外泌体提取方法总结
外泌体提取的方法
外泌体提取的方法外泌体是一种小型的胞外囊泡，它们由细胞释放出来，带有许多生物分子，如蛋白质、RNA和DNA等。
这些外泌体在很多生物体中都被发现，包括植物、动物和微生物等，而研究它们已经成为了一个热门课题。
因此，外泌体提取方法的研究也愈发重要。
1. 已有的外泌体提取方法目前已经开发出了几种外泌体提取方法，包括差速离心、密度梯度离心和超滤等。
这些方法每一种都有其优点和限制。
下面将分别介绍这三种方法。
差速离心法这是当前最常用的外泌体提取方法。
差速离心法利用一个多步骤的过滤和离心过程来提取外泌体。
此方法通过圆盘刷子离心除去大的细胞残留和细胞碎片，然后再通过速度梯度离心 Pellet 小径的微粒（包括外泌体）。
最终，被Pellet收集的微粒经过洗涤和再次离心以获得纯化的外泌体。
但这种方法也存在一些问题。
例如：外泌体含量极小，容易堵塞过滤器，处理时间也较长等。
密度梯度离心法这种方法是通过使用梯度浓度离心的离心管来纯化和分离外泌体。
这种方法可以强制微粒沉降到其密度梯度离心中与之匹配的密度位置。
密度高的梯度位置收集纯化的外泌体。
但是，密度梯度离心法也存在一些限制，由于梯度的浓度特性，产生相当多的上清液需要处理。
超滤法超滤法可以使用聚酰胺膜筛，把自然和添加的物质、基质等从水或反向微乳液中移除。
超滤法是一种最新的外泌体提取方法。
此方法是通过微孔膜以外泌体大小排除液体中的大分子物质，而留下外泌体和其他小分子在膜上。
最后，外泌体可以从膜上收集。
但是此方法也存在缺陷，需要更昂贵的设备，如超滤膜和超滤器等。
2. 未来发展方向虽然以上方法都有其优点和缺陷，但随着技术的发展和研究的深入，可能会出现新的外泌体提取方法，以更快捷、更准确、更方便的方式提取外泌体。
例如，利用氮氧化物处理方法，可以在不使用离心机和过滤器的情况下，快速提取外泌体。
这种方法可以在较少的研究时间内提取足够数量的外泌体。
随着技术的不断发展，人们希望设计出更加高效的方法，以便更好地应用于外泌体的研究中，更广泛地使用这些方法，并更好地理解外泌体的分子机制。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一种细胞分泌的小囊泡，它们在细胞间传递信息，参与调控细胞的生理活动，对于细胞间的相互作用和信号传导起着重要的作用。
因此，外泌体的提取方法对于细胞生物学和临床医学研究具有重要意义。
下面将介绍几种常用的外泌体提取方法。
1. 超速离心法。
超速离心法是目前常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液进行低速离心，去除细胞残渣和细胞碎片，然后将上清液进行高速离心，将外泌体沉淀下来。
最后，用洗涤液洗涤沉淀物，得到纯净的外泌体。
这种方法操作简单，提取效率高，适用于大规模提取外泌体。
2. 超滤法。
超滤法是利用超滤膜对细胞培养液进行过滤，将外泌体从培养液中分离出来。
这种方法不需要离心步骤，操作简便，适用于小规模外泌体提取。
但是需要注意的是，选择合适的超滤膜孔径和分子量截留率，以确保外泌体能够有效地被提取出来。
3. 密度梯度离心法。
密度梯度离心法是利用不同密度的梯度液体将外泌体与其他细胞成分分离开来。
首先，将细胞培养液加入密度梯度离心管中，然后进行超速离心，外泌体会沉淀在不同密度的梯度液体中。
通过调整离心参数，可以将外泌体从其他细胞成分中有效地提取出来。
这种方法提取的外泌体纯度较高，适用于对外泌体纯度要求较高的实验。
4. 免疫亲和法。
免疫亲和法是利用外泌体表面蛋白与特定抗体的结合来提取外泌体。
首先，将抗体固定在亲和树脂上，然后将细胞培养液与亲和树脂进行免疫反应，外泌体会与抗体结合，然后通过洗涤等步骤将外泌体从亲和树脂上提取出来。
这种方法可以选择特定的外泌体蛋白进行提取，适用于对外泌体特定蛋白的研究。
总结。
外泌体的提取方法多种多样，可以根据实验的需要选择合适的方法。
在进行外泌体提取时，需要注意操作规范，避免外泌体的污染和损失。
同时，根据实验要求选择合适的提取方法，可以提高外泌体的提取效率和纯度，为后续的实验研究提供可靠的样品。
希望以上介绍的外泌体提取方法能够对您的研究工作有所帮助。
外泌体提取鉴定
外泌体提取鉴定1. 介绍外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞分泌的小型膜囊泡，具有重要的生物学功能。
它们主要通过胞吐（exocytosis）的方式释放到细胞外，可以携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。
外泌体的提取鉴定是一项关键的研究技术，可以帮助我们了解外泌体的组成、功能以及其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。
2. 外泌体提取方法外泌体的提取方法有多种，常用的方法包括超速离心法、密度梯度离心法、尺寸排除柱法等。
2.1 超速离心法超速离心法是最常用的外泌体提取方法之一。
该方法通过多次离心步骤，逐渐提高离心速度，使外泌体沉淀。
离心步骤通常包括低速离心、高速离心和超高速离心。
低速离心一般在300g-2000g的离心力下进行，用于去除细胞碎片和大颗粒物质。
