一步法RT-PCR试剂盒使用说明书
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
TaKaRa一步法RT-PCR提取法
0.5 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ
0.5 μl
PCR Forward Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
TaqMan® Probe
1 μl*2
Total RNA
2 μl*3
独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 3. One Step RT-PCR Buffer III 是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，操作简单，能有效避免污染。
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。 1） 当同时需要进行数次 Real Time One Step RT-PCR 反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master
1一步法荧光定量反转录PCR试剂盒
注意事项：
●当同时需要进行数次Real Time One Step qRT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液（M aster M ix；其中 包括RNase-free ddH2O、Buffer、各种酶等），然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂体积更准确， 减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。 ●使用Enzyme M ix和TRUEscript RTase时，分取之前要小心地瞬间离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含 有高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。 ●2×qRT-PCR M ix内含Sybr Green I，保存或配制One Step qRT-PCR反应液时应避免强光照射。 ●为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板。 ●不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。 ●只能使用特异性引物，不能使用 Oligo(dT) 和 Random Primer 进行反应。
TUREscript One Step qRT-PCR Kit
包 装 量：
目录编号 154101 154102
包装单位 25次 50次
使用说明书
组成
2×qRT-PCR M ix(Contains Sybr Green) Enzyme M ix (Contains HotM aster DNA Polymerase and RNasin) TRUEscript RTase
反应体系（50 μl）：
注意：2×qRT-PCR Buffer 低温时可能有结晶析出，应手心加热或者涡旋振荡恢复融解后使用。短期使用可放 4℃ 冰箱。
One Step RT-PCR Kit
One Step RT-PCR Kit货号：T2240规格：50T/200T（25μl体系为例）保存：-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。
产品内容：25×One Step RT-PCR RTase mix5×One Step RT-PCR Buffer产品介绍：One Step RT-PCR Kit是一步法（One Step）RT-PCR反应的专用试剂，反应过程在同一管内连续进行，避免开管，能有效防止污染。
本品含有高温反转录酶（RNase H-）和新型热启动酶，采用优化配方的专用Buffer，具有更高的反转录和PCR扩增效率，适合于低浓度RNA模板的高灵敏度扩增。
试剂原理：One Step RT-PCR Kit首先采用反转录酶以RNA为模板合成cDNA，然后再以合成的cDNA为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩增得到大量DNA片段，扩增得到的目的产物3’末端含有一个A碱基，可直接用于T/A克隆。
反应条件：反转录：50℃20分钟；变性：95℃3分钟；变性：95℃10~20秒；退火：56-64℃10~30秒；35~50个循环延伸：72℃10~60秒。
保温：72℃5min第1页，共2页RT PCR反应体系配制：试剂25μl体系50μl体系终浓度25×One Step RT-PCR RTase mix121×5×One Step RT-PCR Buffer5101×Primer1（10μM）0.5-2.5μl1-5μl0.2~1.0μMPrimer2（10μM）0.5-2.5μl1-5μl0.2~1.0μMRNA---ddHO---2Total volume25μl50μl1.通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。
反应性能较差时，可以在0.1～1.0μM范围内调整引物浓度；2.不同种类的模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的模板添加量。
东盛生物 RT-PCR Kit（逆转录试剂盒） 说明书
0.6 μl RNasin , M-MLV ； 按下列条件进行反转录反应 42℃ 温浴 60 min（随即引物 37℃ 温浴 60 min） ； 5 终止反应 70℃ 温浴 5 min 终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃ 保存。 6 用 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50 μl ，取 2-5 μl 进行 PCR 扩增反应。
20 次逆转录反应，R1012 可进行 100 次逆转
录反应（20 μl 标准 PCR 反应体系，每次使用 M-MLV 1 μl）。
M-MLV 储存液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 200 mM NaCl 0.1 mM EDTA 1 mபைடு நூலகம் DTT 0.01% NP-40 50% glycerol 5xfirst-strand buffer 成分 250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃) 375 mM KCl 15 mM MgCl2 50 mM DTT 保存条件 各组分均-20℃保存，避免反复冻融。
●
