外泌体提取
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取鉴定
外泌体提取鉴定1. 介绍外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞分泌的小型膜囊泡，具有重要的生物学功能。
它们主要通过胞吐（exocytosis）的方式释放到细胞外，可以携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
外泌体的提取鉴定是一项关键的研究技术，可以帮助我们了解外泌体的组成、功能以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。
2. 外泌体提取方法外泌体的提取方法有多种，常用的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排除柱法等。
2.1 超速离心法超速离心法是最常用的外泌体提取方法之一。
该方法通过多次离心步骤，逐渐提高离心速度，使外泌体沉淀。
离心步骤通常包括低速离心、高速离心和超高速离心。
低速离心一般在300g-2000g的离心力下进行，用于去除细胞碎片和大颗粒物质。
高速离心一般在10000g-20000g的离心力下进行，用于沉淀较大的外泌体。
超高速离心一般在100000g以上的离心力下进行，用于沉淀较小的外泌体。
2.2 密度梯度离心法密度梯度离心法利用外泌体与离心液中不同密度的物质在离心过程中的分层原理，实现外泌体的提取。
常用的密度梯度离心液包括葡萄糖、蔗糖和乳酸等。
离心过程中，外泌体会在离心液中沉淀到特定的密度层，然后可以通过离心收集到外泌体。
2.3 尺寸排除柱法尺寸排除柱法是一种基于外泌体粒径的提取方法。
该方法利用尺寸排除柱的特殊结构，可以将大颗粒物质和细胞碎片滞留在柱中，而将外泌体通过柱床，实现外泌体的提取。
尺寸排除柱法操作简便，提取效果较好，适用于小样本量的外泌体提取。
3. 外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括电子显微镜观察、蛋白质分析、核酸分析和功能鉴定等。
3.1 电子显微镜观察电子显微镜是观察外泌体形态和结构的重要工具。
通过电子显微镜观察，可以看到外泌体的膜结构、大小和形状等特征。
电子显微镜观察可以直观地确认提取到的颗粒是否为外泌体。
3.2 蛋白质分析蛋白质分析是外泌体鉴定的重要手段之一。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。
外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。
一、超速离心法。
超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。
最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。
二、超滤法。
超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。
最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。
三、沉淀法。
沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。
最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。
四、免疫磁珠法。
免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。
最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。
以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。
希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。
一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
(完整版)外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
外泌体提取步骤
外泌体提取步骤外泌体提取是一种从细胞外分泌物中分离和纯化外泌体的方法，它可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品，并对其进行进一步的分析和研究。
本文将介绍外泌体提取的步骤。
1. 细胞培养需要选择感兴趣的细胞系进行培养。
将细胞种植在培养皿中，并提供适当的培养基和条件，使细胞能够正常生长和分裂。
2. 收集细胞上清液当细胞生长到一定程度时，收集细胞上清液。
将培养皿中的培养基转移至离心管中，并使用低速离心（约300-500×g）离心10-20分钟，以去除细胞和细胞碎片。
3. 高速离心将离心后的上清液转移到新的离心管中，并使用高速离心（约10,000-20,000×g）离心30-60分钟，以沉淀外泌体。
4. 洗涤外泌体将外泌体沉淀用冷PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，以去除杂质和未结合的蛋白质。
洗涤过程中可以进行多次离心和上清液的去除。
5. 再次离心将洗涤后的外泌体沉淀用PBS再次离心，以获得更纯净的外泌体样品。
6. 纯化外泌体为了进一步提高外泌体的纯度，可以使用浓缩、超滤等方法对外泌体进行纯化处理。
这些方法可以去除残余的蛋白质和其他杂质，提高外泌体的纯度和浓度。
7. 确认外泌体使用电子显微镜观察外泌体的形态和结构，确认提取到的颗粒为外泌体。
此外，还可以使用Western blot、质谱等技术对外泌体进行进一步的鉴定和验证。
8. 外泌体的应用提取到的外泌体可以用于进一步的研究和应用。
外泌体中包含了丰富的蛋白质、核酸、脂质等生物分子，可以用于疾病诊断、药物传递、基因治疗等领域。
总结：外泌体提取是一种重要的实验操作，可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品。
通过细胞培养、离心、洗涤和纯化等步骤，可以从细胞上清液中分离和纯化外泌体。
外泌体提取的纯度和质量对于后续的研究和应用至关重要。
