细胞外泌体提取方法
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取鉴定
外泌体提取鉴定1. 介绍外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞分泌的小型膜囊泡，具有重要的生物学功能。
它们主要通过胞吐（exocytosis）的方式释放到细胞外，可以携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
外泌体的提取鉴定是一项关键的研究技术，可以帮助我们了解外泌体的组成、功能以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。
2. 外泌体提取方法外泌体的提取方法有多种，常用的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排除柱法等。
2.1 超速离心法超速离心法是最常用的外泌体提取方法之一。
该方法通过多次离心步骤，逐渐提高离心速度，使外泌体沉淀。
离心步骤通常包括低速离心、高速离心和超高速离心。
低速离心一般在300g-2000g的离心力下进行，用于去除细胞碎片和大颗粒物质。
高速离心一般在10000g-20000g的离心力下进行，用于沉淀较大的外泌体。
超高速离心一般在100000g以上的离心力下进行，用于沉淀较小的外泌体。
2.2 密度梯度离心法密度梯度离心法利用外泌体与离心液中不同密度的物质在离心过程中的分层原理，实现外泌体的提取。
常用的密度梯度离心液包括葡萄糖、蔗糖和乳酸等。
离心过程中，外泌体会在离心液中沉淀到特定的密度层，然后可以通过离心收集到外泌体。
2.3 尺寸排除柱法尺寸排除柱法是一种基于外泌体粒径的提取方法。
该方法利用尺寸排除柱的特殊结构，可以将大颗粒物质和细胞碎片滞留在柱中，而将外泌体通过柱床，实现外泌体的提取。
尺寸排除柱法操作简便，提取效果较好，适用于小样本量的外泌体提取。
3. 外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括电子显微镜观察、蛋白质分析、核酸分析和功能鉴定等。
3.1 电子显微镜观察电子显微镜是观察外泌体形态和结构的重要工具。
通过电子显微镜观察，可以看到外泌体的膜结构、大小和形状等特征。
电子显微镜观察可以直观地确认提取到的颗粒是否为外泌体。
3.2 蛋白质分析蛋白质分析是外泌体鉴定的重要手段之一。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
(完整版)外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
外泌体提取步骤
外泌体提取步骤外泌体提取是一种从细胞外分泌物中分离和纯化外泌体的方法，它可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品，并对其进行进一步的分析和研究。
本文将介绍外泌体提取的步骤。
1. 细胞培养需要选择感兴趣的细胞系进行培养。
将细胞种植在培养皿中，并提供适当的培养基和条件，使细胞能够正常生长和分裂。
2. 收集细胞上清液当细胞生长到一定程度时，收集细胞上清液。
将培养皿中的培养基转移至离心管中，并使用低速离心（约300-500×g）离心10-20分钟，以去除细胞和细胞碎片。
3. 高速离心将离心后的上清液转移到新的离心管中，并使用高速离心（约10,000-20,000×g）离心30-60分钟，以沉淀外泌体。
4. 洗涤外泌体将外泌体沉淀用冷PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，以去除杂质和未结合的蛋白质。
洗涤过程中可以进行多次离心和上清液的去除。
5. 再次离心将洗涤后的外泌体沉淀用PBS再次离心，以获得更纯净的外泌体样品。
6. 纯化外泌体为了进一步提高外泌体的纯度，可以使用浓缩、超滤等方法对外泌体进行纯化处理。
这些方法可以去除残余的蛋白质和其他杂质，提高外泌体的纯度和浓度。
7. 确认外泌体使用电子显微镜观察外泌体的形态和结构，确认提取到的颗粒为外泌体。
此外，还可以使用Western blot、质谱等技术对外泌体进行进一步的鉴定和验证。
8. 外泌体的应用提取到的外泌体可以用于进一步的研究和应用。
外泌体中包含了丰富的蛋白质、核酸、脂质等生物分子，可以用于疾病诊断、药物传递、基因治疗等领域。
总结：外泌体提取是一种重要的实验操作，可以帮助研究人员获取纯净的外泌体样品。
通过细胞培养、离心、洗涤和纯化等步骤，可以从细胞上清液中分离和纯化外泌体。
外泌体提取的纯度和质量对于后续的研究和应用至关重要。
外泌体的提取和研究有望在生物医学研究中发挥重要作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体（extracellular vesicle，EVs）是一类广泛存在于体液中的细胞外小囊泡，它们由细胞释放并包裹着细胞膜，可携带细胞成分如蛋白质、核酸、脂质等，具有重要的生物学功能。
因此，外泌体提取方法的研究和比较对于深入了解和应用外泌体具有重要意义。
目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、凝胶过滤法、免疫亲和法、磁珠法和化学法等，下面将对这些常用的方法进行比较。
超速离心法是提取外泌体最常用的方法之一，其主要步骤包括差速离心和超速离心。
由于外泌体的大小范围相对较小（30-150 nm），因此要通过不同的转速和不同的时间对样品进行逐步的离心，以获得纯化的外泌体。
超速离心法的优点是提取到的外泌体数量较多，但存在一定的缺点，如操作复杂、时间长、成本高以及无法彻底除去离心的其他细胞碎片。
凝胶过滤法是利用凝胶纤维通过外泌体的大小选择性提取外泌体。
它的优点是简单易行，不需要专门的设备和耗材，但提取到的外泌体数量较少，可能存在一定的纯度问题。