高速离心一般在10000g-20000g的离心力下进行，用于沉淀较大的外泌体。
超高速离心一般在100000g以上的离心力下进行，用于沉淀较小的外泌体。
2.2 密度梯度离心法密度梯度离心法利用外泌体与离心液中不同密度的物质在离心过程中的分层原理，实现外泌体的提取。
常用的密度梯度离心液包括葡萄糖、蔗糖和乳酸等。
离心过程中，外泌体会在离心液中沉淀到特定的密度层，然后可以通过离心收集到外泌体。
2.3 尺寸排除柱法尺寸排除柱法是一种基于外泌体粒径的提取方法。
该方法利用尺寸排除柱的特殊结构，可以将大颗粒物质和细胞碎片滞留在柱中，而将外泌体通过柱床，实现外泌体的提取。
尺寸排除柱法操作简便，提取效果较好，适用于小样本量的外泌体提取。
3. 外泌体鉴定方法外泌体的鉴定方法主要包括电子显微镜观察、蛋白质分析、核酸分析和功能鉴定等。
3.1 电子显微镜观察电子显微镜是观察外泌体形态和结构的重要工具。
通过电子显微镜观察，可以看到外泌体的膜结构、大小和形状等特征。
电子显微镜观察可以直观地确认提取到的颗粒是否为外泌体。
3.2 蛋白质分析蛋白质分析是外泌体鉴定的重要手段之一。
外泌体提取方法小结
外泌体提取方法小结随着近几年大家对外泌体的认识和了解，外泌体吸引了诸多科学家的注意力，因其能够为癌症早期诊断和治疗提供有意义的生物标记物。
那么对于研究外泌体的科学家来说，第一步，提取外泌体至关重要，今天我们分享一篇关于外泌体的提取方法到底对后续研究有什么影响？是否能给在做外泌体研究的你带来一些帮助。
这些年我们一起提取过的外泌体！外泌体通常是30-120纳米的微小膜泡，具有脂质双分子结构，来自于几乎所有正常细胞和肿瘤细胞中多泡体（MVB）的管腔膜，它们被认为通过从原始细胞中装载蛋白质、代谢物和核酸（mRNA，miRNA）等物质，参与细胞之间的交流。
这些蛋白质、代谢物和核酸（mRNA，miRNA）可以在与细胞膜融合后释放到细胞外间隙。
外泌体上可以检测到许多细胞表面膜蛋白，其中一些可用于癌症的早期检测、诊断和预后。
常用的外泌体分离方法是超速离心，这种方法非常耗时耗力且需要一台超速离心机。
例如还有其他的一些方法，免疫亲和，超滤法，化学聚合沉降法和凝胶过滤层析（size-exclusion chromatography，SEC）。
SEC是一种分离血液蛋白质中外泌体的理想方法。
尽管有报道说这种过滤层析的方法本身有最低的外泌体载量的限制，但是SEC还是被广泛应用于临床样本的分析。
Table：外泌体的提取方法比较血液样本外泌体我该如何选方法？此研究中比较了3种分离方法，第一种包括使用多次超速离心的方法（UC方法），第二种方法商业qEV凝胶过滤层析柱，第三种方法也是120分钟的超速离心+qEV凝胶过滤层析柱过滤。
在使用层析过滤（SEC）这种方法时，每个SEC柱子过滤0.5mL 的稀释血清，每个组分的洗脱液（0.5mL）被收集起来，然后每个组分中的蛋白通过使用BCA法测浓度，发现第9和第10次洗脱下来的蛋白与前面第8次的量多出很多。
如下图统计图所示。
另外，通过投射电子显微镜发现3种方法从人血清中分离的外泌体具有相近的形态学和相似的大小分布。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体是一种细胞外膜囊泡，通过一系列特殊的细胞分泌机制，从宿主细胞中释放出来。
外泌体中富含多种生物活性分子，如蛋白质、核酸、脂质和代谢产物等，对细胞间信息传递、免疫反应、炎症调节等生理和病理过程具有重要作用。
因此，外泌体的提取和分离成为研究其功能和应用的重要步骤。
目前常用的外泌体提取方法包括差速离心、超滤、密度梯度离心、覆膜及抗体磁珠法等。
以下将对这些方法的原理、优缺点进行详细介绍。
1.差速离心法：差速离心是一种简单且常用的外泌体提取方法。
它是通过逐步增加离心力，将细胞碎片和大颗粒物质从上清液中分离出来，最后得到外泌体的方法。
优点是操作简单、效果可靠，适用于大规模外泌体提取。
缺点是纯度较低，提取得到的外泌体中可能夹杂有其他细胞碎片和蛋白质聚集体。
2. 超滤法：超滤法是利用滤膜孔径选择性筛选颗粒物质的方法。
通常使用滤孔直径为20-100 nm的滤膜进行过滤，将大颗粒物质和细菌滤出，实现外泌体的提取。
优点是简便快速，可以得到较高纯度的外泌体。
缺点是容易因滤膜堵塞导致提取效果不佳，并且只能得到一部分外泌体。
3.密度梯度离心法：密度梯度离心法是根据物质密度的差异进行分离的方法。
通常使用等体积或等体积百分比的梯度溶液（如葡萄糖或蔗糖）进行离心，不同密度的物质会在梯度中分层沉淀。
外泌体的密度较低，往往在低密度梯度中聚集。
优点是可以分离得到高纯度的外泌体，并且可以细致分离不同类型的外泌体。
缺点是操作复杂，耗时较长。
4.覆膜法：覆膜法是指通过将培养基中的细胞和碎片离心去除后，直接在细胞上清液上方加入覆盖材料（如覆膜、多孔膜等），使外泌体通过覆盖材料进入上清液的方法。
优点是操作简单，不需要额外的离心步骤。
缺点是提取得到的外泌体纯度较低，可能夹杂有其他颗粒物质。
5.抗体磁珠法：抗体磁珠法是利用表面覆盖特定抗体的磁性微珠，通过与外泌体表面标记物质的特异性结合来实现外泌体的提取。
优点是提取效果稳定，纯度较高，可以选择性地提取一些类型的外泌体。
外泌体提取方法
