一个核心问题，是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型，没有细胞的分化就没有形态建成。
植物发育和细胞分裂、生长、分化有时间和空间上的必然联系。
植物的任何一个生活细胞都具有全能性，但每一个细胞在其整个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个细胞在不同的时间、空间和内外条件下表达的内容不同，因而就表现出机能和形态上的差异。
细胞脱分化的诱导需要许多外界因素的作用。
任何一个分化的细胞都具有保持分生组织状态的潜力，但在一般条件下处于受抑制的状态，通过外界因素的作用，消除抑制作用就可以使细胞恢复分裂。
在各种外界因素中，外源激素对脱分化起重要的作用。
有些植物的外植体只需加入生长素IAA、NAA或2，4-D就可以诱导细胞的分裂与生长，如菊苣；有的只需加入加细胞激动素类，如大豆、萝卜；另一类需加生长素和细胞激动素类，如烟草髓、胡萝卜、马铃薯；还有一类不需加任何激素就能诱导外植体细胞脱分化和再分化，如冠瘿组织，烟草肿瘤组织。
在离体和活体条件下，在植物细胞分化中主要强调维管组织的分化（xylem,phloem）, 尤其是木质部的分化。
在一个完整的植株内，组织的分化是以一个固定的方式进行的，然后形成特定的器官，然而愈伤组织培养物，缺少维管组织部分，为研究不同化学和物理因素对维管组织分化的作用提供了有价值的系统。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
高中生物精品资源第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件高中生物竞赛
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
组织或器官培养名词解释
组织或器官培养名词解释
组织培养是将动植物组织或细胞置于适宜的培养基中，利用培养基中特定的营养物质、生长因子和激素等，使其继续生长、繁殖和分化的过程。
在组织培养中，常用的培养器官包括叶片、茎、花、根等。
组织培养不仅可以制备大量的同一类型的植物，而且可以通过遗传工程技术进行基因操作，用于研究生物学和农业生产中的应用。
器官培养是指通过对动植物器官进行切片、分离、培养和培养基调配等过程，使器官继续生长、分化和繁殖的过程。
比如，对于动物器官的培养，可以将小鼠肝脏、心脏、脾脏等组织分离出来，再通过培养基进行培养，从而得到大量的器官细胞进行研究；对于植物的器官培养，可以通过切割茎叶、花、芽等进行培养，使其继续生长、发育或分化，用于研究植物的生长发育过程或进行植物育种。
器官培养具有重要的应用价值，可以推动科学发展和农业生产。
- 1 -。
细胞工程习题(答案)(1)
细胞培养技术习题（含答案）第一章动物细胞培养概述一、名词解释细胞培养：是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬浮液,然后放在类似于体内生存环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。
组织培养：从生物体内取出活的组织在体外进行培养的方法。
器官培养:将活体内的器官（一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基取出，在体外培养的方法.二、填空题1.体外培养(或组织培养）主要包括_细胞培养_,_组织培养_，和_器官培养_三种类型。
2._Harrison_的实验开创了动物组织和细胞培养的先河，他建立了_盖玻片悬滴_培养法3.在卡氏瓶原理的启发下，出现了用试管培养，继而又出现了多种类型的_培养瓶、_培养皿和_多孔培养板_的培养。
从20世纪40年代开始，大多数培养工作都过渡到用_瓶子_培养4.在动物细胞培养方法的发展过程中,具有历史意义的培养方法有盖玻片悬滴培养法，_旋转管培养的方法_，_灌注小室培养法_,和目前普遍应用的单层细胞培养法5.早期细胞培养采用_天然_培养基,现在广泛采用添加___血清_____的_人工合成培养基,近二十年来,动物细胞培养朝着无血清_培养基的方向发展。
三问答题1、动物细胞培养技术现已应用到那些领域？请举例说明。
动物细胞培养技术几乎已应用到生物、医学研究的各个领域。
这门技术自创立至今,已在多个学科领域乃至生产实践中均发挥了巨大的作用。
一、在生物学领域的基础研究中的应用离体培养的动物细胞具有培养条件可人为控制且便于观察检测的特点，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。
1．在细胞生物学上的应用2．在遗传学上的应用除了可用培养的动物细胞进行染色体分析外，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学，进行遗传分析和杂交育种.3．在胚胎学上的应用通过体外培养卵母细胞，并进行体外受精、技术而应用于家畜的繁殖生产中.4．在病毒学上的应用胚胎分割和移植己发展成了一种较成熟的在制备减毒活疫苗和诊断用抗原时，离不开细胞这一病毒增殖的场所。
植物组织培养：第4章 外植体的选择、灭菌及培养
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶液 通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直 径而被阻。
在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置； 液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤 膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射 器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出 的溶液就是无菌溶液。
由于在消毒后的环境里和物品上没有活着的微生物， 所以通过严格消毒灭菌的操作空间(接种室、超净台、 等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何 活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无 菌操作。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
3. 叶片：由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组 织培养以叶片为起始培养物，如，玫瑰、海棠、矮牵 牛和豆瓣绿等许多植物。