在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNase 抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲
液和还原剂（如 DTT）存在的条件下加入，因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A，B，C 对 RNA 的降解，并不能防止皮肤上的 RNase，因此尽管使用了这些抑 制剂，也要小心不要从手指上引入 RNase。
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------广州东盛生物科技有限公司 电话：020-87791356 传真：020-87791381 网址：
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
一步法 RT-PCR 说明书
一步法RT-PCR使用说明书本试剂盒适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR 检测，反转录PCR反应体系为50µl，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书。
规格：10次试剂盒组成：名称浓度体积dNTPs10 mM50µl5×反应缓冲液100µlAMV反转录酶5u/µl20µlTaq DNA聚合酶5u/µl20µlDEPC-ddH2O 1.5mlRNasin 40u/µl 20µl实验操作:1．取103-106拷贝的特异目的模板或1pg-5µg的总RNA于一支0.2或0.5ml离心管中，65-70℃保温5-10分钟，离心数秒，放置冰浴中。
2．按照指定的体积将DEPC-ddH2O，5x 反应缓冲液，dNTPs，特异上下游引物及25mM MgSO4加入到置于冰上的0.5ml薄壁反应管中，配制成反应混合物。
反复吹吸使混合物中各组分混合均匀。
然后向反应体系中加入AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶和RNasin。
将反应管轻柔震荡10秒以使该混合物混匀。
如需要做多个样品的RT-PCR反应，则应在冰上先配制一总的混合物，该混合物由反应体系中各组分按其指定体积的适当倍数组成，然后取该总混合物48µl加入到每一反应管中。
向各反应管中加入模板以启动反应。
每次加样均应使用单独的加样器枪头，小心勿使样品之间相互污染。
体积终浓度DEPC-ddH2O（加至终体积为50µl）Xµl5× 反应缓冲液10µl 1×dNTP混合物（每dNTP 10mM）1µl 0.2mM下游引物* 50pmol 1µM上游引物* 50pmol 1µM25mM MgCL2 2µl1mM AMV反转录酶（5U/µl）1µl 0.1U/µlTaq DNA聚合酶（5U/µl）1µl 0.1U/µlRNasinRNA样品或对照** Yµl终体积50µl* 计算引物为50pmol时所对应的质量（纳克）的通用公式为：50pmol=16.3ng×b；b为引物碱基数目。
一步法RT-PCR说明书
一步法RT-PCR说明书
TaKaRa PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit Ver.2
试剂盒使用说明书
该试剂盒采用一步（One step）RT-PCR法。
RNA→cDNA →PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂。
实验操作
1.配制RT-PCR反应液，以n个反应管为例。
首先，配制如下混合体系，混匀后分加到n个PCR反应管中。
RNase Free dH2O 20μI X (n+1)
2x1 Step Buffer 25μI X (n+1)
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μI X (n+1)
其次，向PCR反应管中加入欲检测病原的扩增引物（即上下游引物）和样品抽提RNA。
上游引物1μI
下游引物1μI
样品RNA 1μI
总体系：50 μI
2．进行RT-PCR反应
50℃30 min
94℃ 2 min
94℃30 sec
50～65℃（以相应的引物而定） 30 sec 30 循环72℃ 1 min
72℃ 10 min
试剂盒自带有确保试剂有效性的阳性对照RNA以及相应的扩增引物（Positive Control RNA, Control F-1 Primer, Control R-1 Primer）,扩增产物为462bp。
扩增后如果试剂盒阳性对照电泳结果为阳性说明试剂盒所有试剂有效，RT-PCR反应液体系没问题。
BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书（一步法）
b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。
**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。
Control引物退火温度为55℃。
*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。
**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。
Control引物延伸时间45s。
c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。
使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。
猪乙型脑炎病毒病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书
猪乙型脑炎病毒病一步法RT-PCR 诊断试剂盒说明书[注意] 用前请认真阅读注意事项。
[用途] 用于猪乙型脑炎病毒病的检测、诊断和流行病学调查。
[试剂][操作步骤]1. RNA 提取(1)取疑似猪乙型脑炎病毒病的病料（脑、肺脏、脾脏等）1~4g 于无菌研钵，研磨并用 Hanks 液（pH7.2~7.4）稀释成 1：4 乳剂，分装 1.5ml 灭菌EP 管，反复冻融 2~3 次，8000r/min 离心5 分钟。
(2)取300ul 上清液，移入新的 1.5ml 灭菌EP 管中，加入 600ul SR-I，反复颠倒几次混匀，室温放置 5~10 分钟.。
(3)加入 180ul 氯仿，漩涡振荡 15 秒混匀。
室温下放置 2~3 分钟。
(4)12000r/min 离心10 分钟，取 450ul 上层水相，转移到一个新的 EP 管中，再加入 500ul 异丙醇混匀，室温放置 10 分钟。
(5)12000r/min 离心10 分钟，弃去上清，加入SR-II 700ul，充分洗涤沉淀 RNA 后，12000r/min 离心 5 分钟，小心吸去上清（注意：严格防止 RNA 丢失）。
(6)室温晾干或到置于超净工作台内风干，15-30 分钟。
