2010年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍(张德波)

附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
2005年版药典 • • • • 供试用家兔 • 体重 1.7～3.0kg,雌者应无孕。 • 饲养：预测前7日的规定。 • 淘汰： 饲养不正常者 • 供试品判为不合格者 使用超过10次者 • 2010年版药典 供试用家兔 体重 1.7kg以上,雌者应无孕。 饲养：预测前7日的规定。 淘汰：饲养不正常者 供试品判为不合格者 不同点：体重无上限 • 使用次数不再规定10次 • 建议： 建议：
[用法与用量]静脉滴注：一日20～40ml，以10%葡萄糖注射液200ml
建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。 供试液浓度确定：溶血、刺激性。 给药体积确定： 标准文字表述：
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
过敏反应标准起草 • 豚鼠毒性试验 • 剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大， 同时考虑临床用量。
致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验 方法规定次数与时间来操作。
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -实验动物的要求 应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。 动物应品系、年龄明确。 动物性别、体重应符合试验需要。 应有严格检疫制度。 使用前应正常饲养至适应使用环境。 应有动物处理制度。
• • • • • •
成方制剂和单味制剂
• 止喘灵注射液 异常毒性 • 注射用双黄连（冻干） 溶血与凝聚、热原 • 清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚 • 注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常 毒性、溶血与凝聚
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔预选 • 未曾使用过的家兔。 • 供试品合格，但升温≥ 0.6℃，休息达2周以上。 • 3周内未曾使用的家兔。 • • •
预选条件应与正式实验一致。 休温应在38.0 ～ 39.6℃。 每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4℃
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
• 保证实验可靠的几点建议： 保证实验可靠的几点建议： 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题 对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。 对该试验的几点思考
附录Ⅹ 附录ⅩⅢH 溶血与凝聚检查法
• 2%兔红细胞混悬液配制 • 操作法
试管编号 2%兔红细胞混悬液ml 0.9%氯化钠溶液ml 蒸馏水ml 供试品溶液ml 0.3 0.3 0.3 1样品 样品 2.5 2.2 2样品 样品 2.5 2.2 4.7 3颜色 颜色 4阴性 阴性 2.5 2.5 2.5 5阳性 阳性 2.5
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素的常规检查 例1：取本品，用细菌内毒素检查用水至少稀释20倍后，依法检查，本品 每1ml中含有的内毒素应小于1. 25EU。
L=1.25EU/ml MVD=CL/λ---20=1×1.25EU/ml/λ λ=0.625EU/ml
供试品液配制： 样品液—— 稀释 倍 —— 稀释20倍。 稀释10倍 内毒素工作标准品配制 120EU/支 ，150601-200963。
• • • • • • • • • • 初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.4℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或均不超 过0.6 ℃，但总和≥1.4℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只。 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃ • • • • • • • • • •
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ⅩⅢ A 热原检查法 ⅩⅢ D细菌内毒素检查法 ⅩⅢ E异常毒性检查法* ⅩⅢ G过敏试验检查法* ⅩⅢ H 溶血与凝聚试验*
• 附录ⅩⅧ B 中药注射剂安全性检查法指导原则 附录ⅩⅧ • 附录ⅩⅧ C 中药生物活性测定指导原则 附录ⅩⅧ
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -2005年版一部 • 动物品系、年龄、性别应 符合规定。 • 尽量取代动物试验，减少 动物使用量。 2010年版一部 • 动物应健康。 • 动物品系、年龄、性别、 体重应符合规定。
• 计算体温变化 计算体温变化（升温为负值时以0计，注意数值修约）
• 数值修约：四舍六入五成双 12.1498≈12.1; 12.150001 ≈12.2; 12.15 ≈12.2; 12.16 ≈12.2 12.45 ≈12.4
• 得出结论
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
结果判断（2005版） ）
• 温育: 37±0.5 ℃, 3小时。 • 结果判断 • 几个问题 • 试验剂量问题， 试验剂量问题，结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素（Endotoxin） 细菌内毒素（ ） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。 • 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 • 特点 广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 • 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 • 企业工作品
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
降压物质检查标准起草 • 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 • 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。
无降压作用的药品： 临床单次用量的1/5~5倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~ 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔的重复使用 • 供试品合格的家兔 至少休息48小时。 • 升温≥ 0.6 ℃的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。 • 供试品不合格的家兔淘汰 • 建议：关于升温的家兔 建议：
关于降温的家兔
附录Ⅹ 附录ⅩⅢE 异常毒性检查法