4.子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植物，则往往可 以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。 若有可能，最好对培养较困难的植物各部位的诱导及 分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体。
甲醛(福尔马林)
过氧化氢 高锰酸钾 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 酒精
（一）物理方法灭菌
1.湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）—培养基灭菌
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌 的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢， 压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。 在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐 热的芽孢。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
苜蓿浓度(mg/L)
200 200 65 82 18.6 740 4.5 4. 2.7 1.5 0.8 0.004 0.02 3 0.5 0.1 0.1 20000 5.5
西红柿浓度(mg/L)
143.9 100 40 10.6 368.5 3.35 2.25 1.34 0.75 0.38 0.002 0.01 4 0.75 0.1 0.1 15000 5.2
三、普通茎尖培养与繁殖技术 茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术 较为成熟，也叫微繁技术。 （一）茎尖微繁技术的一般方法 1、无菌培养体系的建立 外植体制备：正在生长的芽或腋芽、茎段、 鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带2-4 个叶原基或更多。 操作程序：类似一般无菌操作基本技术培 养基：MS、B5、White等，糖2-3%，生长调节剂。 培养条件：1000-3000Lx、16h、25℃。
胡 萝 卜 根 培 养
2、一般方法
100ml三角瓶，内装40-50ml培养液，如长时
间培养，可采用大型器皿500-1000ml培养液的发
酵瓶进行培养。根据需要可在瓶中添加新鲜培养
液继续培养或分割转移后继代培养。为避免培养
过程中培养基成分变化对生长的影响，可采用流
动培养方法。
2、根瘤菌结瘤实验的特殊方法
灰渣、锯木屑等。
⑶防止杂菌滋生：保持环境干净，农药灭菌。 ⑷注意光温管理：避免阳光直射、温度适宜。
（二）影响茎尖微繁因素 1、基因型 2、外植体大小 3、供试植株生理状态 4、芽在植株上部位 5、供试植株年龄 6、培养基 7、褐变 8、玻璃化 9、极性 10、后生变化 11、中间繁殖体的形态发生能力 12、遗传稳定性
二、叶培养方法 （一）叶原基培养：叶原基培养是研究形态建成 的重要手段。 1、采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。 2、在次氯酸5%溶液中浸泡20min，进行表面消毒。 3、切取柱状叶原基进行培养。 培养基采用Knop’s无机盐（部分修改）或 Kundson（1951）配方，添加Nitsch配方中的微 量元素（再加CoCL225mg/L）和2%蔗糖、8%琼脂， Ph5.5。部分实验中添加维生素、NAA、水解酪蛋 白等，温度24℃，人工光照24h。
⑶细胞分裂素与生长素的组合
细胞分裂素与生长素配合使用，诱导芽分 化效果好于单独使用细胞分裂素。 ⑷供试植株的发育时间和叶龄 个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分
化能力高，发育完全的叶片组织器官分化能力较
幼龄叶片组织再分化能力低得多。 ⑸叶脉 叶脉、叶柄分化能力较强。
⑹极性
叶背面朝上放置就不生长。
第二节
一、概念和意义
茎尖培养
1、茎尖培养概念
茎尖分生组织培养：指对不超过0.1mm的茎 尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获无 病毒苗，操作困难，成苗时间长。 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎
尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、
成苗时间短、繁殖速度快。
2、茎尖培养意义
茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快
第四章
器官培养
宜职院08.9
目的与要求 了解离体根培养的实践意义，掌握离体根的培 养方法，熟悉离体根培养的培养基配方。了解植物 茎尖培养的意义，掌握茎尖培养的方法，以及茎尖 微繁技术。掌握叶培养概念，离体叶组织培养方法， 了解影响叶片组织脱分化和再分化因素。 具有植物离体根培养的认知和进行根培养的基 础能力，具有熟练进行植物茎尖培养和茎段培养的 能力，具有叶培养认知和进行叶培养的基础能力。
（二）叶片组织的脱分化与再分化培养
1、叶组织培养的一般方法
⑴叶组织分离与消毒
大多数植物的叶原基、幼嫩叶片，双子叶 植物的子叶，单子叶植物心叶的叶尖组织， 都可用于叶组织的脱分化与再分化培养。
方法一：
幼嫩叶片培养时：选取植株顶端未充分展
开的幼嫩叶片——流水冲洗——蘸有少量75%酒精
的纱布擦拭叶片两面——放入0.1%升汞溶液中消 毒5-8min——无菌水冲洗3-4次——消毒后叶片转 入到铺有滤纸的无菌培养皿内——解剖刀切成 0.5cm×0.5cm左右的小块或薄片（如叶柄和子
茎段
茎尖取 材有限，可 采用带节或 不带牙的茎 段进行培养。
第三节
叶的培养
一、离体叶培养概念及意义 1、离体叶培养概念 指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶 等叶组织的无菌培养。多经脱分化形成愈伤组 织，再由后者分化出茎和根。
2、离体叶培养意义 ⑴研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理 论问题的良好方法。 ⑵通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实 叶细胞的全能性。 ⑶通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组 织、细胞培养的条件和影响因素。 ⑷利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞 快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系 数。 ⑸叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自 然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育 种实践。