用 30ul TU-9 溶解（难于溶解时，可56℃水浴 15 分钟），即为模板，即用或-70℃冻存备用。
2.One-Step RT- PCR 加样体系TU-1 5ulTU-2 4ulTU-3 8ul1ul（现用现取，用完后立TU-4 TU-5 TU-6即放回） 1ul（现用现取，用完后立即放回） 1ul（现用现取，用完后立即放回）3.反应程序:4.电泳：TU-7 1ulTU-8 1ulTU-9 15ul模板13ul50℃45min94℃预变性5min94℃变性60s55℃退火60s 30 个循环72℃延伸60s72℃延伸10min称量 0.25g 琼脂糖，放入锥形瓶，加入 25ml 1×TAE 液（可配置 50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入 1.5ul 的TU-12 混匀。
一步法RT-PCR试剂盒
时间
50
30 分钟
95
2 分钟
95
30 秒
Tm 用户设定温度（50－62）
1 分钟
70
1 分钟至 4 分钟（注意事项 9）
70
5 分钟
1． PCR 产物置于－20℃冰箱里保存，直到进行任何后续实验
2． 进行琼脂糖凝胶电泳分析
循环 1 1
35 至 40
1
注意事项
1． 本产品为 20 次操作 2． 整个操作须在 4℃状态下进行 3． 避免反复冻融 4． 整个操作须带手套，建议使用滤芯枪头，并格外小心，防止降解 RNA 5． 建议所有的操作用品属于 RNA 专用 6． 根据用户 PCR 仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil） 7． 根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)公式确定 Tm 温度；建议使用分析软件 8． 建议使用完整 RNA 片段，避免基因组 DNA 污染 9． 根据扩增片段的长度，调整 PCR 延长时间 1 分钟至 4 分钟：3kb－2 分钟；6kb－4 分钟 10．本公司提供系列 RT－PCR 产品
逆转录 PCR 一步法（RT－PCR）试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
逆转录PCR一步法（RT－PCR）试剂是一种旨在通过逆转录酶（reverse transcriptase）和Tag 多聚 酶（polymerase）的融合作用直接把RNA逆转录成cDNA后，直接完成扩增，进行分析RNA构造的权威而经典 的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的，融合了世界上最优势的技术元素。其适 用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表达等。尤其可用于低拷贝量的RNA样品。产品即到即用，性能稳定，严格无 核酶污染，操作极为简便，敏感性强，逆转录效率和扩增产量皆高，重复性好。
SYBR一步法荧光定量PCR试剂盒使用说明书
一步法实时RTPCR 检测试剂盒（SYBR 一步法荧光定量PCR 试剂盒）(目录号HS0614)产品包装保存条件-20℃避光保存。
产品简介本产品是一步法Real-Time qRT-PCR 专用试剂盒。
所含的SYBR Green I 荧光染料可以与所有的双链DNA 相结合，使该产品可以用于多种不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。
使用本产品进行Real Time qRT-PCR 反应，逆转录和定量PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。
本试剂盒中包含全新高效逆转录酶，具有与RNA 高亲和性的特点，能通读GC 含量高、二级结构复杂的RNA 模板；所包含的经化学修饰的热启动DNA 聚合酶最大限度的减少PCR 扩增全程中的非特异性扩增产物的产生，极大提高了荧光定量PCR 反应的精确性；所包含的缓冲系统使以上两种酶同时发挥最大的功效，提高效率。
所含的ROX 染料调节PCR 反应过程中管与管之间的加样误差，适用于以ROX 作为校正染料的所有荧光定量PCR 仪。
北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 反转录和PCR在一个反应管中完成，方便快捷，最大限度的避免污染。
2. 与RNA具有高亲和性，能通读GC含量高、二级结构复杂的RNA模板。
3. 热启动酶有效抑制非特异性扩增，极大提高了荧光定量PCR反应的精确性。
产品应用基因表达分析；拷贝数分析。
使用方法1. 将RNA 模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffe（r With ROX）、SuperEnzyme Mix 和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2. PCR 反应体系：•注意：通常引物浓度以0.2 uM可以得到较好结果，可以终浓度0.1 ~ 0.5 uM作为设定范围的参考。
RT-PCR试剂盒说明书
RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:0Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD版本号：KR121221TIANScript RT KitTIANScript cDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104产品内容：储存条件：-20℃保存。
产品介绍：TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA 合成第一链cDNA。
与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA片段等。
产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。
注意事项：1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2. RNA样品要避免基因组DNA污染。
3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5. cDNA产物应置于-20℃保存。
操作步骤：1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA；2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；2 μl Super Pure dNTPs mM each);补RNase-Free ddH2O定容至μl。
2. 70℃加热5min后迅速在冰上冷却 2 min。
简短离心收集反应液后加入以下各组分：4 μl 5×First-Strand Buffer (含有DTT)；μl RNasin。
一步法