免疫亲和法是通过特异性抗体与特定外泌体表面标志物的结合，利用磁珠等载体进行外泌体的提取。
免疫亲和法的优点是操作简单、提取到的外泌体纯度较高，但需要进行专门的抗体标记和染色，成本较高。
磁珠法是利用具有亲和性的磁性材料提取外泌体。
这种方法具有操作简单、纯度较高的优点，但对于部分磁性材料的购买和使用有一定的限制。
化学法主要是利用有机溶剂和离子液体等化学方法来提取外泌体。
这种方法相对较新，属于非常规的提取方法之一、虽然其操作简便，但由于存在一定的化学毒性和对溶剂残留的担忧，目前该方法的应用还相对较少。
总的来说，不同的外泌体提取方法各有优缺点，具体选择哪一种方法需要根据实际需求进行评估。
超速离心法、凝胶过滤法和免疫亲和法是目前应用较广泛的方法，它们在纯度、操作简便和提取效率等方面各有优劣。
未来的研究可以探索新的、更高效的提取方法，以满足外泌体研究的不断需求。
一种分离和纯化外泌体的方法
一种分离和纯化外泌体的方法分离和纯化外泌体是一项重要的生物学技术，用于从生物样本中获取纯净的外泌体颗粒。
外泌体是一类小型细胞分泌泡，内含有丰富的生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质。
它们在细胞间传递信号、调节细胞功能以及参与疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。
因此，研究外泌体对于了解细胞通讯机制和疾病生理过程具有重要意义。
常用的外泌体分离和纯化方法包括超速离心、滤膜法、密度梯度离心、免疫亲和法和尺寸排除层析法等。
下面将逐一介绍这些方法的原理和步骤。
超速离心法是最常用的外泌体分离方法之一。
首先，将细胞培养液或生物体液进行低速离心，去除细胞碎片和大颗粒物质。
然后，将上清液进行高速离心，使外泌体沉淀于离心管底部。
最后，将上清液弃去，用适当缓冲液悬浮沉淀物，即可获得外泌体。
滤膜法是一种简单而高效的外泌体分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一系列孔径大小不同的滤膜，通过筛选的方式分离外泌体颗粒。
常用的滤膜孔径为0.1-0.8微米，可以选择不同孔径的滤膜进行连续过滤，以获得更纯净的外泌体。
密度梯度离心法基于外泌体与溶液密度不同的原理进行分离。
首先，制备一系列密度逐渐增大的梯度离心液。
然后，将细胞培养液或生物体液加入离心管中，通过离心使外泌体在不同密度梯度处分层。
最后，根据外泌体沉淀的位置，分离出目标外泌体。
免疫亲和法利用外泌体表面特定分子与抗体的特异性结合进行分离。
首先，将细胞培养液或生物体液与特定抗体结合，形成免疫复合物。
然后，使用磁珠或琼脂糖等材料将免疫复合物捕获，再通过磁力或离心将目标外泌体分离出来。
尺寸排除层析法是一种基于外泌体颗粒尺寸差异的分离方法。
将细胞培养液或生物体液通过一列具有特定孔径的柱子，较大的细胞碎片和颗粒物质会被柱子内部的填料所阻挡，而较小的外泌体则能够通过填料，被分离出来。
在进行外泌体分离和纯化的过程中，为了提高纯度和产量，常常需要采用多种方法的组合。
例如，可以先利用超速离心法去除大颗粒物质，然后再使用滤膜法或密度梯度离心法进一步纯化外泌体。
外泌体正规操作方法
外泌体正规操作方法
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一类具有膜包裹的细胞外体，可以通过分泌进入细胞外液。
以下是外泌体的正规操作方法：
1. 细胞培养和外泌体收集：
- 选择适合外泌体比较丰富的细胞系，如癌细胞系等。
- 使用含有足够营养物质的培养基进行培养，在细胞生长到80-90%的密度时进行收集外泌体。
2. 细胞外泌体的分离和富集：
- 低速离心：对细胞上清和培养基进行低速离心，将细胞碎片和大颗粒物质沉淀。
- 高速离心：将低速离心上清进行高速离心，以沉淀分离出外泌体。
- 滤膜过滤：可以使用0.2至0.8微米的滤膜，通过滤膜将外泌体分离出来。
3. 外泌体的纯化和浓缩：
- 过滤：使用0.2至0.45微米的滤膜，将外泌体悬液过滤以去除细胞碎片和大颗粒物质，得到纯化的外泌体。
- 超速离心：将外泌体悬液进行超速离心，将外泌体沉淀。
- 液氮冷冻：将外泌体悬液进行液氮冻结保存，以便后续分析或实验操作。
4. 外泌体的鉴定和表征：
- 电镜观察：使用透射电子显微镜观察外泌体形态和结构。
- 免疫学鉴定：使用外泌体表面标记物的抗体进行免疫学检测，如CD63、CD81等。
- 蛋白质分析：使用质谱分析等方法对外泌体中的蛋白质进行分析。
需要注意的是，在操作过程中应避免外泌体的污染和损伤，同时应遵循生物安全操作规范。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
外泌体提取和鉴定
外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。
外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。
超速离心法是外泌体提取的经典方法。
其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。
这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。
但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。
超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。
通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。
这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。
免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。
