(完整版)外泌体提取方法总结
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体提取和鉴定介绍
外泌体是细胞分泌的一种小囊泡，直径在30-150 纳米之间，含有多种生物分子，如蛋白质、核酸、脂质等。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
外泌体的提取通常需要使用特殊的方法，以确保其纯度和完整性。
常见的提取方法包括超速离心、超滤、免疫亲和层析等。
这些方法可以根据外泌体的大小、表面标志物或其他特性进行分离和纯化。
鉴定外泌体的方法也有很多种。
其中一些常见的方法包括：
- 电子显微镜：观察外泌体的形态和大小。
- Western blot：检测外泌体表面标志物或内含物的蛋白质。
- 纳米颗粒跟踪分析：测量外泌体的粒径分布和浓度。
- 流式细胞术：根据外泌体的表面标志物进行分选和定量。
此外，还可以通过检测外泌体中的RNA 或DNA 来进一步分析其内容和功能。
这些鉴定方法可以帮助确定所提取的物质是否为真正的外泌体，并提供有关其特性和功能的信息。
需要注意的是，外泌体的研究仍然是一个相对较新的领域，不同的实验方法和技术可能会有所差异。
在进行外泌体提取和鉴定时，最好根
据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法，并结合多种技术进行综合分析。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。
外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。
一、超速离心法。
超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。
最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。
二、超滤法。
超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。
最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。
三、沉淀法。
沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。
最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。
四、免疫磁珠法。
免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。
最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。
以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。
希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。
提取外周血中外泌体超速离心方法
提取外周血中外泌体超速离心方法提取外周血中外泌体超速离心方法外泌体是一类重要的细胞外囊泡，在细胞间传递信号、调控细胞功能、参与疾病发生发展中起着重要作用。
提取外周血中的外泌体可以为疾病诊断和治疗提供重要的依据。
本文将介绍几种常用的超速离心方法来提取外周血中的外泌体。
步骤一：血液采集•准备采集外周血所需的消毒工具和采血器材。
•使用消毒剂清洁采血部位。
•采集足够的外周血样本（常用标准：10 - 20 mL）。
步骤二：离心方法选择1. 不同离心机参数比较使用不同离心机进行外泌体提取，离心参数是影响提取效果的重要因素。
以下是常用离心参数的比较：•低速离心（示例参数：300 g，10 min）：适用于快速获取大量外泌体，但可能含有较高的细胞残留。
•中速离心（示例参数：2000 g，10 min）：适用于获得较纯净的外泌体，其中包含的细胞残留较少。
•超速离心（示例参数：10000 g，30 min）：适用于提取高纯度的外泌体，但这需要更长的离心时间。
2. 连续离心法连续离心法是提取外泌体的常用方法之一，具体步骤如下：•将采集的外周血样本放置在离心管中，离心速度选择适当。
•第一次离心：将外周血以低速离心（示例参数：300 g，10 min）获得血浆。
•将血浆转移至另一个离心管中，进行第二次离心。
•第二次离心：以超速离心（示例参数：10000 g，30 min）获得外泌体沉淀。
3. 密度梯度离心法密度梯度离心法是提取高纯度外泌体的有效方法，步骤如下：•准备含有不同密度的离心管，形成密度梯度。
•将采集的外周血样本与磷酸盐缓冲液按比例混合，形成混合液。
•将混合液缓慢注入离心管中，避免混合液与密度梯度的直接接触。
•进行超速离心（示例参数：100000 g，2 h）。
•采集密度梯度中某一特定区域的沉淀，其中富含外泌体。
步骤三：外泌体提取与分析•从离心后的沉淀中提取外泌体，可以使用商用提取试剂盒或其他方法。
•进行外泌体的纯化和浓缩。
外泌体提取步骤
外泌体提取步骤外泌体提取是一种从细胞外分泌物中分离和纯化外泌体的方法，它可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品，并对其进行进一步的分析和研究。
本文将介绍外泌体提取的步骤。
1. 细胞培养需要选择感兴趣的细胞系进行培养。
将细胞种植在培养皿中，并提供适当的培养基和条件，使细胞能够正常生长和分裂。
2. 收集细胞上清液当细胞生长到一定程度时，收集细胞上清液。
