exosomes外泌体实验方案

外泌体分离提纯草案

By 朱旭峰

一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）

1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比

1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma）

1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地

细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor

A-641) 4 ℃. 2 小时

1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g

(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时

1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中

1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL

的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)

2材料

a)细胞培养液

b)蛋白酶抑制（Sigma）

c)过滤筛(Millipore)

d)冷的PBS

e)低粘附的管

f)Direct Detect™(Millipore)

二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）

1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂

(Sigma)

1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃

1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来

去除较大的囊泡、

1.4此阶段的样品可以

1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g

(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃

1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，

1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬

1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏

2.材料

a)蛋白酶抑制（Sigma）

b)过滤筛(Millipore)

c)冷的PBS

d)低粘附的管

e)Direct Detect™(Millipore)

三、ExoQuick TM化学沉淀法

1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行

1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用

倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液

1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃

1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤

1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可

(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。

2材料

a)ExoQuick TM试剂盒

b)流式细胞仪

四、用ME TM分离外泌体

1.1样品（CM或人血清）要按照商品说明书(New England Peptide –

NEP)稀释

1.2样品要事先处理好，17,000g 7分钟来去除微粒物质

1.3然后用ME TM试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温

混合15分钟

1.4孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟

1.5所有的样品要用PBS洗三次

1.6最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬

五、抗体

以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流式细胞术）

1.1mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来

自于Beckton Dickinson,

1.2mAb aCD63-biotin (BioLegend),

1.3mAb aAlix (Santa Cruz),

1.4mAb aTsg101 (Abcam),

1.5pAb aRab5 (Santa Cruz),

1.6mrAb aRab5 (Epitomics),

1.7mAb aCalnexin (Abcam),

1.8二抗是anti-Mouse和anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako). 专门的

肿瘤外泌体(HBM1 and HBM2) 结合抗体由HansaBioMed R&D

team.提供

六、用Westen Blot 探测外泌体的蛋白

1.1将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度

下

1.2用SDS-page分离外泌体的蛋白质

1.3把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）

1.4一二抗体孵化

1.5信号要在暗室里用ECL附加

七、外泌体免疫捕捉和蛋白定量ELISA

1.1从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆为

免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲

液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）

1.2PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示

说明，应该用PBS稀释样品

1.3将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100

μl），孵化4℃过夜或者室温2小时（可以使用商业化的exosomes

捕捉平板(HansaBioMed)）

1.4传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓

冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4℃。

1.5在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方

用样品缓冲液1小时于4℃。

基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物(Roche)反应的

光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 (TECAN)

a)QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Scientific)要用连

续的激发光束在325/425nm

b)SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo

Scientific)要先孵化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数

2.材料

a)96孔板

b)碳酸氢盐缓冲液PH=9.6

c)BSA PBS Tween-20 蔗糖

d)辣根过氧化物酶二抗