Raggio 装置
三、离体根培养所用的培养基
离体根培养多用无机离子浓度低的
White培养基或其他培养基，MS、B5等也可采
用，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。
苜蓿离体根的培养液和西红柿离体根的
培养液如下：
成份
Ca(NO3)2.4H2O Na2SO4 KCl KNO3 NaH2PO4.2H2O MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O FeC6H5O7.3H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI CuSO4.5H2O MoO3 甘氨酸 烟酸 维生素B1 维生素B6 蔗糖 Ph
叶 片 愈 伤 组 织 诱 导 形 成
⑵培养基 常用MS、B5、White、N6等培养基，3%糖， 培养基中添加椰子汁等有机添加物，有利于 叶片组织培养中的形态发生。 大多数双子叶植物的叶组织培养，细胞分 裂素特别是KT、6-BA有利于芽的形成，生长 素特别是NAA有利于根的发生，2,4-D有利于 遇伤组织的形成。一般BA 1-3mg/l，NAA 0.25-1mg/l。
速繁殖无性系、培养无病毒苗、品种改良。
二、茎尖培养一般方法 （一）材料的制备
健壮枝梢-去除叶片-分成1-2cm-自来水冲洗消
毒-75%的酒精30秒-0.1%升汞或20倍次氯酸钠消毒 8-10min-无菌水-修剪剥离茎尖，通常切割下顶端 0.1-0.1叶原基的茎尖-（无菌水）-接种。 （二）培养基
多为MS培养基及其改良配方，还有White配方、
2、芽的增殖 ⑴顶芽和腋芽的发育；利用顶端优势 ⑵诱导不定芽产生；外植体直接产生不定芽
外植体脱分化-愈伤组织-不定芽
⑶原球茎的发育； 原球茎—种子发芽时，胚根部不出现，胚 逐渐增大，种皮一端破裂，膨大的胚呈圆锥状， 称为原球茎。即缩短的、珠粒状的、胚性细胞组
成、类似于球茎的器官。
芽和种子发育—原球茎—植株
Raggio1965年等设计了离体根的结瘤实验装
置。 此装置由两个部分组成，下部是试管，管中 装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌，上部是 玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛
放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营
养从根基部吸收，无机营养从根尖吸收。
Bunting和 Horrocks1964年修改 了Raggio等的装置， 变为在粗沙中提供无 机盐。利用这一技术 研究菜豆、大豆等离 体根根瘤菌的固氮情 况，结果表明这些根 瘤菌含有血红蛋白， 并能固定大气中的氮。
B5配方、Heller配方、Gautheret配方等。
（三）培养方法 1、固体培养法 特点：琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。 优点：操作较为简单，普遍。 缺点：对有些植物培养较难。 操作：培养基分装——灭菌——冷却——茎尖 接种——25+3℃培养。 2、纸桥培养法 滤纸取代琼脂，液体培养基。 优点：营养物质能均衡持久地供给外植体，利 于外植体健康生长。 缺点：操作复杂。
⑶培养 25-28℃，光照12-14h，光照度1500-2000Lx， 不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。 2、影响叶肉组织培养的因素 ⑴基因型 不同植物种类、同一物种的不同品种间在 叶组织培养特性上有一定的差异。 ⑵细胞分裂素与生长素的组合 两种细胞分裂素都能促进芽的分化，6-BA 的作用好于KT，但6-BA对不定芽的进一步发育 （茎叶的形成）有抑制作用。
四、影响离体根生长的因素 1、基因型 不同植物的根对培养的反应不同，番 茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生长并继代培养无 限生长。萝卜、豌豆需长时间且有限。木本植物很 难生长。 2、营养条件 硝酸盐是最好氮源，蔗糖是最好碳 源，铁、锰、硼、硫、维生素不能缺少。 3、激素 生长素对不同植物反应不同 4、pH 5、光照和温度 25-27℃
3、中间繁殖体的增殖
第二阶段产生的芽、苗和原球茎，统称为中间繁 殖体。 茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，BA、 KT、2iP促进发芽，IBA、NAA、2，4-D促生根。
4、壮苗和生根
胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培 养基培养。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根， 故生根培养基中无机盐低。
4、说明叶组织培养的一般方法
5、简述叶片培养中叶片消毒的一般程序
探讨
试比较根、茎、叶作外植体进行离 体培养的特点
叶）——上表皮朝上接在固体培养基上培养。
方法二： 70%酒精漂洗约10秒，饱和漂白粉液中浸315分钟，无菌水冲洗数次，放在无菌的干滤纸 上吸干水分以供接种用。对一些粗糙或带绒毛
的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶
片。 同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。培 养叶肉时因海绵组织在分裂前就死亡，如果栅 栏组织不发达就难培养。
⑺损伤
损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。
3、离体叶组织的茎和芽发生途径
⑴直接产生不定芽
⑵由愈伤组织产生不定芽
⑶胚状体形成
⑷其他途径
叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导 愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较 高。再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体 再生的难度相当大。