将培养皿中的培养基转移至离心管中，并使用低速离心（约300-500×g）离心10-20分钟，以去除细胞和细胞碎片。
3. 高速离心将离心后的上清液转移到新的离心管中，并使用高速离心（约10,000-20,000×g）离心30-60分钟，以沉淀外泌体。
4. 洗涤外泌体将外泌体沉淀用冷PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，以去除杂质和未结合的蛋白质。
洗涤过程中可以进行多次离心和上清液的去除。
5. 再次离心将洗涤后的外泌体沉淀用PBS再次离心，以获得更纯净的外泌体样品。
6. 纯化外泌体为了进一步提高外泌体的纯度，可以使用浓缩、超滤等方法对外泌体进行纯化处理。
这些方法可以去除残余的蛋白质和其他杂质，提高外泌体的纯度和浓度。
7. 确认外泌体使用电子显微镜观察外泌体的形态和结构，确认提取到的颗粒为外泌体。
此外，还可以使用Western blot、质谱等技术对外泌体进行进一步的鉴定和验证。
8. 外泌体的应用提取到的外泌体可以用于进一步的研究和应用。
外泌体中包含了丰富的蛋白质、核酸、脂质等生物分子，可以用于疾病诊断、药物传递、基因治疗等领域。
总结：外泌体提取是一种重要的实验操作，可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品。
通过细胞培养、离心、洗涤和纯化等步骤，可以从细胞上清液中分离和纯化外泌体。
外泌体提取的纯度和质量对于后续的研究和应用至关重要。
外泌体的提取和研究有望在生物医学研究中发挥重要作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
外泌体正规操作方法
外泌体正规操作方法
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一类具有膜包裹的细胞外体，可以通过分泌进入细胞外液。
以下是外泌体的正规操作方法：
1. 细胞培养和外泌体收集：
- 选择适合外泌体比较丰富的细胞系，如癌细胞系等。
- 使用含有足够营养物质的培养基进行培养，在细胞生长到80-90%的密度时进行收集外泌体。
2. 细胞外泌体的分离和富集：
- 低速离心：对细胞上清和培养基进行低速离心，将细胞碎片和大颗粒物质沉淀。
- 高速离心：将低速离心上清进行高速离心，以沉淀分离出外泌体。
- 滤膜过滤：可以使用0.2至0.8微米的滤膜，通过滤膜将外泌体分离出来。
3. 外泌体的纯化和浓缩：
- 过滤：使用0.2至0.45微米的滤膜，将外泌体悬液过滤以去除细胞碎片和大颗粒物质，得到纯化的外泌体。
- 超速离心：将外泌体悬液进行超速离心，将外泌体沉淀。
- 液氮冷冻：将外泌体悬液进行液氮冻结保存，以便后续分析或实验操作。
4. 外泌体的鉴定和表征：
- 电镜观察：使用透射电子显微镜观察外泌体形态和结构。
- 免疫学鉴定：使用外泌体表面标记物的抗体进行免疫学检测，如CD63、CD81等。
- 蛋白质分析：使用质谱分析等方法对外泌体中的蛋白质进行分析。
需要注意的是，在操作过程中应避免外泌体的污染和损伤，同时应遵循生物安全操作规范。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
血清外泌体提取方法
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
（完整版）外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×ｇ离心10 min，吸取上清液，然后 2 000×ｇ离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×ｇ超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在 1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×ｇ离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×ｇ离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×ｇ保持30分钟，然后以200,000×ｇ进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μｍ注射器过滤器过滤，并以200,000×ｇ离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°Ｃ下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表 3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展
外泌体提取方法及鉴定分析研究进展外泌体是细胞分泌的一种微小膜泡，包含了多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
近年来，随着生物技术的不断发展，外泌体提取方法和鉴定分析研究取得了显著的进展。
本文将对外泌体提取方法及鉴定分析研究进展进行简要综述。
外泌体是由细胞分泌的一种直径约30-100nm的膜泡，由细胞内吞摄取并加工处理形成。
外泌体在细胞间通讯、物质运输以及疾病诊断等方面具有重要作用。
化学法是一种常用的外泌体提取方法，主要采用离心和沉淀相结合的方法。
首先将细胞培养液进行高速离心，去除细胞和较大的膜泡，然后加入沉淀剂沉淀获得外泌体。
