exosomes外泌体实验方案
一个试剂盒搞定外泌体研究：磁珠法纯化，流式分析
一个试剂盒搞定外泌体研究：磁珠法纯化，流式分析外泌体Exosome外泌体（Exosome），是由多种类型的细胞，如T、B、NK细胞、以及肿瘤细胞等分泌的一种囊泡状结构，直径在30-100nm之间，又称膜外小体（Extracellular Vesicles, EVs）。
外泌体常携带其起源细胞的多种生物分子，包括蛋白质、脂类和核酸，因此，外泌体参与了多种生物学过程，包括免疫监控、血液凝固、神经传递、干细胞维护和组织修复等。
图1：外泌体形成和作用方式示意图。
Difficult：外泌体研究外泌体纯化：难调查发现，约有56%的实验室采用超速离心法分离外泌体，但该方法有其局限性：•耗时耗力：需8-30个小时•处理样本少：每次最多处理6个样品•需要大量的起始材料•产量不高外泌体分析：难由于外泌体体积小（直径30-100nm），流式检测也是一大难题。
图2：由于外泌体体积小，很难用流式检测到单个的外泌体。
检测到的颗粒更像是外泌体群或聚集体。
遇到困难不用怕，超人小旎来帮忙！美天旎为外泌体研究而专门研发了相应的试剂盒，Exosome isolation kit和MACSPlex Exosome Kit，分别用于外泌体的富集和分析。
外泌体磁珠纯化基于美天旎的MACS技术，利用外泌体表面常见的四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81，分别研发了四款磁珠试剂盒，用于阳性分选外泌体，简单三步（磁珠孵育、磁场分离、洗脱，如图3），省时省力，无需进行超速离心，且样本体积最小可至0.5mL。
图3：利用美天旎Exosome isolation kit，简单三步（磁珠孵育、磁场分离、洗脱），1.5h内完成外泌体的纯化。
外泌体流式分析分析外泌体蛋白的传统方法有western blot、质谱分析、扫描电镜和流式分析。
由于外泌体的直径太小（30-100nm），很难通过标准的流式检测方法对其进行分析。
为此，美天旎研发了MACSPlex Exosome Kit, human（#130-108-813）试剂盒，用于简单、快速的分析外泌体表面37种潜在蛋白。
外泌体研究概述Exosome
案例2
Exosome-Mediated miR-155 Transfer from Smooth Muscle Cells to Endothelial Cells Induces Endothelial Injuryr Therapy (2017)
1. 外泌体概述
2. 外泌体分离方法
（1）超速离心：
2000 g for 20 min to eliminate dead cells; 10,000 g for 30 min to remove debris; filtrated though 0.22 μm filter; 100,000 g for 70 min.
密度梯度超速离心：
蔗糖、碘克沙醇 1.15-1.19 g / mL
案例1
Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity, Cell (2017)
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EXOCARTA
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VESICLEPEDIA
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EVPEDIA
HTTP://STUDENT4.POSTECH.AC.KR/EVPEDIA2_XE/XE/
外泌体研究概述
exosome
| 1. 外泌体概述 | 2. 外泌体分离方法 | 3. 外泌体检测方法 | 4. 外泌体常用数据库
外泌体是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，具有脂质双层膜结构， 可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶 性腹水以及其它生物体液中。
外泌体携带特异性的蛋白质、脂质以及功能性的 mRNA、 ncRNA等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促 血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密 切相关。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用 价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可 以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
细胞培养基的Exosome提取方案
细胞培养基上清提取外泌体外泌体产生细胞（Exosome源细胞）的选取：293T细胞：常用于基因改造外泌体；Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小；Mouse lymphoma cell line（EL-4）：小鼠淋巴细胞；各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究:……不同实验的需求不同， Exosome源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。