凯基一步法RT-PCR试剂盒（AMV）For Research Use OnlyStore at -20℃for one year一、试剂盒说明RT-PCR反应就是从RNA反转录至cDNA，然后通过PCR反应扩增cDNA 的过程。
凯基一步法RT-PCR（AMV）试剂盒采用了一步反应法完成整个RT-PCR 反应，即RNA－cDNA－PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应过程中不需增加额外的步骤，就可完成整个RT-PCR反应。
本试剂盒具有方便、简捷、灵敏度高、重复性好的特点，可适用于各种动、植物、病毒RNA的PCR检测。
二、试剂盒组份三、操作步骤1．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2．取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入3. 轻轻混匀，2000rpm离心20s后进行RT-PCR反应；RT反应条件：42℃保温1 hrPCR扩增条件：94°C，5 min；94°C变性，30 sec；45～65°C退火，45s；72°C延伸，1 min；25～35个循环；72°C，10 min，4．反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
四、备注1．用户可根据自己的情况调整优化PCR反应扩增参数：·退火温度：可根据实际情况适当地提高或降低退火温度(50℃～65℃)。
·延伸时间：延伸时间因目的序列长度的不同而不同·循环次数：cDNA量较少时，循环次数可增加为40～50次·调整镁离子的浓度2．用户可根据本试剂盒提供的β-actin引物（阳性对照）验证RT-PCR体系是否良好（选做）：1．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2．取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入3．轻轻混匀，2000rpm离心20s后进行RT-PCR反应；RT反应条件：42℃保温1 hrPCR扩增条件：94°C，5 min；94°C变性，30 sec；54°C退火，45s；72°C延伸，1 min；33个循环；72°C，10 min，4．反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认β-actin基因目的产物片断为359bp。
5×One Step RT Mix使用说明
增得到大量DNA片段，扩增得到的目的产物3’末端含有一个A碱基，可直接用于T/A克隆。
反应条件：
反转录：50℃ 20 分钟；
变 性：95℃ 3 分钟；
变 性：95℃ 10~20 秒； 退 火: 5 伸：72℃ 10~60 秒。
保 温：72℃ 5min
的模板添加量。
产物检测：
反应结束后取 5 µl 反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。
质量控制：
1、 功能检测：RT PCR 的敏感性、特异性、可重复性；
2、 无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染。
技术说明：
1、 该体系常用 50℃进行反转录反应，可以在 45℃~60℃范围内进行反转录温度优化； 根据反应特征不同，可以在 10~30 分钟内对反转录时间进行优化； 2、 该体系所用的反转录酶是在 MMLV 基础上进行了基因改造，去除了 RNaseH 活性，使 其具有更高的温度耐受性和反转录温度，对 RNA 复杂结构模板具有更高的反转录效率； 3、 该体系具有更好的体系稳定性和适用性，非常适合于病毒、组织等样本提取 RNA 复杂模板的检测。
启动酶，采用优化配方的专用 Buffer，具有更高的反转录和 PCR 扩增效率，适合于低浓度
RNA 模板的高灵敏度扩增。
试剂原理：
One Step RT Premix 首先采用反转录酶以RNA为模板合成 cDNA，然后再以合成的cDNA
为模板，经过PCR扩增反应的热变性、引物退火、链延伸三个步骤循环往复，在短时间内扩
5×One Step RT Mix 使用说明
货号：T2240
规格：50T
保存：-20℃保存长期保存，使用前应混匀，避免反复冻融。
产品内容：
RT-PCR试剂盒说明书
R T-P C R试剂盒说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1RT-PCR试剂盒说明书公司：TIANGENOrder:0Toll-free:800-990-6057/400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD版本号：KR121221TIANScript RT KitTIANScript cDNA第一链合成试剂盒目录号：KR104储存条件：-20℃保存。
产品介绍：TIANScript RT Kit（cDNA第一链合成试剂盒）是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的，具有高灵敏度的RT-PCR反应系统，可以从极低量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。
与PCR反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA 片段等。
产品特点：合理配备了与cDNA第一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒中的TIANScript M-MLV具有高效的逆转录酶活性，对后续的PCR或定量PCR实验兼容性好，适合于各种PCR耐热聚合酶。
注意事项：1. 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽量可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。
有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2. RNA样品要避免基因组DNA污染。
3. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。
4. 试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5. cDNA产物应置于-20℃保存。
操作步骤：1. 在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-5 μg总RNA或50-500 ng mRNA；2 μl oligo (dT)15或2 μl Random或2 pmol基因特异引物；2 μl Super Pure dNTPs mM each);补RNase-Free ddH2O定容至μl。
一步法RT-PCR试剂盒
