形态实验学PPT：人类X小体的检测-形态学自设计实验

人类X小体的检测
——形态学自设计实验
一、实验目的
掌握人类X小体玻片标片的制作方法。 观察识别X小体形态特征及所在部位。
二、实验原理
发现：
1949年，加拿大学者Barr在研究猫的神经元 细胞时，发现雌猫神经元细胞核边缘有一个 染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种 结构。进一步研究发现，所有雌性哺乳动物 细胞中都有这种小体，能显示性别差异。 在人类，男性细胞中很少或没有这种小体， 而女性有一个。
3.固定：
（ 1 ） 加 入 固 定 液 1ml ， 混 匀 ， 室 温 预 固 定 2min ， 1200r/min离心8min，弃上清。
（2）加入固定液5ml，吹打混匀，室温固定15min， 1200r/mi。
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，使蛋白凝固，终止细胞代谢过 程，并保持细胞核染色体结构的完整性，并且能够增强染色体的嗜碱 性，达到优良的染色效果。
剂量补偿（dosage compensation effect）
女性有两条X染色体，但所表达的绝大部分遗传物质与只 有1个X染色体的男性是一样多的。这种男女X连锁基因产 物相等的现象在遗传学上称为剂量补偿。
对这一现象的解释是女性的X染色体中只有1个保持活性， 而另一个是晚复制的，没有活性。结果无论男女都只有一 条有功能的X染色体。
该失活的染色体在形态学上呈异固缩状态（细胞分裂周期 中与大部分染色质不同步的螺旋化现象），DNA螺旋压 的很紧，故染色深而致密。
应用：
1. 鉴定个体的性别
取材：口腔上皮细胞、毛囊细胞、羊水细胞
用途：优生学中进行胎儿性别检查，预防性染色体遗传性 疾病的发生。奥运会运动员性别鉴定。
2. 诊断性染色体异常综合征
弃上清时，用吸管吸取上清，弃去，接近下方沉淀时，应 小心吸取。
载玻片于临用前在-20度冰箱中取出，现用现取，以防温 度上升。
加热时应距离外焰一段距离，且来回摆动，以防过热引起 断裂。
离心前要配平，对称放置。
准确控制各步骤时间。
（四）实验结果
低倍镜：选择轮廓清楚，不重叠，染色清晰， 核膜完整，核质中颗粒均匀的细胞，观察到细 胞核后转到高倍镜下观察。
有三个X染色体者X小体的数目为2。
莱昂假说（Lyon hypothesis ）
正常雌性哺乳动物体细胞中的两个X染色体之一在 遗传性状表达上是失活的。
X染色体的失活是随机但恒定的。失活的X染色体 可来源于雌性亲本，也可来源于雄性亲本。
失活现象发生在胚胎发育的早期，一旦出现则从 这一细胞分裂增殖而成的体细胞克隆中失活的都 是同一来源的染色体。
高倍镜：观察X小体，大小约为1m，扁平状、 椭圆形或三角形，浓染，紧贴于细胞核核膜边 缘。
X小体的形状
实验报告
原理 材料与方法 结果： （1）画图：画1个典型细胞，示X小体的形态和
所处部位。 （2）阳性率：观察30个可数细胞中X小体出现
的个数， 计算X小体的阳性率。 讨论
X小体的阳性率
➢ 特纳氏（Turner‘s）综合征，先天性卵巢发育不全综合征， 患者为女性但却无巴氏小体，核型是45，XO 。
➢ 克氏（Klinefelter′s）综合征，先天性睾丸发育不全综合征， 患者为男性但有一个巴氏小体，核型是47，XXY 。
➢ 超雌：有2个以上巴氏小体，如XXX, XXXY 等。
特纳氏 （Turner‘s） 综合征
4.滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高垂直向下滴在 一张预冷的载玻片上（2-3滴），标记，空气风干 或烘干。
从高处向下滴片目的是让液体分散开，形成细胞单层，使染色体分散， 便于观察，使用冰片可降低液体的表面张力。
5.水解：玻片放入盐酸缸中，水解10min，取出后 用自来水细水漂洗数秒钟，洗去多余HCl，空气 风干或烘干。
水解可除去细胞间的果胶质，使细胞壁软化或部分分解，从而使细胞 和染色体易于分散，同时可去除杂质。
6.染色：玻片放入甲苯胺兰染液缸中，染色3min 后取出，自来水细水漂洗数秒钟，空气风干或烘 干。
7. 镜检：低倍镜→高倍镜。
（三）注意事项
取材前需用水漱口数次，尽可能除去细菌和食物残渣；用 洁净的牙签钝端从口腔两侧颊部刮取粘膜，为防止后面的 离心损耗，应尽量多取一些。
正常女性口腔粘膜上皮细胞中X小体阳性率约 10%～30%；
男性偶尔可见，阳性率＜2%，且形态不典型。
思考
为什么女性中不是所有的细胞都可观察到X 小体？
为什么男性会有2%左右的巴氏小体阳性率？
为什么X小体一般出现在核膜边缘？
思考
为什么女性中不是所有的细胞都可观察到X 小体？
（二）实验方法
1.取材：吸取5ml生理盐水于离心管中，漱口后用 牙签刮取女性口腔粘膜上皮细胞4-5次，置入离心 管的生理盐水中洗脱下来，轻轻摇匀，1200r/min 离心8min，弃上清。
2.低渗：加入5ml预热的低渗液，轻轻混匀，37℃ 低渗10min。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使粘附于 染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
超雌
克氏 （Klinefelter′s） 综合征
三、实验操作：人类X小体的检测
（一）材料
取材：女性口腔粘膜上皮细胞 试剂：生理盐水：0.85% NaCl
低渗液：0.075M KCl 固定液： Carnoy （甲醇∶冰乙酸＝3∶l，现配） 水解液：5M HCl 染液：0.2%甲苯胺兰
耗材：牙签、离心管、载玻片、吸水纸 仪器：恒温水浴箱，离心机，光学显微镜
本质：
巴氏小体就是染色体异固缩（细胞分裂周期中与 常染色体不同步的螺旋化现象）。
哺乳动物体细胞核中，除一条X染色体外，其 余的X染色体发生异固缩，处于失活状态，将 其称为X小体（X染色质，性染色质，巴氏小 体 Barr body），通常位于间期细胞核的核膜 边缘，染色深而致密。
数目：
X小体的数目= X染色体数目－1 正常女性细胞：2条X染色体，X小体的数目为1。 正常男性细胞：1条X染色体，X小体的数目为0 。