Exosome源细胞用量：以293T为例，2个15cm盘=4.5个10cm 盘=4*107 cells，最终的Exosome 20ul/20ul 可用于体内原位癌3*104/1ul注射给药，15ul/50ul 可用于105 受体细胞培养加药。
P S: 王红阳方法1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量5ug，105细胞培养用量1ug。
我约莫算了一下，差不多。
楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。
以293T细胞为例制备Exosome：1.2盘10cm 盘在60-70%进行病毒感染，1盘感染GFP（control病毒），1盘感染plv-cs2.0-myc-PD1，病毒感染后16-18h后换液；2.36-48h后进行传代：准备10盘10cm盘，每盘加入15ml Exosome-free的10%血清的DMEM，放入37°C培养箱备用。
取出2感染好的2盘细胞，迅速用5ml PBS/遍洗涤3遍，加入1ml胰酶，摇匀使每个细胞都孵育胰酶，37°C静置消化1min，加入4ml Exosome-free 的10%血清的DMEM静置，获得5ml细胞悬液，加入到准备好的10盘10cm盘中，获得5盘GFP、5盘plv-cs2.0-myc-PD1稳转293T 细胞系，37°C培养48h；3.取4根灭菌处理过的50ml管，收集细胞培养基，分装成37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1各两管，进行三步法离心：✓4°C离心200-300g，5min去细胞，分别小心吸取上清34ml入新的灭菌50ml 管；✓4°C离心12,000-16,000g，45min去碎片，分别吸取31ml上清入新的灭菌50ml 管，0.22um滤膜（Millipore）过滤，最后62ml左右汇入一管Beckman快速密封管Beckman Quick seal tubes；✓Beckman 70Ti 转子4°C超离100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS重悬exoxome。
外泌体检测丨流式细胞术分析
外泌体检测丨流式细胞术分析传统的外泌体研究，基本都是用WB之类来检测和表征外泌体，比如用SDS-PAGE电泳可分析Exosome中蛋白的大致含量及种类（通过条带的位置和条带的粗细）；2-DE等蛋白组学分析可以知道Exosome中不同蛋白的表达和数量等情况；透射电镜可分析Exosome的大小和形态等，如果想要知道表达部位在哪，就可以结合免疫标记实验进行定位，通过定量PCR可以分析所研究的指标的表达量等。
那么今天就来说说，用于流式细胞仪检测外泌体的强大试剂——Exostep。
Exostep外泌体检测试剂盒是一种简单的免疫珠检测外泌体的方法，使用的是与珠子结合的捕获抗体和与荧光染料偶联的检测抗体。
Exostep外泌体检测试剂盒可提供可重复的结果，可与外泌体免疫免疫分型同时进行。
Immunostep ExoStep用于从生物液体（血浆，血清，尿液）或细胞培养基中预富集的人类（也有动物哟）外泌体的流式细胞术分析。
一起来看看它的特点吧~1.需要的样品量非常少；可重复性；灵敏度更高；动态范围更广；明确的检测；定量分析；直接检测细胞培养上清液和生物液中的外泌体；无需分离或沉淀；允许外泌体捕获细胞群的同时进行免疫表型分析2.操作步骤简易（如下：）预富集外泌体——50ul外泌体悬浮液+50ul捕获磁珠——常温过夜孵育——加入1x Assay Buffer 1ml ——加入5ul 检测抗体孵育——加入1x Assay Buffer 1ml ——加入1x Assay Buffer 350ul——洗完后就获得了需要的外泌体——上机检测。
怎么样，是不是很简单，很清晰，很明了？3.有适用各种样本的试剂盒产品，适用的样本有细胞培养样品、血浆、尿液等。
4.可单独提供高效能的外泌体捕获磁珠从一种细胞类型中纯化特定的外泌体或外泌体亚群表征仍然是一个挑战。
Immunostep的人类捕获珠，无需事先进行样品富集程序，就可以从生物体液（血清，血浆，CSF，唾液，尿液等）中分离出特定的外泌体。
Exosome 外泌体
蔗糖、碘克沙醇 1.15-1.19 g / mL
案例1
Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity, Cell (2017)
案例2
Exosome-Mediated miR-155 Transfer from Smooth Muscle Cells to Endothelial Cells Induces Endothelial Injury and Promotes Atherosclerosis, Molecular Therapy (2017)
（2）超滤：
Vivaspin 20，100 kDa MWCO （GE Life sciences）
Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney international(2012).
Non-coding RNA 2017, 3, 10; doi:10.3390/ncrna3010010
1. 外泌体概述
2. 外泌体分离方法
（1）超速离心：
2000 g for 20 min to eliminate dead cells; 10,000 g for 30 min to remove debris; filtrated though 0.22 μm filter; 100,000 g for 70 min.