外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。
外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。
一、超速离心法。
超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。
最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。
二、超滤法。
超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。
最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。
三、沉淀法。
沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。
最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。
四、免疫磁珠法。
免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。
首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。
然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。
最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。
以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。
希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。
脂肪组织 外泌体提取方法
脂肪组织外泌体提取方法1、差速离心差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。
该方法包括几个步骤，包括1）低速离心去除细胞和凋亡碎片，2）更高速离心以消除更大的囊泡，最后，3）高速离心沉淀外泌体：不过需要注意的是，样本的粘度与分离的外泌体纯度有显著的相关性，因此，具有高粘度的生物样品（例如血浆和血清样本）需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。
步骤：以300×g离心10分钟，取上清。
以2000×g离心10分钟，取上清。
10,000×g离心30分钟，取上清。
100,000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100,000×g离心90分钟。
2、密度梯度离心该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。
因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。
但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。
2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、纯度更高，并且结构和功能保持更好。
3、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。
该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。
尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。
此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。
与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。
目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。
不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。
4、过滤超滤膜也可用于分离外泌体。
根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。
一种外泌体的提取方法及其应用与流程
一种外泌体的提取方法及其应用与流程一、引言外泌体是一种存在于细胞外液中的小颗粒，其直径一般在30-150纳米之间。
外泌体中富含蛋白质、核酸、脂质等生物分子，具有广泛的生物学功能。
近年来，外泌体的提取方法及其应用得到了广泛关注。
本文将介绍一种常用的外泌体提取方法，并探讨其在生物医学研究中的应用与流程。
二、外泌体提取方法目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、滤膜法、沉淀法和免疫亲和法等。
其中，超速离心法是最常用的方法之一。
其主要步骤如下：1. 收集细胞培养上清液或生物体体液，如血浆、尿液等。
2. 进行一系列离心步骤，以去除细胞碎片和大颗粒物质。