该方法的优点是操作简单、提取量较大，适合大量样本的处理。
但是，该方法纯度较低，可能会影响后续的鉴定和分析。
生物法是一种利用细胞表面标志物进行免疫吸附的外泌体提取方法。
将外泌体进行免疫吸附，再通过洗脱得到纯度较高的外泌体。
该方法的优点是纯度高、对细胞损伤小，适用于珍贵样本的提取。
但是，该方法操作复杂，提取量较小，需要大量的抗体。
基因工程法是一种利用细胞表达特定基因的外泌体提取方法。
将目的基因转染到细胞中，通过表达特定膜蛋白，诱导细胞分泌出外泌体，再对其进行纯化和提取。
该方法的优点是纯度高、提取量较大，适用于具有特定功能的外泌体提取。
但是，该方法需要特定的基因工程技术和细胞系，操作较为复杂。
蛋白质组学在外泌体研究中的应用不断深入。
通过蛋白质组学技术，可以鉴定外泌体中的蛋白质种类、相对丰度以及修饰情况等。
通过比较不同条件下外泌体蛋白质组学的差异，可以研究外泌体的生物学特征和功能。
随着二代测序技术的不断发展，基因序列分析在外泌体研究中也得到广泛应用。
通过对外泌体中的核酸进行测序，可以鉴定其中的基因序列和表达水平。
通过比较不同条件下外泌体基因序列的差异，可以研究外泌体在细胞间通讯和疾病诊断等方面的作用。
转录组测序转录组测序可以分析外泌体中的mRNA、lncRNA和miRNA等转录本。
外泌体提取要几步？
外泌体提取要几步？外泌体（exosomes）是活细胞分泌的直径约为30-150nm的膜性囊泡，准确来讲，外泌体是一类由细胞释放的细胞外囊泡。
根据其生物合成或释放途径可以对细胞外囊泡进行分类：1.外泌体(exosomes)：起源于内吞途径，直径为30-150nm，其密度约为1.11-1.19g mL-1；2.微粒/微囊泡（microparticles）:直接从质膜释放，直径约100-1000nm；3.凋亡小体（apoptoticbody/bleb）:由细胞凋亡产生，直径约为50nm-2um；4.肿瘤小泡（large oncosomes）:由肿瘤细胞释放产生，直径约1-10um;5.以及其他各种EV亚群;外泌体广泛存在于多种体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。
起初人们认为它是一种细胞的废弃物，并未受到足够的重视。
2013年的诺贝尔生理或医学奖颁给了三位科学家，他们分别是美国科学家James E．Rothman、Randy W．Schekman以及德国科学家Thomas C．Südhof，以表彰他们发现细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制,使外泌体的研究达到全新的高度。
研究发现外泌体能够运载其内源性的蛋白质、脂质、各种代谢酶、mRNA和其他非编码RNA如Mircrorna等，参与重要的细胞间通信过程，尤其在免疫应答/肿瘤侵袭过程中参与重要作用；同时，外泌体的类型和水平，以及携带的蛋白、脂类、mRNA、miRNA、DNA 可以作为生物标志物，作为疾病诊断的依据；外泌体具有脂质双层膜结构，对内容物具有很好的保护作用，可以用作药物载体靶向特定细胞或组织。
如前所述，外泌体存在于多种体液，因此细胞培养的胎牛血清中往往含有外泌体，对于实验研究造成影响。
为了避免外来外泌体体的污染，细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在60%-70%，去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基并继续培养24-48小时。
巨噬细胞外泌体提取方法
巨噬细胞外泌体提取方法摘要：一、引言二、巨噬细胞外泌体的功能与作用三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养2.收集细胞培养液3.离心分离4.制备外泌体富集液5.纯化外泌体四、提取过程中的注意事项五、外泌体的应用领域六、总结正文：一、引言巨噬细胞外泌体（Macrophage exosomes）作为一种具有生物活性的纳米级囊泡，含有丰富的生物信息物质，如蛋白质、核酸和代谢物等。
在生物学、医学研究领域备受关注。
本文将介绍一种简便、有效的巨噬细胞外泌体提取方法，以供研究者参考。
二、巨噬细胞外泌体的功能与作用巨噬细胞外泌体具有多种生物学功能，如传递信号、调控免疫反应、参与细胞间通讯等。
此外，外泌体在疾病发生与发展过程中起着关键作用，如肿瘤发生、炎症反应和神经退行性疾病等。
因此，对巨噬细胞外泌体的研究有助于深入探讨相关疾病的发病机制，为临床诊断和治疗提供新思路。
三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养：选择合适的巨噬细胞株，如RAW264.7，进行体外培养。
可用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行传代培养。
2.收集细胞培养液：将培养皿中的细胞培养液倒入离心管中，注意避免剧烈振荡，以免破坏外泌体结构。
3.离心分离：将收集到的细胞培养液进行低速短时间离心，如300×g离心5分钟，以去除细胞碎片和其他杂质。
4.制备外泌体富集液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，再次进行高速长时间离心，如1000×g离心30分钟，使外泌体富集于上清液中。
5.纯化外泌体：采用超速离心法，如10000×g离心1小时，收集沉淀物，即为纯化的巨噬细胞外泌体。
