重组基因的导入和鉴定

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该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬 间转移效率最高可达到20％，但长期表 达效率较低，目前已被广泛运用于离体 细胞的基因转移，是最普遍使用的方法 之一。
液、心肌毒柬或麻醉剂(如利多卡因)的 预处理。
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(2)基因枪介导的皮内或皮下导入

来自百度文库

首先利用微小的金、钨等金属颗粒相DNA吸附， 然后在高压作用下将DNA伴随金颗粒高速进入 细胞，由于微粒的直径一般在0.5-0.9 Fm之间， 远小于细胞． 因此可直接将DNA导入细胞质中，这种方法能 有效地使DNA在活体组织、贴壁细胞和悬浮细 胞中表达。由于该方法的高转染效率，通常只 得少量DNA即可获得外源基因的表达并激发有 效免疫应答。
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(2)基因枪介导的皮内或皮下导入
80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要 是为了克服以往各种基因转化技术的局限。
该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒 加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。
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(2)基因枪介导的皮内或皮下导入
操作技术程序为：
首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶 液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后 将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属 微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在 钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。
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提高转化效率措施


实验表明，横纹肌细胞(如心肌、骨傍肌) 和胸腺滤泡细胞摄取DNA的能力较强，但实 际上质粒DNA注射入肌组织后，最多只有1％2％的肌纤维被转染，DNA的转染效率不仅与 质粒DNA的大小、构型有关，还与肌细胞的状 态有十分密切的关系。 人们为提高肌细胞摄取DNA的能力采取了一些 措施，如在质粒接种前先给予高渗蔗糖溶
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基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果； 但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比 金粉大。 （2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、 乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。
（3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微 弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压 蒸汽作为动力。 基因枪法的特点：（1）转化效率高。
（2）受体广泛。
（3）操作简单。
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(3)电穿孔(electroperation)

该方法利用脉冲电场提 高细胞膜的通透性，使 细胞膜上形成纳米大小 的微孔，可将DNA转移到 细胞中。该方法简便， 且有较稳定的转染效率， 可广泛运用于培养细胞 的基因转移.
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原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为 一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当 把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端 电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄， 当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。
构建重组体DNA是分子生物学常用 技术。它把经过处理的、具有匹配末 端的外源片段和载体进行连接,转化感 受态细菌后,经生长、筛选或鉴定,获 得含目的DNA 的转化菌。本章讨论外 源重组基因转入受体细胞的方法，及 其重组子的鉴定。
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第一节

基因转移的方法
在确定染色体DNA是遗传的主要载体后 的一段较长时间内，人们一直认为虽然 生物种类繁多，表型各异，但决定每种 生物基因组的DNA是固定的，包括数目 固定、位置固定、功能固定的一系列基 因。他们的流动性受到十分严格的限制。
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固定细胞技术
显微注射技术的关键是原生质体或具壁 细胞或细胞团的固定。 首先必须建立固定细胞技术，然后才能 进行定位显微注射操作。 常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖包埋法 二、多聚赖氨酸粘连法 三、吸管支持法

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二、基因转移的化学方法
磷酸钙共沉淀法

化学方法
DEAE—葡聚糖转染法 脂质体转染法
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随着遗传学研究的深入，人们逐渐发现 细菌的结合、转导、转化、转座等现象， 在这些事件中存在明显的遗传物质转移， 而这种转移与生物繁殖过程中的遗传物 质的转移有显著区别。这些现象后来成 为基因工程的基因转移技术。可以用于 细菌、真菌和动、植物的基因工程体构 建。
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一、基因转移的物理方法
裸DNA直接注射 微粒轰击 电穿孔 显微注射

物理方法



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(1)裸DNA直接注射


1990年Wolff等首次注意到给小鼠直接肌肉注 射纯化的DNA或RNA重组表达载体，可使载体 上的基因在局部肌细胞内表达，这种表达可 持续数日或更长时间，且没有检出注射的外 源核酸与宿主染色体整合。 随后的大量动物实验都说明在合适的条件下， DNA接种后可诱导机体产生细胞及体液免疫。 于是，作为一种新的基因治疗手段——核酸 免疫技术应运而生。
可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。 不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。
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操作程序：
将盛有细胞和DNA混合物的特制小 容器置于电脉冲仪的正负极之间， 在0度下加高压（2～ 4KV），电脉 冲10分钟后，将待处理的细胞转移 到新鲜培养基中生长2天，再进行 筛选。存活细胞的回收率约为 60%～ 80%。
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(1)磷酸钙共沉淀法


当CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合 时，即有磷酸钙微细沉淀形成，这些 细小颗粒可以吸附在细胞表面，通过细 胞膜的内吞作用将DNA吸收进入细胞质 面后进入细胞核，其详细机制尚不明确。 DNA多以多拷贝首尾相连的串珠状排列 进入细胞，在细胞中常以多拷贝形式存 在。
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(4)显微注射


指在显微镜下，将DNA 由细胞玻璃针直接注入 细胞。可以将DNA直接 注入核内而减少溶酶体 对外源DNA的降解，有 助于基因的整合与表达。 适用于多种贴壁生长细 胞及悬浮生长细胞，包 括原代及传代细胞、胚 胎细胞等。
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(4)显微注射
微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔， DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。 真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外 源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。