外泌体 Exosome
Exosome简介，提取，分析（全）一，Exosome简介最近几年，一种叫做Exosome的小囊泡正受到大家广泛的关注。
Exosome 是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。
Exosome天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。
Exosome在30年前被人们所发现。
早期的研究认为，exosome执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。
直到2007年，研究人员发现exosome也运输核酸，参与细胞间通讯。
总之，其蛋白、RNA 和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，这使得exosome的市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
不同组织细胞来源exosome由于携带的蛋白质不同，而能够发挥不同的生物学功能。
例如，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸；而树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
目前研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome 能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
Exosome携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。
前者可能与exosome的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如分子来源的Exosome上含有MHCII类分子。
二，Exosome提取Exosome是由活细胞分泌的，它是一种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分子和携带的膜性分子，其界定依据形态学和生物化学及提取方式不同细胞源的exosome是不同的，这些不同的理化性质有利于exosome的提取。
外泌体（Exosome）知识与检测方法
外泌体（Exosome）知识与检测⽅法⼀、 Exosome 简介最近⼏年，⼀种叫做Exosome的⼩囊泡正受到⼤家⼴泛的关注。
Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的⼩囊泡。
Exosome天然存在于体液中，包括⾎液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。
Exosome在30年前被⼈们所发现。
早期的研究认为，exosome执⾏蛋⽩运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋⽩和脂类或引发下游信号事件。
直到2007年，研究⼈员发现exosome也运输核酸，参与细胞间通讯。
总之，其蛋⽩、RNA和脂肪成分特异，且携带了⼀些重要的信号分⼦，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作⽤，这使得exosome的市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
不同组织细胞来源exosome由于携带的蛋⽩质不同，⽽能够发挥不同的⽣物学功能。
例如，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导⾎管再⽣肿瘤细胞增殖及免疫逃逸；⽽树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
⽬前研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋⽩质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过⽣物屏障，在细胞间传递功能性核酸分⼦，从⽽发挥各种⽣物学功能，故exosome有望成为⼀种新型给药途径及基因治疗载体。
Exosome携带蛋⽩质包括源细胞⾮特异性和源细胞特异性两类蛋⽩分⼦。
前者可能与exosome的⽣物发⽣和⽣物学作⽤有关，主要包括：细胞溶质蛋⽩、参与细胞内信号转导的蛋⽩、各种代谢酶、热休克蛋⽩和四跨膜蛋⽩；另⼀类是特殊蛋⽩质，这类蛋⽩质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，⽽这些特定细胞源的exosome与其⽣物学功能有着密切联系，例如分⼦来源的Exosome上含有MHCII类分⼦。
⼆， Exosome 提取Exosome是由活细胞分泌的，它是⼀种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分⼦和携带的膜性分⼦，其界定依据形态学和⽣物化学及提取⽅式不同细胞源的exosome是不同的，这些不同的理化性质有利于exosome的提取。
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究
人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究一、本文概述Overview of this article随着生物医学领域的快速发展，干细胞及其分泌产物的研究已成为当前生命科学领域的热点之一。
人骨髓来源间充质干细胞（hMSCs）作为一种具有多向分化潜能的成体干细胞，其在组织工程、再生医学以及疾病治疗等领域的应用潜力备受关注。
近年来，随着对外泌体（Exosomes）研究的深入，人们发现hMSCs分泌的外泌体在细胞间的信息传递、免疫调节以及组织修复等方面发挥着重要作用。
因此，本文旨在深入研究人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体的特性，以期为hMSCs在医学领域的临床应用提供新的思路和方法。
With the rapid development of the biomedical field, research on stem cells and their secreted products has become one of the hotspots in the current field of life sciences. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs), as an adult stem cell with multi-directional differentiation potential, have attracted much attention for their potential applications in tissue engineering, regenerative medicine, and diseasetreatment. In recent years, with the deepening of research on exosomes, it has been found that exosomes secreted by hMSCs play important roles in intercellular information transmission, immune regulation, and tissue repair. Therefore, this article aims to investigate in depth the characteristics of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells secreting exosomes, in order to provide new ideas and methods for the clinical application of hMSCs in the medical field.本文将首先介绍hMSCs的基本生物学特性及其在组织工程和再生医学中的应用。