异常毒性检查 • 初试动物要求：17~20g，5只。 • 复试动物要求：18~19g，10只。 • 给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间， 否则按每只4～5秒。 4 5 • 结果观察：给药后观察48小时。 • 结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
热原标准起草 • 剂量设定：临床成人1小时内最大用量的3～5倍。
考虑几点: 毒性、干扰、药物本身具有解热性问题。
• 供试液浓度确定：考虑两点: 溶血、刺激性。 • 注射体积确定： • 标准文字表述： • • • • 异常毒性标准起草 剂量设定：应低于最低致死量，1/3LD1或者1/4LD50。 建议：最好低于明显出现药物本身毒性的剂量。 根据临床用药量来确定。 标准文字表述：
2005年版药典 试验环境条件 • 实验室与饲养室温差不得 大于5 ℃，且在17 ～25℃ 之间。 • 实验过程中温度变化≤3℃ 2010年版药典 试验环境条件 • 实验室与饲养室温差不得 大于3 ℃，且在17 ～25℃ 之间。 • 实验过程中温度变化≤3℃
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法 实验操作过程
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 规格: 规格 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（λ） 灵敏度 对鲎试剂灵敏度的正确理解。 • 鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断
2010年版药典一部 2010Baidu Nhomakorabea版药典一部
生物安全性检查和生物活性测定法介绍
张德波
成都市食品药品检测心(成都市药检所 成都市食品药品检测心(成都市药检所)
2010年版药典一部安全性检查内容介绍 2010年版药典一部安全性检查内容介绍
• 凡例 动物试验(四十五) • 成方制剂和单味制剂 四个品种 • 附录ⅩⅢ 附录Ⅹ
结果判断（2010版）
初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.3℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或总和 ≥1.3℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃
• 试验前准备工作 试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品 • 正式实验
家兔正常体温测定:体温38.0 ～ 39.6℃,且两次相差≤0.2℃。 供试品液准备:注射前配制，温热至约38 ℃。 分组：三只家兔温度最好相近，组内温差不得过1 ℃ 注射给药：15分钟内注射完毕，注意止血。 测定给药后的体温
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 灵敏度复核结果 • 实验成立与否的判断
内毒素浓度（ 内毒素浓度（EU/ml) 反 1 应 2 管 3 号 4 2λ λ + + + + λ + + + + 1/2λ λ 1/4λ -
• 结果计算方法:λc=anitlg(∑X/4) • X为反应终点的对数（lg)值。 • 不需要计算的几种情况
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
溶血与凝聚标准起草 • 实验方法问题：取样量、供试液。 • 结果判断问题：振摇引起的争议。 • 个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。 • • • • 供试液配制 试验剂量 结果观察 结果判断
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
细菌内毒素检查标准起草
举例：某中药注射液
120EU（1支）—— 1.0ml（ 120EU/ml) 120EU/ml—— —— —— 0.25EU/ml（4λ）—— 0.125EU/ml（2λ）
供试品阳性对照液 内毒素液
0.5ml
0.25EU/ml ——————————————0.125EU/ml（2λ，20倍稀释液） 上样品10倍稀释液 0.5ml
附录Ⅹ 附录ⅩⅢF 降压物质检查法
降压物质检查法
对照品贮备液的配制： ①磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。 ②规定配制成1.0mg/ml，但最好采用定容方法。 ③4～8 ℃保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求， 验证方法：猫注射0.1μg/kg，血压下降均值应不小于2.67kpa。 对照品稀释液的配制： 配制浓度应根据供试品给药剂量（体积）来确定。 实验前的准备工作：对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻 醉剂、供试品 猫的麻醉及手术注意事项 猫灵敏度测定： 0.05μg/kg、 0.1μg/kg、 0.15μg/kg 供试品降压物质检查：ds dT dT ds 异常情况的处理: 异常情况的处理:动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
• 热原 热原（Pyrogen ） ：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。 • 来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及 来源： 其他一些微生物、类固醇等。 • 存在 存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。 • 性质 性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致 热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶 性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。 • 不良反应 不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。
附录ⅩⅢG过敏试验检查法 附录ⅩⅢG过敏试验检查法 过敏物质检查法
• • • • • 动物要求: 动物要求 250 ～350g，雌者应无孕，6只。 致敏： 致敏：腹腔注射给药0.5ml/只，间日一次，连续3次。 激发： 激发：首次致敏注射后的第14日和第21日，静脉注射1ml/只。 结果观察： 结果观察：激发后观察30分钟。建议观察60分钟。 结果判断： 结果判断：如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫 癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳 或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。
• 例2：某样品规格1g 细菌内毒素 取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU • 介绍一种简便的操作方法
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质 （非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。
肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。