这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。
沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。
该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。
在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。
如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。
提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。
外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。
形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。
通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。
粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。
NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
(完整版)外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
【干货分享】外泌体提取的3种超速离心方法（内含赠书福利）
献中具体的各阶段离⼼⼒和时间⼤同⼩异，主要可以参考参考⽂献1。
超速离⼼提取外泌体流程⽰意图可见进阶版中的第1-5步。
基于蔗糖垫的超速离⼼如果对外泌体的纯度要求较⾼，但⼜不想做密度梯度离⼼那么⿇烦，⼤家可以⽤基于蔗糖垫的超速离⼼⽅法。
这⾥以提取细胞上清中外泌体为例，给⼤家详细提供⼀个protocol蔗糖垫⽰意图新鲜收集细胞上清，以300 g、4度、离⼼10 min，去除细胞、死细胞，离⼼后取上清；10 min，去除细胞碎⽚，离⼼后取上清；注：常有⼩伙伴问细胞上清不能及时处理，该怎么保存。
此步骤后的上清可于提取外泌体为佳；若需长期保存，可冻存于-80度，解冻时4度慢融。
切记不经⼀⼆步离⼼去除细胞、死细胞、细胞碎⽚就直接保存，会严重影响后⾯提取的外泌体的组分。
度、离⼼30 min，去除⼤膜泡，离⼼后取上清；就在于密度梯度怎么弄了。
碘克沙醇密度梯度离⼼⼯作流程⽰意图密度梯度的制作⽬前主要利⽤蔗糖或者碘克沙醇（iodixanol）。
以碘克沙醇为例，可以买到OptiPrep density gradient medium，按照40%、20%、10%、5%配好，⼩⼼依次铺到离⼼管中，最上层加浓缩的细胞上清或⾎浆/清。
在5-10-20-40%碘克沙醇密度梯度中，外泌体主要富集在第6、7个fractions中有⼩伙伴会对⽤什么类型转⼦有疑问。
超速离⼼常⽤两种转⼦：⽔平转⼦和固定⾓转⼦。
⽔平转⼦也叫⽔平转头（如下图左）。
在离⼼过程中，离⼼管与轴之间的⾓度从开始 0°变成⽔平转⼦90°，停⽌时⼜成为0°。
固定⾓转⼦也叫定⾓转⼦、定⾓转头（如下图右）。
在离⼼过程中，离⼼管与轴之间的⾓度是固固定⾓转⼦定的，通常在20°到45°之间。
离⼼时，样品会⾸先沉淀到离⼼管侧壁，然后下滑⾄离⼼管的外侧底部聚集。
⽔平转⼦（左）与定⾓转⼦（右）这2种转⼦区别，⼤家看下⾯的图解就明⽩了。
所以，普通超速离⼼既可以⽤定⾓转⼦也可以⽤⽔平转⼦，如果离⼼管透明度不⾼，定⾓的离⼼最后沉淀在管底的侧⾯，有易于观察的优势（外泌体量多可⾁眼观察时）；但是主要还是看个⼈习惯。
外泌体分离方法
外泌体分离方法
外泌体是一种细胞外释放的小型膜泡，它们携带着细胞内部的蛋白质、核酸和脂质等生物分子，具有多种生物学功能。
在外泌体的研究中，分离和纯化外泌体是一个至关重要的步骤。
以下是一些常见的外泌体分离方法：
1.超速离心法：超速离心是最常用的外泌体分离方法之一。
在离心过程中，通
过多轮逐渐增加转速来沉淀外泌体，接着可以通过洗涤、纯化、再超速离心等步骤来进一步处理并纯化外泌体。
2.密度梯度离心法：密度梯度离心是另一种常用的外泌体分离方法。
通过制备
密度梯度离心液，将外泌体样品加入后进行离心操作，外泌体会随着密度梯度上浮在不同密度的离心液层中，根据分层可以得到纯化的外泌体。
3.尺寸排除色谱法：尺寸排除色谱是基于外泌体尺寸不同于其他细胞外囊泡的
原理而设计的纯化方法。
样品通过尺寸排除柱时，大于一定尺寸的细胞外突起和小于该范围的游离蛋白等被裂解产生的物质会顺着柱体流出，而外泌体则会通过柱子被保留。
该方法具有分离高效、可以同时分离不同种类的外泌体等优点。
4.免疫亲和法：利用特异性抗体驯化对外泌体的靶腐运动来分离纯化外泌体。
一般来说，在研究特定蛋白的外泌泡时使用较为常见。
各种分离方法之间有其各自的优点和限制，不同研究对需要的外泌体纯度、样品量、分析方法等可能都会有所不同，因此需要根据具体研究需求选择适合的外泌体分离方法。
peg提取外泌体原理
peg提取外泌体原理
外泌体是一类由细胞中分泌的小囊泡组成的细胞外泡泡，它们在细胞间传递信号、调节细胞功能并参与许多生物学过程中起着重要的作用。
PEG（聚乙二醇）提取外泌体的原理是利用PEG对外泌体的特殊亲和力，将其与外泌体相互结合，然
后通过离心等方式将外泌体与其他成分分离。
PEG提取外泌体的步骤可以简要概括如下：
1.准备样品：首先，我们需要获得含有外泌体的细胞培养液或体液样品。
这个
样品可以是细胞培养基中的上清液、血浆、尿液等。
2.预处理样品：为了去除残留的细胞碎片、蛋白质和其他物质，我们首先对样
品进行预处理。
这可以通过离心将样品离心来去除大颗粒物质，然后用滤膜过滤以去除更小的颗粒物质。
3.PEG结合：将样品与一定浓度的PEG混合，并在适当的温度条件下进行搅拌。