外泌体的提取和研究有望在生物医学研究中发挥重要作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体（extracellular vesicle，EVs）是一类广泛存在于体液中的细胞外小囊泡，它们由细胞释放并包裹着细胞膜，可携带细胞成分如蛋白质、核酸、脂质等，具有重要的生物学功能。
因此，外泌体提取方法的研究和比较对于深入了解和应用外泌体具有重要意义。
目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、凝胶过滤法、免疫亲和法、磁珠法和化学法等，下面将对这些常用的方法进行比较。
超速离心法是提取外泌体最常用的方法之一，其主要步骤包括差速离心和超速离心。
由于外泌体的大小范围相对较小（30-150 nm），因此要通过不同的转速和不同的时间对样品进行逐步的离心，以获得纯化的外泌体。
超速离心法的优点是提取到的外泌体数量较多，但存在一定的缺点，如操作复杂、时间长、成本高以及无法彻底除去离心的其他细胞碎片。
凝胶过滤法是利用凝胶纤维通过外泌体的大小选择性提取外泌体。
它的优点是简单易行，不需要专门的设备和耗材，但提取到的外泌体数量较少，可能存在一定的纯度问题。
免疫亲和法是通过特异性抗体与特定外泌体表面标志物的结合，利用磁珠等载体进行外泌体的提取。
免疫亲和法的优点是操作简单、提取到的外泌体纯度较高，但需要进行专门的抗体标记和染色，成本较高。
磁珠法是利用具有亲和性的磁性材料提取外泌体。
这种方法具有操作简单、纯度较高的优点，但对于部分磁性材料的购买和使用有一定的限制。
化学法主要是利用有机溶剂和离子液体等化学方法来提取外泌体。
这种方法相对较新，属于非常规的提取方法之一、虽然其操作简便，但由于存在一定的化学毒性和对溶剂残留的担忧，目前该方法的应用还相对较少。
总的来说，不同的外泌体提取方法各有优缺点，具体选择哪一种方法需要根据实际需求进行评估。
超速离心法、凝胶过滤法和免疫亲和法是目前应用较广泛的方法，它们在纯度、操作简便和提取效率等方面各有优劣。
未来的研究可以探索新的、更高效的提取方法，以满足外泌体研究的不断需求。
血清外泌体提取方法(一)
血清外泌体提取方法(一)血清外泌体提取方法1. 超速离心法•使用超速离心机将血清样本离心，离心速度一般在10,000 g以上。
•离心后，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的干扰。
2. 滤膜法•将血清样本通过0.22微米的滤膜过滤器进行过滤，以去除大部分细胞和碎片。
•过滤后的上清液就是富含外泌体的样本，可以用于进一步提取和研究。
3. 差速离心法•使用差速离心机，先进行低速离心，去除大部分细胞和碎片。
•然后将上清液转移到新的离心管中，进行高速离心，富集外泌体。
•最后将上清液转移至新的离心管中，以去除杂质，得到纯净的外泌体样本。
4. 密度梯度离心法•制备不同密度梯度的离心液，将血清样本与离心液混合。
•使用超速离心机进行离心，外泌体会在不同密度梯度的离心液层中分布。
•取出目标密度层中的外泌体，进行后续研究。
5. 抗体亲和法•利用特定的抗体对外泌体表面的蛋白进行识别和结合。
•通过结合特定的抗体，可以将外泌体与其他细胞碎片和蛋白质区分开来。
•进一步使用离心等方法，将外泌体富集提取。
6. 生物素链霉亲和法•将生物素链霉素与其他蛋白结合，并加入血清样本中。
•生物素链霉素会特异性地结合外泌体表面上的生物素结合受体。
•利用生物素链霉素的亲和性，将外泌体富集提取出来。
7. 电泳法•使用凝胶电泳将血清样本进行分离。
•外泌体会在凝胶中迁移，形成独特的带状图案。
•通过裁剪目标带进行提取和研究。
以上是一些常用的血清外泌体提取方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择方法时，需要根据实验目的和具体情况进行综合考虑。
8. 静电荧光法•利用外泌体表面的电荷性质，通过静电作用将外泌体富集提取。
•常用的静电荧光染料有山萸苷、草酸黄等，可与外泌体表面的负电荷相互吸引。
•通过荧光信号的增强，可以富集和检测外泌体。
9. 残余血小板法•血浆中存在大量的残余血小板，这些血小板上富集有很多外泌体。
•使用低速离心法去除大部分细胞和碎片后，对残余血小板进行高速离心，获取外泌体样本。
血清外泌体提取方法
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
（完整版）外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×ｇ离心10 min，吸取上清液，然后 2 000×ｇ离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×ｇ超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在 1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×ｇ离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×ｇ离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×ｇ保持30分钟，然后以200,000×ｇ进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μｍ注射器过滤器过滤，并以200,000×ｇ离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°Ｃ下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表 3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。
本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。
外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。
外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。
化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。