外泌体提取的具体方法及步骤
外泌体提取的具体方法及步骤
一、技术简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。
包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。
目前外泌提取主要有超速离心、过滤离心、试剂盒提取等方法。
本司采取超速离心分离得到外泌体，纯度高，得率大，满足于后续不同实验的需求。
二、实验流程
血清/血浆样本：
1. 分离得到血浆/血清。
2. 低速离心去除碎片及杂质。
3. 超速离心获得外泌体沉淀。
4. 外泌体纯化。
5. BCA法检测外泌体浓度。
6. 提供实验报告。
培养上清样本：
1. 培养液收集。
2. 低速离心去除细胞、碎片及杂质。
3. 超速离心获得外泌体沉淀。
4. 外泌体纯化。
5. BCA法检测外泌体浓度。
6. 提供实验报告。
体液中外泌体(Exosomes)的提取
【注】： 冻存样品置水浴锅解冻后置 2-8℃保存。 -4-
2. 将样品在 4℃条件下，3000g 离心 15 分钟。弃沉淀，收集上清。 3. 小心将上清移入另一干净离心管中。 4. 将样品在 4℃条件下，10000g 离心 20 分钟。弃沉淀，收集上清。 5. 小心将上清移入另一干净离心管中。 6. 在 4ml 上清中加入 1ml 提取液 A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀 1 分钟左右，使液
产品特点： 使用方便，无需超速离心，省时省力； 纯度高，富集量大，应用范围广； 获取的 Exosome 结构和功能完整； 稳定性好，便于运输，便于保存。
相关试剂盒选择指南：
货号 BB-3901 BB-39012 BB-39013 BB-39014
试剂盒名称 外泌体提取试剂盒 外泌体提取试剂盒 外泌体提取试剂盒 外泌体提取试剂盒
使用方法：
使用注意事项： 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。 以下以 4ml 体液为例，实际操作时按体液和提取液 A 用量体积比 4：1 使用即可。 不同体液中所含的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择体液样品的量，根据下游应用和
参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的体液样本。 除非已经确认体液样本中含有较多外泌体或者体液样本较难获得，一般体液样本建议每个样体
-5-
抽提得到的 RNA 浓度低？ 很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样 量。
相关产品：
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产品号
Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 BB-4101
Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 BB-4102
大鼠外泌体(Exosome)ELISA试剂盒技术指导
大鼠外泌体(Exosome）ELISA试剂盒技术指导大鼠外泌体(Exosome）ELISA试剂盒操作说明大鼠外泌体(Exosome）ELISA试剂盒实验原理大鼠外泌体(Exosome）ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被大鼠外泌体(Exosome）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的大鼠外泌体(Exosome）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样本处理及要求1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。
推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。
为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。
最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
exosomes外泌体实验方案
外泌体分离提纯草案By 朱旭峰一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。
（sigma）1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。
超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotorA-641) 4 ℃. 2 小时1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)2材料a)细胞培养液b)蛋白酶抑制（Sigma）c)过滤筛(Millipore)d)冷的PBSe)低粘附的管f)Direct Detect™(Millipore)二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去除较大的囊泡、1.4此阶段的样品可以1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制（Sigma）b)过滤筛(Millipore)c)冷的PBSd)低粘附的管e)Direct Detect™(Millipore)三、ExoQuick TM化学沉淀法1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
外泌体研究策略
6、Intercellular Transfer of lncARSR by Exosomes Disseminates Sunitinib Resistance
7、AXL and c-MET Are Responsible for lncARSR-Mediated Sunitinib Resistance
Tan A Advanced drug delivery reviews, 2013, 65(3): 357-367.