一般先进行低速离心，去除大颗粒物质，然后再进行高速离心，沉淀外泌体。
3. 分离外泌体。
将高速离心上清液转移到新离心管中，再次进行超高速离心，将外泌体沉淀下来。
4. 去除上清液，将外泌体沉淀悬浮于适当的缓冲液中。
三、外泌体的应用与流程外泌体作为一种新型的细胞间通讯介质，具有广泛的应用前景。
下面将介绍其在生物医学研究中的应用与流程。
1. 生物标志物的发现与应用外泌体中含有丰富的蛋白质和核酸等生物分子，这些分子的组成和含量可以反映细胞的生理状态和病理变化。
因此，外泌体被广泛应用于生物标志物的发现与应用。
研究人员可以通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，来寻找与特定疾病相关的生物标志物，从而实现早期诊断和治疗监测。
2. 药物传递系统的研究与应用外泌体具有天然的包裹和传递生物分子的能力，因此被广泛应用于药物传递系统的研究。
研究人员可以将药物封装在外泌体中，并通过改变外泌体的表面性质，实现药物的靶向输送和释放。
这种外泌体作为药物传递系统的方法具有较高的稳定性和生物相容性，对于治疗肿瘤等疾病具有潜在的应用价值。
3. 疾病机制的研究与探索外泌体中富含的生物分子可以提供重要的疾病机制信息。
通过分析外泌体中的蛋白质和核酸的组成，研究人员可以了解疾病发生发展的分子机制，从而为疾病的治疗和预防提供新的思路和靶点。
(完整版)外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
外泌体提取方法比较
外泌体提取方法比较外泌体（extracellular vesicle，EVs）是一类广泛存在于体液中的细胞外小囊泡，它们由细胞释放并包裹着细胞膜，可携带细胞成分如蛋白质、核酸、脂质等，具有重要的生物学功能。
因此，外泌体提取方法的研究和比较对于深入了解和应用外泌体具有重要意义。
目前常用的外泌体提取方法主要包括超速离心法、凝胶过滤法、免疫亲和法、磁珠法和化学法等，下面将对这些常用的方法进行比较。
超速离心法是提取外泌体最常用的方法之一，其主要步骤包括差速离心和超速离心。
由于外泌体的大小范围相对较小（30-150 nm），因此要通过不同的转速和不同的时间对样品进行逐步的离心，以获得纯化的外泌体。
超速离心法的优点是提取到的外泌体数量较多，但存在一定的缺点，如操作复杂、时间长、成本高以及无法彻底除去离心的其他细胞碎片。
凝胶过滤法是利用凝胶纤维通过外泌体的大小选择性提取外泌体。
它的优点是简单易行，不需要专门的设备和耗材，但提取到的外泌体数量较少，可能存在一定的纯度问题。
免疫亲和法是通过特异性抗体与特定外泌体表面标志物的结合，利用磁珠等载体进行外泌体的提取。
免疫亲和法的优点是操作简单、提取到的外泌体纯度较高，但需要进行专门的抗体标记和染色，成本较高。
磁珠法是利用具有亲和性的磁性材料提取外泌体。
这种方法具有操作简单、纯度较高的优点，但对于部分磁性材料的购买和使用有一定的限制。
化学法主要是利用有机溶剂和离子液体等化学方法来提取外泌体。
这种方法相对较新，属于非常规的提取方法之一、虽然其操作简便，但由于存在一定的化学毒性和对溶剂残留的担忧，目前该方法的应用还相对较少。
总的来说，不同的外泌体提取方法各有优缺点，具体选择哪一种方法需要根据实际需求进行评估。
超速离心法、凝胶过滤法和免疫亲和法是目前应用较广泛的方法，它们在纯度、操作简便和提取效率等方面各有优劣。
未来的研究可以探索新的、更高效的提取方法，以满足外泌体研究的不断需求。
外泌体提取
外泌体提取
Exosome 分离需知注意： 分离 exosome 前的样品不能加入任何 RNA 保护剂（如 Trizol，RNA later）；已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察， 只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。 1. 血清样品（不能加抗凝剂） （1）干燥管采血后，轻轻将全血滴入洁净的 EP 管或者离心管； （2）4 度下静置 3~4 小时，可见血块析出（也可放置 4 度冰箱过夜）； （3）5000 rpm，4 度离心 10min，可见淡黄色血清，取出上清后可再 3000rpm 4度离心 10min，以最大程度保证血清质量。 （4）将血清分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 2. 血浆样品(不能用肝素抗凝) 1) 用采血针和抗凝管（含 EDTA）抽取全血，混匀； 2) 4 度下静置 3~4 小时（也可放置 4 度冰箱过夜），5000 rpm，4 度离心 5min，取上清即为血浆； 3) 可将血浆分装，送样前可冻存于-80 度。 提示：一般高通量测序或者蛋白质组学需要 4mL （全血10ml）以上 3. 细胞上清需要提前预备的实验材料：去除 exosome 的血清（自己制备或购买） 1) 培养皿的细胞汇合率达到 80%~90%时； 2) 把原有培养基吸掉，加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）进行消化； 3) 细胞变圆后加入等体积的含正常血清培养基终止消化； 4) 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来； 5) 1100rpm，离心 5 分钟； 6) 吸掉上清液，用无 exosome 血清的培养基清洗细胞一次； 7) 1100rpm，离心 5 分钟； 8) 吸掉上清液，加入无 exosome 血清的培养基，悬浮细胞； 9) 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中（ 收集上清时细胞汇合率为60%~80%），继续培养； 10) 培养 48h~72h 后，收集细胞上清； 11) 2000 rpm，离心 10min，然后 10000 rpm, 离心 30min, 去除细胞或者细胞碎片，取上清即可。