四、提取过程中的注意事项1.细胞培养过程中要保证无菌操作，避免外源性污染。
2.离心过程中，根据实验需求选择合适的离心速度和时间。
3.制备外泌体富集液时，可采用多次离心方法，以提高外泌体富集效果。
4.纯化外泌体时，注意超速离心的条件，避免过度离心导致外泌体破裂。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
外泌体提取的具体步骤及方法
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。
其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。
同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。
多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。
外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1.超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
外泌体提取的具体步骤及方法
外泌体提取的具体步骤及方法外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。
其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。
外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。
同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。
多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。
外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。
由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。
据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：1. 超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。
脑组织提取外泌体的方法及详细步骤
组织外泌体提取的详细步骤及方法外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约30 ~ 150 nm的膜性囊泡。
几乎所有的细胞都会产生外泌体，被分泌出的外泌体会进入各种体液，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。
越来越多的研究表明神经系统中的生理功能和病理功能与外泌体密切相关，例如：参与神经发育和神经元活动，参与神经退行性疾病调控等。
相关试剂：1，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield）2，木瓜蛋白酶papain（Worthington）3，Umibio Exosome Isolation Kit4，PBS相关设备：1，匀浆器2，网状过滤器40-μm3，注射器过滤器0.2μm4，高速离心机5，涡旋振荡器操作步骤：（一）脑浆液化处理：1，将新鲜或先前冷冻的小鼠半脑切开，加入Hibernate E溶液(3 mL /半脑)；2，加入20单位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分钟；3，加入等体积预冷Hibernate E后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行；4，脑匀浆通过40-μm网状过滤器过滤；5，滤液再通过0.2-μm过滤器过滤，收集滤液；（二）液化脑浆预处理；1，离心去碎片：将液化脑浆液转移至离心管中，于4℃以3000 g离心10 min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；2，离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000 g离心20 min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中；三）脑浆外泌体的提取；通过Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌体颗粒。
1，上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS试剂），具体的加入剂量如下：注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算2，溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1 min，再放置于2℃至8℃静置2 h；3，沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）4，外泌体重悬：取100μL 1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其均匀悬浮在PBS 中后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中；5，收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。