外泌体研究的兴起
外泌体研究基础技术
1、外泌体分离 1）超速离心 2）磁珠免疫捕获 3）沉淀或过滤法，
2、外泌体鉴定与定量 1）鉴定：电镜或NTA来分析其大小和形态，流式细胞仪或WB检测表面标记蛋白， Western blot和ELISA检测 TSG101、CD63。 2）定量：NTA检测外泌体数量，BCA定量检测蛋白浓度。
2、Annexin V, calcium, and BMP-2 in EMPs from HUVECs stimulated by TNF-a BMP-2表面标记流式检测；SN50 nf-kb抑制剂
3、The effect of EMPs from HUVECs stimulated by TNF-a on VSMC calcification
1、lncARSR Is Highly Expressed in Sunitinib-Resistant RCC Cells
2、lncARSR Is Modulated by AKT/FOXO Axis in Sunitinib-Resistant RCC Cells
3、lncARSR Is Required for Sunitinib Resistance of RCC
外泌体是什么？外泌体检测方法
外泌体是什么？外泌体检测方法外泌体是什么？外泌体（exosome）是是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。
从细胞中提取外泌体后可以通过透射电镜来分析exosome的大小、形态等，再经过Western Blot可以分析特定蛋白在exosome中的表达情况。
外泌体中的蛋白、RNA和脂肪成分特异，并且携带了一些重要的信号分子，其在多种疾病的早期诊断中发挥着重要的作用。
如何提取外泌体？外泌体的提取方法有很多，例如超速离心法、密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法、磁珠免疫法和试剂盒提取。
实验室常用的提取方法是如下两种：1、超速离心法（差速离心）超离法是常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
2、试剂盒提取近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。
这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。
有些试剂盒操作简便，不用超速离心，同时可获得高纯度和高回收率的外泌体。
外泌体粒径分析、浓度检测外泌体粒径分析方法为纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking Analysis, NT A)，其原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein 方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。
NT A技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。
相较于其他表征方式，NT A技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。
【外泌体研究手册】Exosome...
【外泌体研究手册】Exosome...12月10日，著名在线实验室指南出版公司Springer Protocols 在线发表了关于外泌体和微泡的研究方法手册。
Exosomes and Microvesicles: Methods and Protocols这本实验方法手册汇集了用于各类研究细胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）的方法。
在过去十年中，在我们更多地了解外泌体、微泡和其他EV在细胞生物学的许多方面的作用时，EV研究领域已经有显著的增长。
已经发现了EVs在细胞与细胞通讯中的新兴作用，及其作为疾病生物标志物来源和用作治疗的递送剂的潜力。
本卷“Methods in Molecular Biology”中的方案涵盖了用于分离分析各种来源EV的方法。
其中使用电子显微镜、可调电阻脉冲感测和纳米粒子跟踪分析。
此外，使用多种不同方法的蛋白质组学和基因组分析方法的具体章节中包含EV蛋白质和核酸成分的分析。
也包含用于从不同来源（例如血小板、神经元细胞和组织）分离EV的方法。
综合这些，该手册提供了用于研究EV的相关方法的全面讨论。
主要包含以下内容：▪细胞外膜泡的研究方法总论。
Methods to Analyze▪可调电阻脉冲检测表征细胞外膜泡。
Tunable Resistive Pulse Sensing for the Characterization of Extracellular Vesicles ▪纳米粒子跟踪分析外泌体的免疫特征。
Immuno-Characterization of Exosomes Using Nanoparticle Tracking Analysis▪细胞外膜泡的电镜观察和量化。
Imaging and Quantification of Extracellular Vesicles by Transmission Electron Microscopy ▪通过qPCR和数字PCR定量分析外泌体的miRNA。
外泌体研究方案的正确打开方式
外泌体研究方案的正确打开方式啥是外泌体？外泌体（Exosome）是一种由活细胞分泌的圆形（dish）或杯状（cup）脂质双分子层膜微小囊泡，直径约30-100nm，可由各种类型的细胞分泌，广泛存在于血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液、眼泪、腹水、羊水等各种体液以及细胞培养上清中。
外泌体是一种活性复合体，包含复杂的蛋白质，核酸和脂质。
最常见的外泌体蛋白组成包括膜转运和融合相关蛋白、多囊泡胞内体产生相关蛋白，（Alix, TSG101等）、分子伴侣（HSP70,HSP90）、整合素和四跨膜蛋白超家族（CD63,CD9,CD81, CD82等），这些成分反映了其生物起源。
外泌体还富含胆固醇、鞘脂、神经酰胺、糖脂GM3和含长饱和脂肪酰基的甘油磷脂链。
外泌体的起源外泌体的前身含有一个秘密武器，叫泛素化蛋白，被ESCRT（转运必需内体分选复合物）识别，形成内腔囊泡（ILVs），进一步形成膜性囊泡（MVBs），其中一部分会被降解为溶酶体，当MVBs与细胞膜发生融合后这些小囊泡可被释放到细胞外空间，称为外泌体。
外泌体生物功能2013年，美国科学家James E. Rothman, Randy W. Schekman 和德国科学家Thomas C. Sudhof因细胞囊泡运输的调节机制而荣获当年诺贝尔生理学或医学奖。
研究表明：外泌体有携带与运输功能，随着体液循环到达全身各个部位，通过与受体细胞的质膜保持稳定结合或经由内吞途径被内化，释放出外泌体中的内容物。
外泌体与靶细胞融合后，靶细胞的生物学特性可以在基因水平（外泌体RNA）转录水平（外泌体miRNA）或在蛋白水平发生改变，从而实现细胞间通信。
这些相互作用可能导致有益（如增强免疫状态）或有害（如扩散发病）的结果。