首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。
该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。
但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。
生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。
将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。
该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。
但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。
基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。
将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。
该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。
但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。
蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。
通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。
通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。
随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。
通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。
通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。
转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。
外泌体提取和鉴定
外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。
外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。
超速离心法是外泌体提取的经典方法。
其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。
这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。
但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。
超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。
通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。
这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。
免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。
这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。
沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。
该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。
在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。
如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。
提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。
外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。
形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。
通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。
粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。
NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
外泌体目前的生产工艺
外泌体目前的生产工艺一、通过干细胞培养，获得外泌体。
（如人脂肪干细胞，脐血干细胞、动物干细胞）二、直接在动物器官、组织中提取外泌体。
（如血液、唾液、尿液、细胞上清、脑脊液、羊水、胎盘组织）三、直接在植物中提取外泌体。
（如番茄、人参、红豆杉、生姜）四、通过基因工程大肠杆菌能够分泌外泌体（如采用基因编辑、各种转染体系）五、通过纳米尺寸的过滤器对细胞进行连续的挤压，可产生外泌体模拟物纳米囊泡六、人工合成外泌体复合物。
（如利用透明质酸的配体活性与聚乙烯亚胺的透膜活性使二者协同作用人工合成外泌体复合物）外泌体目前的提取工艺一、超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法。
此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
二、过滤离心，这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
三、密度梯度离心法，用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
四、免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
五、PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。