一步法RT-PCR试剂盒操作方法在0.2ml或0.5ml薄壁管中加入下列成份：总RNA 0.5~1µgUpper primer 10~30pmoleLower primer 10~30pmole10×RT-PCR Buffer 2µldNTP Mixture（10 mM each）1µlAMV Reverse Transcriptase 5UTaq polymerase 5URNasin 10UDEPC- treated water up to 20µl轻轻混匀，短暂离心。
45℃温育30~45min，95℃ 5min终止反应。
进入以下30个循环：94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 1~3min。
最后72℃延伸7min。
扩增完毕取5~10µl电泳。
注意事项1、确保RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8~2.0，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1，否则，表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。
进行cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液必须完全无菌。
操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。
3、使用AMV、RNasin和Taq polymerase等酶类时，应轻轻混匀尽量避免起泡；分取之前短暂离心，缓慢吸取。
酶类制品在实验前才从-20℃中取出，使用完毕立即放回-20℃中保存。
常见问题及参考意见1、cDNA产量很低，为什么？可能的原因：(1)RNA模板质量低；(2)对mRNA浓度估计过高；(3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；(4)反应体积过大，一般不应超过50µl。
2、合成不了长链的cDNA，为什么？(1) RNA降解。
THERMOscript one step_RT_kit使用说明书
PCR 扩增：
1. 将配制好的反应体系混匀、离心后。 2. 将热循环仪预热到 50C，将 PCR 管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应。 扩增程序： 温度 1 2 50C 94C 94C 3 50-60C 72C 4 5 72C 4C 时间 30 分钟 2-3 分钟 30 秒 30 秒 1-2kb/分钟 5-10 分钟 保温 1 30-40 循环数 1 1
注意：可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加， 非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
注意事项：
●避免RNase污染。 ●为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板 ●不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。 ●不能使用 Oligo(dT) 和 Random Primer 合成 cDNA。
THERMOscript One Step RT-PCR Kit 使 用 说 明 书
包 装 量：
目录编号 HXP4501 HXP4502 包装单位 50次 X50μl 100次 X50μl 组成 2 XRT-PCR Mix THERMOscript OneStep Enzyme Mix RNase free H2O HXP4501 HXP4502 625 μl 50 μl 1.5 ml 1.25ml 100 μl 1.5 ml
适用范围：适用于高拷贝、低拷贝基因检测；部分高 GC 含量或具有复杂二ห้องสมุดไป่ตู้结构的 RNA 模板。 建议反应体系（20 μl-50μl） ：
注意：2 XRT-PCR Mix 使用前充分融解颠倒混匀（避免剧烈涡旋产生大量气泡）。短期频繁使用可放 4C 冰 箱。 根据下表冰上配制反应液： Components 2×RT-PCR Mix Forward Primer（10μm） Reverse Primer（10μm） THERMOscript Enzyme Mix RNA template RNase free H2O to final volume Volume 10 μl 0.4 μl 0.4 μl 0.8 μl X μl 20 μl Final Concentration 1X 0.2 μM 0.2 μM 1 pg-1μg Not applicable
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一步法RT-PCR 检测试剂盒 (一步法RT-PCR 扩增试剂盒)
(目录号HS0612-2)
产品包装
保存条件
-20℃
产品简介
本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。
经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H 活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA 。
该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。
SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA 。
PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。
独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。
使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A ″碱基，可直接用于T/A 克隆。
北京厚生博泰科技有限公司
Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.
产品特点
1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2. 耐热性及稳定性强。
3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。
4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。
使用方法
1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。
所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
5. 反应结束后取5 ul反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。