PEG与外泌体之间存在特殊的相互作用力，使得它们结合在一起形成复合物。
4.离心：将PEG和外泌体的复合物通过离心的方式分离出来。
通过调整离心的
速度和时间，我们可以获得不同大小和浓度的外泌体颗粒。
5.洗涤：为了去除与复合物中的PEG残留物，我们可以使用缓冲液对复合物进
行洗涤。
这可以通过多次离心的方式进行。
6.最后抗凝固洗涤：在洗涤过程中可以添加抗凝固剂，以防止外泌体在洗涤过
程中的凝聚。
通过以上步骤，我们可以有效地从样本中提取外泌体。
PEG提取外泌体的方法
简单、高效，并且可以得到高纯度的外泌体颗粒。
这为研究外泌体的组成、功能和生物学机制提供了重要工具和平台。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。
外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。
一、超速离心法。
超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。
最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。
二、超滤法。
超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。
最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。
三、沉淀法。
沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。
最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。
四、免疫磁珠法。
免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。
最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。
以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。
希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。
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外泌体提取详细步骤及方法
1、差速离心
差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体：
300×g离心10分钟，取上清。
2000×g离心10分钟，取上清。
10，000×g离心30分钟，取上清。
100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。
2、密度梯度离心
该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。
因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。
但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
3、尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。
该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。
尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。
此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。
与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。
目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。
不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。
4、过滤
超滤膜也可用于分离外泌体。
根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。
最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。
5、基于聚合物的沉淀技术
基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。
用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。
用
这种聚合物沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。
目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法。
然而基于聚合物的沉淀方法可能会同时分离非囊泡污染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混杂可能会影响下游分析。
6、免疫分离技术
免疫分离外泌体的原理大多是通过抗体包被的微球，特异性结合外泌体。
例如使用抗肿瘤相关HER2和EpCAM的抗体从肿瘤细胞中分离出肿瘤来源的外泌体。
然而，使用抗体包被珠子的分离不适合从大量样本中获得外泌体。
还有将抗体包被于ELISA中的那种板上面，直接分离后检测、分析、定量。
最近的一项研究已应用免疫亲和超顺磁性纳米粒子（ISPN）来结合外泌体，研究人员通过连接抗CD63抗体和纳米粒子生成ISPN，并用它们从体液中分离外泌体。
7、通过筛分分离
该技术利用压力或电场，通过膜从样本中筛出外泌体：该方法分离时间短，可以提供较高纯度的外泌体。
但是回收率低。