血清外泌体提取方法(一)
血清外泌体提取方法(一)血清外泌体提取方法1. 超速离心法•使用超速离心机将血清样本离心，离心速度一般在10,000 g以上。
•离心后，将上清液转移到新的离心管中，避免沉淀物的干扰。
2. 滤膜法•将血清样本通过0.22微米的滤膜过滤器进行过滤，以去除大部分细胞和碎片。
•过滤后的上清液就是富含外泌体的样本，可以用于进一步提取和研究。
3. 差速离心法•使用差速离心机，先进行低速离心，去除大部分细胞和碎片。
•然后将上清液转移到新的离心管中，进行高速离心，富集外泌体。
•最后将上清液转移至新的离心管中，以去除杂质，得到纯净的外泌体样本。
4. 密度梯度离心法•制备不同密度梯度的离心液，将血清样本与离心液混合。
•使用超速离心机进行离心，外泌体会在不同密度梯度的离心液层中分布。
•取出目标密度层中的外泌体，进行后续研究。
5. 抗体亲和法•利用特定的抗体对外泌体表面的蛋白进行识别和结合。
•通过结合特定的抗体，可以将外泌体与其他细胞碎片和蛋白质区分开来。
•进一步使用离心等方法，将外泌体富集提取。
6. 生物素链霉亲和法•将生物素链霉素与其他蛋白结合，并加入血清样本中。
•生物素链霉素会特异性地结合外泌体表面上的生物素结合受体。
•利用生物素链霉素的亲和性，将外泌体富集提取出来。
7. 电泳法•使用凝胶电泳将血清样本进行分离。
•外泌体会在凝胶中迁移，形成独特的带状图案。
•通过裁剪目标带进行提取和研究。
以上是一些常用的血清外泌体提取方法，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择方法时，需要根据实验目的和具体情况进行综合考虑。
8. 静电荧光法•利用外泌体表面的电荷性质，通过静电作用将外泌体富集提取。
•常用的静电荧光染料有山萸苷、草酸黄等，可与外泌体表面的负电荷相互吸引。
•通过荧光信号的增强，可以富集和检测外泌体。
9. 残余血小板法•血浆中存在大量的残余血小板，这些血小板上富集有很多外泌体。
•使用低速离心法去除大部分细胞和碎片后，对残余血小板进行高速离心，获取外泌体样本。
血清外泌体提取方法
血清外泌体提取方法血清外泌体（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的一类小型膜囊泡，内含丰富的蛋白质、核酸和代谢产物，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
为了从血清中提取血清外泌体，以下是十种常用的方法，并对每种方法进行详细描述：1. 超速离心法：将血清进行低速离心，去除细胞碎片和大的膜囊泡，然后再将上清液进行高速离心，获得血清外泌体。
2. 密度梯度离心法：将血清样品与密度梯度溶液混合，进行离心，血清外泌体会分布在不同密度的梯度区域，然后可以分层收集血清外泌体。
3. 尺寸排除色谱法：使用尺寸排除色谱柱来分离血清外泌体，根据外泌体的大小，使得外泌体能够通过或滞留在柱上，然后收集滞留在柱上的外泌体。
4. 抗体磁珠法：使用特定外泌体表面标记的抗体磁珠，在血清中捕获外泌体，并通过磁力分离的方法将外泌体与其他成分分离。
5. 商业试剂盒法：市面上有很多专门用于提取血清外泌体的商业试剂盒，这些试剂盒通常包含了提取和富集外泌体的试剂和相关操作步骤。
6. 过滤法：使用不同孔径的滤膜，将血清进行过滤，外泌体会在滤膜上滞留，然后收集滞留的外泌体。
7. 微流控芯片法：使用微流控芯片，通过微流体的操控来分离和富集外泌体。
8. 电泳法：将血清样品进行电泳，根据外泌体的电荷和尺寸差异，使其在电泳过程中迁移，并在特定位置收集外泌体。
9. 裂解法：以裂解细胞膜的方法来释放细胞内外泌体，然后通过离心等方法来获得纯净的血清外泌体。
10. 光学方法：利用光学原理和技术，如光操控、光拉曼等，来分离和富集外泌体。
这些方法各有优劣，选择哪种方法取决于实验室的具体需求和仪器设备的可用性。
提取血清外泌体的方法也是一个不断发展和改进的领域，未来可能会出现更多的提取方法和技术。
（完整版）外泌体提取方法总结