外泌体分离纯化方法外泌体鉴定方法NTA鉴定纳米颗粒跟踪分析（Nanopraticle Tracking Analysis, NTA）技术可以对10-2000nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，测量参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等，可对外泌体进行粒径大小及数量进行统计并做出初步质量评估。
外泌体电镜检测及透射电镜具体方法及方案
外泌体电镜检测/透射电镜具体方法及方案
一、技术简介
外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，形态也呈现出多样性，有研究分为9个类别依次为：单囊泡、双囊泡、多膜泡、小双层膜泡、椭圆膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不规则膜泡，其中在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征：表面具涂层的膜泡、内含纤维的膜泡、电子致密囊泡。
本司采取通过透射电镜确定外泌体大小。
二、实验流程
1. 外泌体戊2醛固定。
2. 将5-10μl外泌体溶液滴加到铜网上，室温吸附10min左右，用滤纸小心吸去多余的液体。
然后向铜网上滴加10μl 2%的磷钨酸溶液（pH=6.5），在室温下对外泌体染色处理2min，小心用滤纸吸去多余的染色液，将铜网在室温下晾干。
3. 上机观察，观察电压为120kV。
4. 提供实验报告。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
E-Lab外泌体科研，初学者容易忽略的issues（一）
E-Lab外泌体科研，初学者容易忽略的issues（一）这是我们今天新推出的栏目E-lab（exosome lab），主要内容是围绕exosome在实验室研究时会用到的实验操作及其注意事项。
在之前的视频中我们已经大致了解what is exosome？在这一系列课程中也有对exosome做了充分的介绍。
有兴趣的可以在后台回复“E-lab预热课程”来获得盘链接。
课程目录：（图片向上滑动看全目录）那么来进入今天的正题吧。
今天的主题是：细胞培液和体液胞外囊泡提取的收集和处理——体外实验中的注意事项视频长达13分钟。
没有wifi的师兄师姐可以看下面的图文版字多不看版-为每种细胞类型尽可能的优化条件--不要再一个project中改变条件--FBS当中还有EV会污染你的样本--在收集EV时要测量细胞的存活率--确认细胞没有支原体污染-图文版今天课程的主讲人是课程围绕以下几个方面展开FBS中 EVs的去除细胞的生存能力刺激EV的释放微生物的污染稳定的细胞培养条件胎牛血清中含有EVs已经是众所周知，并且EV中还含有RNA和蛋白质。
所以在培养细胞的时候，FBS中的EV去除是十分必要的。
含有EV的FBS会对实验结果造成一定的影响Note没有FBS的条件下会引起应激反应，导致不同成分的EV释放当然也有不用FBS这种作为养料的“骚操作”。
Note但就是效果不一定好就是了，Adv media并不是所有细胞都能适用的。
所以在用FBS的时候还是老老实实去除EV吧一般实验室去除EV的方式是采用超速离心的方法。
离心后的效果就不言而喻了。
在EV-free的FBS里培养细胞，得到的结果和对照组比较，实验结果明显优化了许多。
上图是实验中用了TRAIL来诱导TF-1细胞的凋亡，我们在检测RNA的时候发现了以上的结果。
说明细胞的死亡绝对绝对会影响我们EV的提取。
Note-来自死亡细胞的EV会污染从活细胞中分离的EV-为了获得纯的EV分离物，建议最大可接受5%的细胞死亡。
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外泌体分离提纯草案
By 朱旭峰
一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）
1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比
1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。
（sigma）
1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地
细胞和残渣。
超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor
A-641) 4 ℃. 2 小时
1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g
(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时
1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中
1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL
的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)
2材料
a)细胞培养液
b)蛋白酶抑制（Sigma）
c)过滤筛(Millipore)
d)冷的PBS
e)低粘附的管
f)Direct Detect™(Millipore)
二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）
1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂
(Sigma)
1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃
1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来
去除较大的囊泡、
1.4此阶段的样品可以
1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g
(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃
1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，
1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬
1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏
2.材料
a)蛋白酶抑制（Sigma）
b)过滤筛(Millipore)
c)冷的PBS
d)低粘附的管
e)Direct Detect™(Millipore)
三、ExoQuick TM化学沉淀法
1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行
1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用
倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液
1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃
1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤
1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可
(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
2材料
a)ExoQuick TM试剂盒
b)流式细胞仪
四、用ME TM分离外泌体
1.1样品（CM或人血清）要按照商品说明书(New England Peptide –
NEP)稀释
1.2样品要事先处理好，17,000g 7分钟来去除微粒物质
1.3然后用ME TM试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温
混合15分钟
1.4孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟
1.5所有的样品要用PBS洗三次
1.6最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬
五、抗体
以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流式细胞术）
1.1mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来
自于Beckton Dickinson,
1.2mAb aCD63-biotin (BioLegend),
1.3mAb aAlix (Santa Cruz),
1.4mAb aTsg101 (Abcam),
1.5pAb aRab5 (Santa Cruz),
1.6mrAb aRab5 (Epitomics),
1.7mAb aCalnexin (Abcam),
1.8二抗是anti-Mouse和anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako). 专门的
肿瘤外泌体(HBM1 and HBM2) 结合抗体由HansaBioMed R&D
team.提供
六、用Westen Blot 探测外泌体的蛋白
1.1将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度
下
1.2用SDS-page分离外泌体的蛋白质
1.3把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）
1.4一二抗体孵化
1.5信号要在暗室里用ECL附加
七、外泌体免疫捕捉和蛋白定量ELISA
1.1从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆为
免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲
液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）
1.2PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示
说明，应该用PBS稀释样品
1.3将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100
μl），孵化4℃过夜或者室温2小时（可以使用商业化的exosomes
捕捉平板(HansaBioMed)）
1.4传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓
冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4℃。
1.5在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方
用样品缓冲液1小时于4℃。
基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物(Roche)反应的
光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 (TECAN)
a)QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Scientific)要用连
续的激发光束在325/425nm
b)SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo
Scientific)要先孵化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数
2.材料
a)96孔板
b)碳酸氢盐缓冲液PH=9.6
c)BSA PBS Tween-20 蔗糖
d)辣根过氧化物酶二抗
e)辣根过氧化物酶的底物
f)酶标仪
八、磁珠捕获外泌体
1.商业化的预包裹的乳胶微球
1.1根据商品说明书(HansaBioMed)来分离外泌体
1.2每个样品先用1ml的PBS来稀释
1.3选用合适的珠子去孵化4℃过夜，旋转震荡。
1.4之后可以用离心的方法来分离（5000个，10分钟），再用PBST洗涤3
次。
2.磁珠分离法
2.1比较了“1μm大小的链霉亲和素磁珠”(Thermo Scientific, 88816)
和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）
2.2先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2μg的抗体（外泌体结合的同种抗体，
CD9抗体（Beckton Dickinson））
2.3生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用PBST洗三次，再用合
适的固定剂固定（干酪素，BSA或人血清）室温1小时
2.4重悬于PBS，然后加入样品（CM或人血浆）
2.5为了最终可以富集磁珠到近108/ml，将其孵化过夜4摄氏度旋转
rotation
2.6用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST
洗三次
2.7磁珠也会溶解于Laemmli buffer，所以在做为westen bolt先将其煮沸
或者可以选择做bead-based ELISA
3.免疫珠分离法
3.1用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温，用ELISA缓冲液冲洗
3.2再加入二抗(辣根过氧化物酶)孵化1小时，然后大量的冲洗之
3.3为了可以被侦测到，需加入底物BM Blue POD Substrate (Roche)，孵
化10分钟为了终止反应，加入硫酸，并在450nm波长下读数
4.材料
a)商品化的磁珠
b)辣根过氧化物酶二抗
c)辣根过氧化物酶的底物
d)酶标仪
e)PBST。