外泌体分离方法
外泌体分离方法
外泌体是一种细胞外释放的小型膜泡，它们携带着细胞内部的蛋白质、核酸和脂质等生物分子，具有多种生物学功能。
在外泌体的研究中，分离和纯化外泌体是一个至关重要的步骤。
以下是一些常见的外泌体分离方法：
1.超速离心法：超速离心是最常用的外泌体分离方法之一。
在离心过程中，通
过多轮逐渐增加转速来沉淀外泌体，接着可以通过洗涤、纯化、再超速离心等步骤来进一步处理并纯化外泌体。
2.密度梯度离心法：密度梯度离心是另一种常用的外泌体分离方法。
通过制备
密度梯度离心液，将外泌体样品加入后进行离心操作，外泌体会随着密度梯度上浮在不同密度的离心液层中，根据分层可以得到纯化的外泌体。
3.尺寸排除色谱法：尺寸排除色谱是基于外泌体尺寸不同于其他细胞外囊泡的
原理而设计的纯化方法。
样品通过尺寸排除柱时，大于一定尺寸的细胞外突起和小于该范围的游离蛋白等被裂解产生的物质会顺着柱体流出，而外泌体则会通过柱子被保留。
该方法具有分离高效、可以同时分离不同种类的外泌体等优点。
4.免疫亲和法：利用特异性抗体驯化对外泌体的靶腐运动来分离纯化外泌体。
一般来说，在研究特定蛋白的外泌泡时使用较为常见。
各种分离方法之间有其各自的优点和限制，不同研究对需要的外泌体纯度、样品量、分析方法等可能都会有所不同，因此需要根据具体研究需求选择适合的外泌体分离方法。
植物外泌体提取方法
植物外泌体提取方法以《植物外泌体提取方法》为标题，本文将介绍植物外泌体提取方法和研究进展。
植物外泌体是植物细胞向外部释放的非编码小分子信使，它们包含蛋白质、核酸、多糖、细胞旁质、类脂多糖、脂质以及其他物质。
植物外泌体的存在可以为植物提供胁迫应答、信号通路和营养的调节，并可用作植物间的沟通器件。
随着植物外泌体研究的发展，研究人员把复杂的植物外泌体提取策略分为普通提取策略和特殊提取策略两种。
普通提取策略基本涵盖了植物外泌体常用的提取方法，主要包括冷提取和热提取两种主要方法。
冷提取方法是目前最常用的植物外泌体提取方法，其优点是操作简单，方便大批量样品的提取，而且一般不受水分含量等环境因素的影响。
热提取方法中，最常用的是双氯乙烷提取法，它具有良好的外泌体提取效率和抗菌效果，但也存在不可避免的副作用，如溶剂污染和残留毒性等。
特殊提取策略主要用于提取特定功能的外泌体，如抗氧化外泌体、保水外泌体、抗病毒外泌体等。
这些方法包括冷梯度提取、植物膜芯提取法、磁性纳米材料提取法、逆流植物外泌体提取和静吸附提取等。
这些特殊提取策略可以在很大程度上提高外泌体的提取效率和纯度，进一步研究外泌体的功能和结构。
植物外泌体的研究进展还表明，外泌体可以抗肿瘤，促进维生素吸收，抗病毒，促进植物生长，增强植物胁迫耐受性，等众多功能。
在自然界中，外泌体参与着免疫系统的调节，可以抑制和抑制病原体的生长，从而起到抗病毒和防治疾病的作用。
外泌体还可以参与植物间的信息传递，促进和调节从病原体到植物的免疫应答，它还可以增强植物对寄主病原体的抗性。
此外，外泌体也可以用于营养的调节和植物的生物防治。
外泌体可以阻断病原体的侵染，降低其繁殖，同时也可以促进植物的生长发育。
目前，已有研究表明，外泌体可以降低植物抗逆能力以及根际微生物功能。
因此，利用外泌体调节和调控植物的生长和免疫反应，可以有效地增强植物的抗病能力，促进植物的生长发育，提高植物的营养成分和产量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取
上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小
时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、
为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机
50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）
注意：所有离心均应在4℃下进行。
1.用等体积的PBS稀释液体。
将稀释的液体转移到50毫升管中。
在2,000×g，4℃下离心30分钟。
2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。
在12,000×g，4℃下离心45分钟。
3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。
在110,000×g，4℃下离心2小时。
4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。
用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。
5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。
6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。
倒出上清液。
7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。
在110,000×g，4℃下离心70分钟。
倒出上清液。
8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。
在-80℃下储存长达1年。