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×ｇ离心10 min，吸取上清液，然后 2 000×ｇ离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×ｇ超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在 1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×ｇ离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×ｇ离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×ｇ保持30分钟，然后以200,000×ｇ进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μｍ注射器过滤器过滤，并以200,000×ｇ离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°Ｃ下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表 3.22） 0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。
最常用的外泌体提取方法
最常用的外泌体提取方法外泌体作为近几年来的研究热点，受到了科研工作者的青睐及追捧。
由于外泌体内携带有大量的miRNA, 少量lncRNA,Mrna 以及DNA蛋白质成为液体活检的潜力无限的研究对相。
所以，获得纯度高、内容物完整的外泌体非常之重要，那么，外泌体的提取方法也显得尤为重要。
一、差速离心法差速离心法可以说是最传统最普遍的外泌体提取方法。
原理是：首先低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片；随后，高速离心以去除大囊泡；最后高速离心以沉淀外泌体。
具体步骤是: 以下所有步骤都在4℃下进行，1、300×g 10min，弃沉淀，去除细胞2、2000×g 20min，弃沉淀，去除死细胞3、10,000×g 30min ，弃沉淀，去除细胞碎片等亚细胞成分4、10,000×g 70min，弃上清，沉淀即为外泌体5、PBS（每10ml细胞培养液用30mlPBS重悬）清洗沉淀物，混匀， 10,000×g 70min6、l ml PBS溶解沉淀（外泌体），立即使用或置于-80℃备用。
7、一般超速离心法会结合密度梯度离心，这样得到的外泌体更纯，具体做法第4步后蔗糖梯度离心，10,000×g 70min，以去除密度大于1.21g/ml的颗粒。
优点是：成本低，操作简单，获得的囊泡数较多。
缺点是：耗时耗力（需用时8-30h，并且每次只能处理6个样本），获得的外泌体纯度不是很高，高速及重复离心也会对外泌体产生很大的伤害，并且不适用于如血浆和血清等粘性液体生物样本。
二、密度梯度离心法该方法由于比较繁琐，用的较少。
原理是：像所有的脂质小囊泡一样，外泌体可以悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围1.13g/ml-1.21g/ml，将要分离外泌体的样本液体置于梯度蔗糖介质上，随后通过离心将外泌体分离。
此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时，对离心时间极为敏感。
具体步骤是：收集培养2d的上清液。
巨噬细胞外泌体提取方法
巨噬细胞外泌体提取方法摘要：一、引言二、巨噬细胞外泌体的功能与作用三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养2.收集细胞培养液3.离心分离4.制备外泌体富集液5.纯化外泌体四、提取过程中的注意事项五、外泌体的应用领域六、总结正文：一、引言巨噬细胞外泌体（Macrophage exosomes）作为一种具有生物活性的纳米级囊泡，含有丰富的生物信息物质，如蛋白质、核酸和代谢物等。
在生物学、医学研究领域备受关注。
本文将介绍一种简便、有效的巨噬细胞外泌体提取方法，以供研究者参考。
二、巨噬细胞外泌体的功能与作用巨噬细胞外泌体具有多种生物学功能，如传递信号、调控免疫反应、参与细胞间通讯等。
此外，外泌体在疾病发生与发展过程中起着关键作用，如肿瘤发生、炎症反应和神经退行性疾病等。
因此，对巨噬细胞外泌体的研究有助于深入探讨相关疾病的发病机制，为临床诊断和治疗提供新思路。
三、巨噬细胞外泌体的提取方法1.细胞培养：选择合适的巨噬细胞株，如RAW264.7，进行体外培养。
可用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基进行传代培养。
2.收集细胞培养液：将培养皿中的细胞培养液倒入离心管中，注意避免剧烈振荡，以免破坏外泌体结构。
3.离心分离：将收集到的细胞培养液进行低速短时间离心，如300×g离心5分钟，以去除细胞碎片和其他杂质。
4.制备外泌体富集液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，再次进行高速长时间离心，如1000×g离心30分钟，使外泌体富集于上清液中。
5.纯化外泌体：采用超速离心法，如10000×g离心1小时，收集沉淀物，即为纯化的巨噬细胞外泌体。
四、提取过程中的注意事项1.细胞培养过程中要保证无菌操作，避免外源性污染。
2.离心过程中，根据实验需求选择合适的离心速度和时间。
3.制备外泌体富集液时，可采用多次离心方法，以提高外泌体富集效果。