该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。
由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。
2016.9《Scientific Reports》杂志发表了该方法最新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。
六、色谱法，这种方法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
【干货分享】外泌体提取的3种超速离心方法（内含赠书福利）
【干货分享】外泌体提取的3种超速离心方法（内含赠书福利）文末有《细胞外囊泡：基础研究与临床应用》书籍赠送！最近小编的一位朋友投一篇外泌体的文章，五分左右的杂志，审稿却对manuscript中用的“exosome”一词表示怀疑，可是朋友用的是目前很公认的超速提取的方法。
可见人们对外泌体领域的研究方法要求越来越高了。
但是，目前确实没有可以得到百分之百pure的外泌体，超速离心仍然是最受公认的外泌体提取方法。
为了满足大家不同层次的外泌体提取方法的要求。
本文给大家提供3种基于超速离心的外泌体提取protocol。
1.基础版——普通超速离心该方法此前在外泌体之家已经提到过非常多次了。
该方法又称为差速离心法。
简单说低速离心去除死细胞、大的细胞碎片；高速离心去除小的细胞碎片、大囊泡等；最后超速离心得到外泌体。
各文献中具体的各阶段离心力和时间大同小异，主要可以参考参考文献1。
超速离心提取外泌体流程示意图详细protocol可见进阶版中的第1-5步。
2.进阶版——基于蔗糖垫的超速离心如果对外泌体的纯度要求较高，但又不想做密度梯度离心那么麻烦，大家可以用基于蔗糖垫的超速离心方法。
这里以提取细胞上清中外泌体为例，给大家详细提供一个protocol。
蔗糖垫示意图1.新鲜收集细胞上清，以300 g、4度、离心10 min，去除细胞、死细胞，离心后取上清；2.2000 g、4度、离心10 min，去除细胞碎片，离心后取上清；注：常有小伙伴问细胞上清不能及时处理，该怎么保存。
此步骤后的上清可于4度保存，48 h内提取外泌体为佳；若需长期保存，可冻存于-80度，解冻时4度慢融。
切记不经一二步离心去除细胞、死细胞、细胞碎片就直接保存，会严重影响后面提取的外泌体的组分。
3.10000 g，4度、离心30 min，去除大膜泡，离心后取上清；注：若采用普通超离法进入步骤4；若采用蔗糖垫超速离心法进入步骤6。
4.普通超离法。
以Beckman超速离心机为例，严格按照超速离心操作步骤进行，将超速离心管装入准备好的细胞上清至距离心管口2-3 mm处；120000 g、4度、离心70 min。
外泌体提取的具体方法及步骤
外泌体提取的具体方法及步骤
一、技术简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。
包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。
目前外泌提取主要有超速离心、过滤离心、试剂盒提取等方法。
本司采取超速离心分离得到外泌体，纯度高，得率大，满足于后续不同实验的需求。
二、实验流程
血清/血浆样本：
1. 分离得到血浆/血清。
2. 低速离心去除碎片及杂质。
3. 超速离心获得外泌体沉淀。
4. 外泌体纯化。
5. BCA法检测外泌体浓度。
6. 提供实验报告。
培养上清样本：
1. 培养液收集。
2. 低速离心去除细胞、碎片及杂质。
3. 超速离心获得外泌体沉淀。
4. 外泌体纯化。
5. BCA法检测外泌体浓度。
6. 提供实验报告。
提取外周血中外泌体超速离心方法
提取外周血中外泌体超速离心方法提取外周血中外泌体超速离心方法外泌体是一类重要的细胞外囊泡，在细胞间传递信号、调控细胞功能、参与疾病发生发展中起着重要作用。
提取外周血中的外泌体可以为疾病诊断和治疗提供重要的依据。
本文将介绍几种常用的超速离心方法来提取外周血中的外泌体。
步骤一：血液采集•准备采集外周血所需的消毒工具和采血器材。
•使用消毒剂清洁采血部位。
•采集足够的外周血样本（常用标准：10 - 20 mL）。
步骤二：离心方法选择1. 不同离心机参数比较使用不同离心机进行外泌体提取，离心参数是影响提取效果的重要因素。
以下是常用离心参数的比较：•低速离心（示例参数：300 g，10 min）：适用于快速获取大量外泌体，但可能含有较高的细胞残留。
•中速离心（示例参数：2000 g，10 min）：适用于获得较纯净的外泌体，其中包含的细胞残留较少。
•超速离心（示例参数：10000 g，30 min）：适用于提取高纯度的外泌体，但这需要更长的离心时间。
2. 连续离心法连续离心法是提取外泌体的常用方法之一，具体步骤如下：•将采集的外周血样本放置在离心管中，离心速度选择适当。
•第一次离心：将外周血以低速离心（示例参数：300 g，10 min）获得血浆。
•将血浆转移至另一个离心管中，进行第二次离心。
•第二次离心：以超速离心（示例参数：10000 g，30 min）获得外泌体沉淀。
3. 密度梯度离心法密度梯度离心法是提取高纯度外泌体的有效方法，步骤如下：•准备含有不同密度的离心管，形成密度梯度。
•将采集的外周血样本与磷酸盐缓冲液按比例混合，形成混合液。
•将混合液缓慢注入离心管中，避免混合液与密度梯度的直接接触。
•进行超速离心（示例参数：100000 g，2 h）。
•采集密度梯度中某一特定区域的沉淀，其中富含外泌体。
步骤三：外泌体提取与分析•从离心后的沉淀中提取外泌体，可以使用商用提取试剂盒或其他方法。
•进行外泌体的纯化和浓缩。
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Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
提示：送样量最好 20mL 以上
外泌体鉴定
Nanosight（NTA） 测粒径大小
电镜
测颗粒形态
有风险！
因为标本各异பைடு நூலகம்提 取出外泌体进行电 镜检测可能无法得 到典型的图片
外泌体组学检测
芯片
miRNA、lncRNA、circRNA
二代测序
miRNA、lncRNA、circRNA
蛋白质组
Lable free、iTRAQ、SWATH