4.纯化外泌体时，注意超速离心的条件，避免过度离心导致外泌体破裂。
外泌体提取方法
外泌体提取方法
外泌体是由细胞向体外释放的非编码RNA分子，它具有重要的生物学功能，近年来在肿瘤发生及其他重大疾病相关的研究中发挥着重要作用。
为了有效地提取外泌体，说明采用哪种提取方法及影响因素将对未来的研究有重要的意义。
提取外泌体的方法包括离心法、筛选法、化学处理法、生物技术法等。
其中，离心法是一种主要用于质量分析和纯化的技术，可将外泌体从其来源悬液中分离出来；筛选法则是使用离心法、筛选系统和膜材来分离和纯化外泌体；化学处理法则是使用特定的化学处理剂来抑制外泌体的反应；生物技术法也可以用来提取外泌体，尤其是利用病毒技术等。
尽管这几种方法都能有效提取外泌体，然而，不同的方法存在着一些不同的影响因素，例如外泌体的种类、外泌体的分布和悬液的浓度等。
首先，不同种类的外泌体有不同的体积、密度、表面电荷以及其它特征，这些特征会影响外泌体的提取效果；其次，外泌体的分布也会影响提取效果，如果外泌体的分布不均匀，可能会导致离心分离效果差；最后，悬液的浓度也会影响提取效果，如果外泌体的浓度过高，离心分离可能会受到阻碍。
此外，提取外泌体还受到装置类型、操作条件和设备性能等影响。
装置类型包括离心机、飞行时间质谱仪、活性炭吸附仪等；操作条件包括比重，旋转速度，温度和时间等；而设备性能则是指装置的容积、转子最大功率以及其它操作条件。
因此，在提取外泌体时，应综合考虑以上所述影响因素，综合运用不同的提取方法，可以更有效地提取外泌体，及时获得准确的结果。
随着人们对外泌体在肿瘤发生及其他重大疾病发病机制中的作用的
越来越深入的理解，提取外泌体的研究将具有越来越重要的意义。
外泌体提取和鉴定
外泌体提取和鉴定外泌体是一种由细胞分泌的微小囊泡，直径通常在 30 150 纳米之间。
它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。
因此，外泌体的提取和鉴定成为了生物医学研究中的关键技术。
外泌体的提取方法多种多样，常见的包括超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、沉淀法等。
超速离心法是外泌体提取的经典方法。
其基本原理是利用不同的离心速度和时间，逐步去除细胞碎片、大囊泡和其他杂质，最终获得较为纯净的外泌体。
这个过程通常需要多次离心，操作较为繁琐，且需要昂贵的超速离心机设备。
但它的优点是能够获得较高纯度的外泌体。
超滤法是基于膜孔径的大小来分离外泌体。
通过选择合适孔径的超滤膜，可以让小分子物质和溶剂通过，而将外泌体截留在膜上。
这种方法相对简单快捷，但外泌体的纯度可能不如超速离心法。
免疫亲和捕获法是利用抗体与外泌体表面特异性抗原的结合来实现分离。
这种方法具有较高的特异性和选择性，但抗体的成本较高，且可能存在非特异性结合的问题。
沉淀法是通过加入特定的试剂，如聚乙二醇（PEG），使外泌体从溶液中沉淀下来。
该方法操作简便，但获得的外泌体可能会含有较多的杂质。
在实际应用中，选择哪种提取方法取决于实验的需求和条件。
如果需要高纯度的外泌体进行深入的机制研究，超速离心法可能是较好的选择；如果是大规模的样本处理或者对纯度要求不是特别高，沉淀法或超滤法可能更为合适。
提取到外泌体之后，接下来就是鉴定。
外泌体的鉴定通常包括形态学观察、粒径分析、标志物检测等方面。
形态学观察可以通过电子显微镜技术，如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
TEM 能够清晰地显示外泌体的形态、大小和结构；SEM 则可以提供外泌体的表面特征。
通过电镜观察，可以看到外泌体呈现为具有典型双层膜结构的圆形或椭圆形小囊泡。
粒径分析常用的技术是纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）。
NTA 可以通过追踪单个颗粒的布朗运动来测量外泌体的粒径分布和浓度；DLS 则是基于散射光强度的波动来计算粒径。
外泌体提取方法总结
外泌体提取方法总结外泌体（extracellular vesicles，EVs）是一种存在于细胞外环境中的脂质包裹的小泡，具有重要的生物学功能，参与了细胞间的信息传递、信号调节以及疾病发生发展等过程。
因此，外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。
本文将总结目前常用的外泌体提取方法，并探讨其优缺点及适用范围。
1.超速离心法优点：简便快捷，适用于大样本体积。
缺点：提取物质多样性，包含有细胞碎片和蛋白质、RNA等其他成分，纯度较低。
适用范围：适用于初步提取外泌体，如外泌体的形态学研究等。
2.渗透梯度离心法渗透梯度离心法是在超速离心的基础上进一步提高外泌体纯度的方法。
该方法利用碘化金为基础的木糖密度梯度离心，根据外泌体与碘化金的密度差异，将外泌体进一步分离纯化。
优点：能够获得相对纯净的外泌体制备物。
缺点：操作复杂、耗时，不适用于大样本体积。
适用范围：适用于实验室规模的外泌体研究，如RNA测序、质谱分析等。
3.尺寸筛选法尺寸筛选法是通过纳滤膜或超滤膜的孔径来筛选外泌体。
通常使用孔径为0.1-0.22μm的滤膜将细胞碎片和大颗粒物质滤除，获得富含外泌体的滤液。
优点：操作简单方便、适用于大样本体积。
缺点：滤膜的孔径选择对于获得纯净的外泌体制备物有一定的影响。
适用范围：适用于外泌体的初步筛选和快速提取，如外泌体的蛋白质组学研究等。
4.免疫磁珠法免疫磁珠法是利用磁珠表面特异性抗体与外泌体上特定标志物结合，然后通过磁场将目标物质与杂质分离。
该方法可以选择性地提取特定表面标记的外泌体亚群。
优点：高选择性、高灵敏度，适用于特定外泌体的纯化。
缺点：操作相对复杂，适用于实验室规模的外泌体研究。
适用范围：适用于特定外泌体亚群的纯化和研究，如肿瘤相关外泌体的分离等。
总结起来，外泌体的提取方法各有优缺点，在选择时需要根据实验目的和样本特点进行综合考虑。
超速离心法和渗透梯度离心法适合初步提取外泌体，尺寸筛选法适合快速提取外泌体，免疫磁珠法适合提取特定亚群的外泌体。
外泌体分离方法
外泌体分离方法
外泌体是一种细胞外释放的小型膜泡，它们携带着细胞内部的蛋白质、核酸和脂质等生物分子，具有多种生物学功能。
在外泌体的研究中，分离和纯化外泌体是一个至关重要的步骤。
以下是一些常见的外泌体分离方法：
1.超速离心法：超速离心是最常用的外泌体分离方法之一。
在离心过程中，通
过多轮逐渐增加转速来沉淀外泌体，接着可以通过洗涤、纯化、再超速离心等步骤来进一步处理并纯化外泌体。
2.密度梯度离心法：密度梯度离心是另一种常用的外泌体分离方法。
通过制备
密度梯度离心液，将外泌体样品加入后进行离心操作，外泌体会随着密度梯度上浮在不同密度的离心液层中，根据分层可以得到纯化的外泌体。
3.尺寸排除色谱法：尺寸排除色谱是基于外泌体尺寸不同于其他细胞外囊泡的
原理而设计的纯化方法。
样品通过尺寸排除柱时，大于一定尺寸的细胞外突起和小于该范围的游离蛋白等被裂解产生的物质会顺着柱体流出，而外泌体则会通过柱子被保留。
该方法具有分离高效、可以同时分离不同种类的外泌体等优点。
4.免疫亲和法：利用特异性抗体驯化对外泌体的靶腐运动来分离纯化外泌体。
一般来说，在研究特定蛋白的外泌泡时使用较为常见。
各种分离方法之间有其各自的优点和限制，不同研究对需要的外泌体纯度、样品量、分析方法等可能都会有所不同，因此需要根据具体研究需求选择适合的外泌体分离方法。
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1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取
上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小
时而不进行抗凝。
此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。
接着将血清以3,000×g离心10分钟。
将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。
将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、
为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。
血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。
在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。
该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。
材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机
50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1）
注意：所有离心均应在4℃下进行。
1.用等体积的PBS稀释液体。
将稀释的液体转移到50毫升管中。
在2,000×g，4℃下离心30分钟。
2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。
在12,000×g，4℃下离心45分钟。
3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。
在110,000×g，4℃下离心2小时。
4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。
用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。
5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。
6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。
倒出上清液。
7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。
在110,000×g，4℃下离心70分钟。
倒出上清液。
8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。
在-80℃下储存长达1年。